방법 논문

생물 검정 기반 분류를 사용 하 여 바다 심고 페로몬의 식별

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⸱

DOI:

10.3791/58059

⸱

2018년 7월 17일

 ,  , 
1Department of Fisheries and Wildlife, Michigan State University

이 논문에서

요약

여기, 선물이 분리 하 고 특성 구조, 후 각 힘, 및 바다 lampreys의 상 상속 페로몬 화합물의 행동 응답 프로토콜.

초록

검정 안내 분별 분리와 활성 페로몬 화합물의 식별 가이드 생리 및 행동 생물 검정의 결과 사용 하는 반복적인 접근 방식을입니다. 이 방법은 다양 한 동물 종에에서 페로몬으로 그 기능 화학 신호의 성공적인 특성에 결과 있다. 바다 lampreys 행동 또는 생리 적인 응답을 중재 하는 페로몬을 감지 하는 후각이에 의존 합니다. 우리 상 상속 페로몬의 기능을 멋 부리 다 하 고 절연 및 활성 페로몬 구성 요소 식별 가이드 물고기 생물학의이 지식을 사용 합니다. 크로마토그래피는 추출, 집중, 바른된 물에서 화합물을 분리 하는 데 사용 됩니다. 전기-olfactogram (EOG) 녹음 어떤 분수 유도 후 각 응답을 결정 하기 위해 수행 됩니다. 2 선택 미로 행동 분석 다음 경우 향기가 있는 분수의 또한 행동 활성화 되며 특혜를 유도 결정 하는 데 사용 됩니다. Spectrometric 및 광 메서드는 분자량 및 구조 설명 지원 구조 정보를 제공 합니다. 순수한 화합물의 bioactivity EOG 및 행동 분석 실험으로 확인 된다. 미로에서 관찰 된 행동 응답 궁극적으로 자연 스트림 환경에서 그들의 기능을 확인 하는 필드에에서 확인 되어야 합니다. 이러한 생물 검정 1) 분류 과정을 안내 하 고 2) 확인을 이중 역할 추가 격리 된 구성 요소 bioactivity를 정의 하 고. 여기, 우리는 검정 기반 분류 방식의 유틸리티를 예증 해 심고 페로몬 식별의 대표적인 결과 보고 합니다. 식별 해 심고 페로몬의 페로몬 통신 시스템의 변조 침략 바다 심고 Laurentian 오대호에서 제어 하는 것으로 간주 하는 옵션 중 하나입니다 있기 때문에 특히 중요 하다. 이 메서드는 taxa의 광범위 한 배열에서 화학 커뮤니케이션 특성 및 waterborne 화학 생태학에 쉽게 적응 될 수 있다.

서론

페로몬은 특정 화학 신호 음식 소스를 찾는, 포식 자 감지 conspecifics1의 사회적 상호 작용을 중재에 그들을 원조 하는 개인에 의해 발표. 곤충에 페로몬 통신이 되었습니다 잘 공부2; 그러나, 화학 물질 식별 및 수생 척추 동물 페로몬의 생물 학적 기능 하지 되었습니다 공부 했다으로 광범위 하 게. 정체성의 지식과 발표 페로몬의 기능 위협된 종3,4 또는 제어 해충 종5,6의 복구를 촉진 하기 위하여 적용할 수 있습니다. 이러한 기술의 응용 프로그램 격리 및 생리 활성 페로몬 구성 요소 특성화를 필요로합니다.

페로몬 식별 천연 제품 화학의 지점 이다. 페로몬 연구에 진행 부분적으로 페로몬 분자 자체의 특성으로 인해 제한 되었습니다. 페로몬은 종종 불안정 하 고 소량, 출시 그리고 몇 가지 샘플링 기술을 분 양의 휘발성7,8 또는 수용 성 화합물9를 감지 하 존재. 페로몬을 식별 하는 방법 1) 알려진된 화합물, 2) 대사체학, 및 3) 검정 안내 분별의 대상된 심사를 포함 합니다. 알려진된 화합물의 대상된 심사 페로몬 기능을 가상 하는 생리 적 프로세스의 상용 대사 부산물을 테스트 합니다. 연구원은 알려진 및 사용 가능한 화합물 테스트할 수 있기 때문에이 접근은 제한 하 고 있다. 그러나, 그것은 결과가 금붕어에 성 호르몬의 성공적인 식별 기능을 페로몬10,,1112. 대사체학은 생물 학적 시스템13내에서 잠재적인 작은 분자 대사 제품을 구별 하는 두 번째 페로몬 식별 접근 이다. 두 그룹 (즉,는 활성 및 비활성 추출 물)의 신진 대사 프로필의 비교 수는 잠재적인 신진 대사 프로필의 식별 하는 대사 산물은 정화에서 구조는 해명, 그리고 bioactivity는 확인 된14. 특정 혼합물의 복잡 한 공식의 첨가제 또는 시너지 효과 대사체학 metabolites 분수13의 시리즈로이 아닌 함께 간주 됩니다 때문에 발견 될 더 높습니다. 그러나, 대사체학의 구현 결과 데이터 소설 구조의 설명을 촉진 하지 않습니다 때문에 합성 참조의 가용성에 의존 합니다.

검정 안내 분별은 두 분야에 걸쳐 통합, 반복 접근: 화학 및 생물학. 이 방법은 생리 및 행동 생물 검정의 결과 사용 하 여 격리 및 활성 페로몬 화합물의 식별 가이드. 원유 추출 화학 속성 (즉, 분자 크기, 극성, 등)에 의해 분류 한 이며 전기-olfactogram (EOG) 녹음 및는 생물 검정에 테스트. 생리 활성 구성 요소 분류 및 EOGs 생물 검정의이 단계를 반복 하 여 밖으로 상영 됩니다. 순수한 활성 화합물의 구조는 분자량 및 합성 화합물의 템플릿을 생산 구조 정보 제공 spectrometric 및 분 광 방법으로 해명. 생물 검정 기반 분류 다양 한 대사와 생 합성 경로에서 예측 될 것 하지 않은 독특한 화학 뼈대와 잠재적으로 소설 페로몬을 얻을 수 있습니다.

여기, 우리는 분리 남성 바다 심고 섹스 페로몬 화합물의 bioactivity 특성을 사용 하는 검정 기반 분류 프로토콜을 설명 합니다. 바다 심고 (Petromyzon 리누스)이이 물고기는 그들의 anadromous 생활사는 3 단계로 구성 된 중재 화학 신호의 후 각 탐지에 크게 의존 하기 때문에 페로몬 커뮤니케이션을 공부 하는 이상적인 척추 모델은: 애벌레, 청소년, 그리고 성인입니다. 바다 심고 애벌레 민물 스트림 앙금으로 뚫으, 과감 한 변 태를 받아야 하 고 호수 또는 바다 어디 그들은 큰 호스트 물고기 parasitize 이주 청소년으로 변환. 호스트 물고기에서 분리 후 성인 마이그레이션할 다시 산란 스트림, 스트림 상주 애벌레15,,1617,18,19 발표 철새 페로몬에 의해 유도 . 성숙한 남성 산란 지상에 승천, 동료를 유치, 약 일주일 동안 간헐적으로 산란 다음 죽을15,20을 다 성분 섹스 페로몬을 릴리스 합니다. 식별 해 심고 페로몬의 페로몬 통신 시스템의 변조 Laurentian 오대호21에서 침략 적 바다 lampreys 제어 하는 것으로 간주 하는 옵션 중 하나입니다 있기 때문에 중요 하다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 미시간 주립 대학교 (안녕히 # 03/14-054-00, 02/17-031-00)에 의해 승인 되었습니다.

1. 수집 및 바다 심고의 추출 물 조절

  1. 성적으로 화난된 휴런 호수 물 16-18 ° c.에 유지의 250 L와 함께 제공 된 탱크에서 남성 바다 lampreys (15-30 동물)을 성숙 하는 장소
  2. 6 월에서 7 월 각 밤 내내 남성 단련 물을 수집 합니다.
    참고: 바다 lampreys 산란 후 자연스럽 게 죽는다. 물고기의 인생에서이 시점에 근접, 신선한 성숙한 남성으로 교체.
  3. 단단한 단계 적 출에 의해 조건된 물을 추출 합니다.
    1. 열에 로드 하기 전에 4 h에 대 한 메탄올에 수 지를 담근 다. 수 지는 열에 로드 한 다음 유기 용 매를 제거 하는 열을 통해 물 10 L 펌프.
    2. 열의 위쪽에 펌핑 시스템을 통해 물고기 잡고 탱크에서 조절된 물을 전달 합니다. 온건 하 게 극 지 고분자 이온 교환 수 지 (예:., Amberlite: XAD 7 HP 수 지), 4의 시리즈에 포함 된 2 kg의 침대를 통과 하는 물 2.5 L 용량 유리 열. 400와 600 mL/6 분 5 l 아세톤의 바로 뒤에 메탄올의 10 l metabolites Elute 사이의 부하 속도 유지 합니다.
      주의:이 단계에서는 메탄올과 아세톤 사용합니다. 둘 다는 가연성 및 독성입니다.
      참고: 풀링된 잔여-80 ° c 더 처리 될 때까지 저장할 수 있습니다.
  4. 물 (약 10l)로 세척 하 여 농축의 1 주 후 열을 다시 활성화.
  5. 유기 용 매 (물과 메탄올의 혼합물)을 제거 하 고 압력 감소 (아래 300 mbar) 40 ° c.에 5 h와 증발에 의해 추출 물 수확 건조까지-20 ° C에서 48 h에 대 한 동결 건조 기 동결은 여 물 찌 꺼 기를 집중.

2입니다. 크로마토그래피와 분수 풀의 격리

  1. 유리의 열 용 매 (중지)와 젤 30 분 전송에 대 한 모바일 초기 단계에서 실리 카 젤 (230-400 메쉬)을 담가. 모바일 단계를 통해 갈 수 있도록 열의 밸브를 엽니다. 침전 실리 카 젤 침대를 형성을 실리 카 젤 허용.
  2. 철저 하 게 실리 카 젤 (70-230 메쉬) 추출 물을 혼합 하 고 실리 카 젤 침대 위에 액체 착 색 인쇄기 열에 그들을 로드. 95% CHCl3 (클로 프롬)에서 그라데이션으로 elute / MeOH (메탄올) 100 %MeOH, 전체 볼륨에서 2.5 L. Eluent 개별 튜브 (각 10 ml)에 수집 합니다.
    주의:이 단계에서 사용 하는 클로 프롬은 유독한 시 약.
  3. 합동은 eluents의 20 조각으로 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 분석에 의해 안내.
    1. 출발선에 샘플을 적용 하 고 봉인 된 유리에서 개발 용 (선택 극성 CHCl3 의 비율에 의해 메탄올 100-0%에서)에 접시의 출발선을 immersing 하 여 미리 코팅된 실리 카 젤 접시에 TLC 실험을 수행 탱크입니다.
    2. 확인 모든 TLC 명소 보존 인자 (Rf) 0.3에서 배열 하는 용 매 개발의 비율 선택-0.8.
    3. 개발 용 매에는 줄 끝에 도달 하면, 탱크, 접시를 꺼내 고 증발 하는 용 매에 대 일 분을 기다립니다.
    4. 254 nm와 다음 얼룩에 자외선 아래 관광 명소를 먼저 시각화 크로마토그래피 분무기에 의해 5 %anisaldehyde (20 μ)의 산 성 메탄올 솔루션으로 그들을 살포 하 고 3 분 85 ° C에서 난방에 의해 그들.
      참고: TLC 판에 다채로운 관광 명소는 분수에서 주요 구성 요소를 나타냅니다.
    5. 별색 및 주요 부품의 Rf 유사성에 따라 20 분수 eluent 결합.
  4. 약 30 분 동안 40 ° C에서 감압 (300 mbar의 속성에 따르면)에서 회전 증발 하 여 잔류물에 분수를 집중.

3. 전기-olfactogram (EOG) 녹음 향기가 있는 분수/화합물을 식별 하

  1. 붕 규 산 유리 모 세관을 당겨 (외경: 1.5 m m, 내경: 0.86 m m, 길이: 100 m m)는 micropipette 히터 수준으로 끌어당기는 65로 설정.
  2. 다이아몬드로 만들어진 유리 커터와 모 세관의 끝에 개통 점수 잘라내어 0.9% 식 염 수에 녹은 0.4 %agar 그것을 채우십시오. 모 세관의 끝에 여는 직경에서 약 10 µ m 이어야 한다.
  3. 채우기 단계 3.1-3.2 및 고체 전극 홀더에서 가져온된 모 세관 전극 중 3 m KCl는 micropipette를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) Ag/AgCl 펠 릿으로 조작.
    참고: 모든 공기 방울이 모 세관 또는 전극 홀더를 분리 하십시오.
  4. 가져온된 전극 전극 홀더에 삽입 합니다.
  5. 준비 하는 10-5 M의 100 mL 부피 플라스 크에 이온된 수 (4 ° C에 저장)에서 10-2 M L-아르기닌 재고 솔루션에서 숯 필터링 물에서 L-아르기닌. 10-5 M의 20 mL 전송 유리 유리병에 L-아르기닌.
  6. 농도-응답 곡선에 대 한 유리 튜브에 2.3 단계에서 분수 수영장의 10 희석의 10 mL를 준비 합니다. 매일 실험 전에 신선한 희석을 준비 하 고 하루에 내에서 그들을 사용 하 여. 온도 8 ° c.에 equilibrate를 수 있도록 반복 물 욕조에 L-아르기닌과 분수 풀 희석 작업 솔루션의 유리 튜브를 넣어
  7. Anesthetize 3 aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (MS222; 100 mg/L)을 심고 하 고 멸 균 주사기와 gallamine triethiodide (0.9% 식 염 수에 몸 무게의 3 mg/kg)의 근육 주사로 무력화.
    참고: 마 취의 충분 한 깊이 아니 길 모션, 직 립 자세를 유지 하는 무 능력 및 그것의 구두 디스크를 사용 하 여 탱크의 측면에 없는 흡입을 관찰 하 여 결정 됩니다. 전에, 수술 중 어떤 미생물 오염을 최소화 하기 위해 멸 균 장갑을 착용 하 고 사용 하기 전에 적어도 10 분 동안 이온된 수에 70% 에탄올 (v:)에서 해 부 도구를 만끽해 보세요.
  8. V 자형 스탠드에 마 취 심고 동양을 건조를 방지 하기 위해 젖은 종이 수건으로 그것을 포장.
    참고: 아가미 구멍을 방해 하지 않습니다.
  9. 볼 강에 MS222의 50 mg/L를 포함 하는 화난된 물 재순환의 튜브를 삽입 하 고 흐름 속도 조정할 물을 통해 지속적으로 관개 아가미 아가미 구멍 종료 됩니다 확인 합니다.
  10. 살 균 메스와 집게를 사용 하 여 [1.25 X 확대 입체 현미경 ( 재료의 표참조)]의 후 각 상피 폭로 후 각 캡슐의 표면에 피부 5mm2 섹션을 제거.
  11. 필터링 된 물 odorant 배달 튜브를 플러시 고는 micromanipulator에 탑재 하는 밸브에 연결 합니다. 하지 odorants를 관리 하는 경우 건조를 방지 하기 위해 후 각 상피에 필터링 된 물을 제공 하는 micromanipulator를 사용 하 여 후 각 상피 캐비티에 odorant 배달 모 세관 튜브를 놓습니다.
  12. 녹음 및 참조 전극은 micromanipulators에 탑재 합니다. 낮은 외부 피부는 스킨 근처에 참조 전극. 사용 하 여 입체 현미경 (1.25 X), 낮은 기록 전극 간신히 터치 후 각 상피의 표면에.
  13. 필터링 배경 물에서 10-5 M L-아르기닌 솔루션 odorant 배달 튜브의 통풍 관을 전송.
  14. 컴퓨터, 증폭기 (DC 모드로 설정), 필터, 그리고 디지타이저를 켭니다. 4 s 단일 펄스 odorant의 T1, T 4 설정 상자를 선택 하 여 관리 하는 절차를 프로그램 밸브 드라이버 소프트웨어를 사용 하 여 s 및 t 2의 상자에 확인.
  15. 데이터 수집 소프트웨어에서 (참조 테이블의 자료), 고속 오실로스코프 획득 모드 설정, 플레이 아이콘을 클릭 한 다음 트리거 odorant 펄스 밸브 드라이버에서 시작 을 클릭 합니다.
    참고: 데이터 수집 소프트웨어 자동으로 20 차동 EOG 응답 진폭을 기록 s (3 4 전에 s odorant 펄스와 13 동안 s s 이후). micromanipulator 기동 기록 전극, 기준 전극, 또는 L-아르기닌 표준에 대 한 최대 응답와 빈 제어 (최소한의 응답 신호 대 잡음 비율을 증가 odorant 배달 튜브의 위치를 사용 하 여 필터링 된 물)입니다. 접지 전극 이동 하면서 GND로 AC-DC 앰프 스위치를 전환 하 여 증폭기.
  16. 빈 컨트롤, L-아르기닌, 그리고 단계에서 3.6 낮은에서 높은 농도의 필터링 된 물 2 분 플 러쉬를 응용 프로그램 간에 준비 odorants 녹음 시작 합니다.
  17. 테스트할 모든 odorants에 대 한 응답을 녹음 후 앰프 접지 하 고 신중 하 게 전극 및 odorant 배달 모 세관 튜브를 철회. MS222의 과다와 함께 마 취 심고 안락사는 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 방법, EOG 실험의 종료에 따라 (1 g/L).
    참고: 길 운동 및 적어도 5 분 뒤에 두뇌 pithing 하트 비트의 부족을 지적 함으로써 성공적인 안락사를 확인 합니다.
  18. 분석 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여. 빈 물 제어 보다 큰 응답을 이끌어내는 향기가 있는 분수를 식별 하기 위해 odorants22 의 탐지의 임계값을 결정 합니다. 빈 물 제어 보다 다른 농도 의존 후 각 응답을 이끌어내는 분수 풀 다음 행동 분석 결과 (4 단계)에서 테스트 합니다.

4. 2-선택 미로 행동 생물 행동 활성 분수/화합물을 식별 하

  1. 성적으로 성숙한 여성 바다 심고 미로에서 릴리스 장에 적응 ( 보충 그림 1참조) 5 분에 대 한 미로에서 강 수의 유량 유지
    참고: 미로 미로 업스트림 끝에 두 개의 채널로 분리 하는 길이 2.7 m를 측정 하는 분배기와 위험 스런된 바다 급료 나무와 측정 길이 6.5 m, 폭에서 1.2 m에서 건설 된다. 물 미로에 일시적으로 우회입니다. 0.19 m 물 깊이 유지 한다 고 0.07 m/s ± 0.01에서 속도 유지 해야 합니다.
  2. 바다 심고 놓고는 심고 실험에 지출 시간 및 각 포함 강 10 분 물 제어 채널의 누적 금액을 기록.
    참고: 바다 심고 실험에 들어가고 적어도 10에 대 한 채널을 제어 하지 못할 경우이 분 동안 s 끝 재판, 비활성 또는 강한 편견의 표시입니다.
  3. 적용 시험 자극 (즉, 10-12 M에 상 상속 페로몬에 50% 메탄올/이온된 수에 녹아 있는) 무작위로 할당 된 실험적인 채널을 차량 (50% 메탄올/이온된 수) 사용 하 여 제어 채널에 연동 5 분 동안 200 mL/min의 일정 한 속도로 펌프.
    참고: 전기 olfactogram 녹음 결정 테스트 자극의 감지 임계값 집중 해야 사용 초기 농도 행동 테스트에 대 한.
  4. 테스트 자극 및 추가 10 분에 대 한 차량 적용 하 고 실험에 심고 지출 시간의 누적 금액을 기록 및 제어 채널.
  5. 다음 재판의 시작 하기 전에 10 분 동안 물으로 미로 플러시. 충분 한 테스트 자극 사용할 수 있는 경우 최소 7 lampreys와 4.1-4.4 단계를 반복 합니다.
  6. 각 시험에 대 한 기본 설정22 의 인덱스를 계산 하 고 Wilcoxon 서명 순위 테스트를 사용 하 여 의미를 평가.
    참고: 인덱스 중 양수 또는 음수가 될 수 있는 단일 번호를 발생 합니다. 기본 설정의 인덱스의 양수 값 나타냅니다 매력, 반면 기본 설정 표시 반발의 지의 음수 값. 기본 설정의 인덱스는 0에서 크게 다른, 분수 활성으로 간주 됩니다.
    figure-protocol-1
    여기,
    Bc = 테스트 심고 odorant 응용 프로그램 전에 제어 채널에 의해 소비 하는 시간
    Be = odorant 응용 프로그램 전에 실험 채널에서 보낸 시간
    C = odorant 신청 후 제어 채널에 소요 된 시간 및
    E = odorant 응용 프로그램 후 실험 채널에서 보낸 시간.

5. 컬럼에 절연 활성 분수에서 순수한 화합물의

  1. 유도 후 각 응답 (3 단계) 분수 풀 2.1-2.4 단계를 반복 하 고 행동 응답 (4 단계)를 유도.
  2. 더 크기 배제 크로마토그래피는 Sephadex LH-20 열을 사용 하 여 함께 화합물에 활성 분수를 정화.
    1. 초기 모바일 단계에 0.5 mL에 샘플 준비 [CHCl3-MeOH (1:1) 또는 MeOH 100%], CHCl3-MeOH (1:1) 열과 후 MeOH (100%)의 열, 해당 열에 로드 및 화합물을 얻을 수 그들을 elute.

6. 구조 해명 질량 분석 (MS)와 핵 자기 공명 (NMR) 순수한 화합물의

  1. 녹이 고 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 약 1 μ g/mL의 10 μ 솔루션의 초기 모바일 단계 (보통, 메탄올 물, 1:1, v: v)에서 순화 된 화합물을 희석.
    1. HPLC 튜브 샘플 솔루션 전송 고 HPLC의 autosampler에 그들을 설정 합니다. 분무 이온화 질량 분석 (ESIMS)에 샘플 (10 μ)을 주사 하십시오와 착 색 인쇄기 질량 분 서 계23을 사용 하 여 고해상도 분무 이온화 질량 분석 (HRESIMS) 스펙트럼 기록.
  2. 분자 공식 질량 분석기 소프트웨어에서 데이터베이스에 따르면 예측 (참조 테이블의 재료)24.
    1. 삽입 된 샘플의 크로마 열고 컬럼에 피크를 선택 하 여 그것의 질량 스펙트럼을 얻을.
    2. 이온 (m/z) 값 (4 소수)에 원소 구성 도구 모듈에서 측정 된 질량을 입력 합니다. 허용 오차 매개 변수 PPM를 설정 < 5.
    3. 측정된 분자의 요소 구성에 맞게 기호 매개 변수를 조정 합니다. 소프트웨어는 단일 질량 분석 기반 분자 공식의 예측을 생성 합니다.
  3. 샘플을 해산 하기 위해 프로토콜25 에 따르면 deuterated 용 (600 μ, CH3오-d4 또는 DMSO-d6)를 선택 합니다.
    1. 완전히 샘플 0.1에서 약 10 mg/mL 까지의 농도 가진 해결책을 형성을 선택한 deuterated 용 매에 용 해. 1 D (1H, 13C)를 기록 하는 NMR 튜브에 샘플 솔루션을 전송 및 2D NMR [1H-1H 상호 관계 분광학 (아늑한) heteronuclear 단일 양자 일관성 (HSQC) heteronuclear 여러 본드 상관 관계 (HMBC)] 900 MHz NMR 분 광 계26에 스펙트럼.
  4. NMR 튜브 회전자 터빈 내부 샘플을 놓습니다. 깊이 게이지를 사용 하 여 되도록 샘플 높이 측정 윈도우 중앙. NMR 소프트웨어를 열고 ( 재료의 표참조) 자석에 샘플을 변경 하려면 해제 단추를 클릭 하십시오.
    참고: 가스는 자석의 상단에서 오는 느낌을 자석 위에 손을 잡으십시오. 같은 시간에 휘파람 소리 청취 해야 합니다.
  5. 부드럽게 샘플 자석 위에 공기 쿠션에 놓고 NMR 자석으로 강하 하는 샘플을 다시 해제 버튼을 눌러.
    참고: 샘플 올바른 위치에 표시를 "클릭" 소리를 들어봅니다.
  6. 새 데이터 집합을 만들고 NMR 악기에서 권장 하는 기본 매개 변수를 로드 ( 재료의 표참조).
    1. 자동 잠금 프로시저를 호출 하 고 음성 안내 페이지에서 용 매 선택에 "잠금"을 입력 합니다.
    2. 튜닝에 대 한 조작 패널조정 잠금 해제 모델에 버튼, 조작 패널에 커서를 조정 하 고 다시 자석 자물쇠.
    3. 프롬프트 Atma 페이지에 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다 튜닝 절차를 조작 패널에서 매개 변수를 조정 합니다. 진행 하는 튜닝 완료 되 면 때까지 기다립니다.
    4. 프롬프트에서 "topshim"를 입력 하 여 자동 메우는 루틴을 시작 합니다. 메우는 진행 완료 될 때까지 기다립니다.
    5. 유형 "rga" 설정 자동 이득 조정, 다음 유형 "d1" 펄스, 다음 유형 "zg" 시작 하는 인수, 고 인수 완료 될 때까지 기다립니다의 간격을 설정 하려면 받고.
    6. "Ef" 또는 "efp" 데이터를 처리 하 고 자동 단계적으로 조정 "apk" 입력을 입력 합니다. NMR 프로세싱 소프트웨어에 데이터를 처리 합니다.
  7. 화학 구조를 명료 하 게 NMR 데이터 분석의 해석에 의해.
  8. 13C NMR 스펙트럼에서 탄소 신호를 계산 합니다. 고해상도 질량 분석 (HR-MS)에서 예측된 결과에서 일치 분자 수식을 선택 합니다.
  9. 1H NMR 스펙트럼에서 양성자 신호를 통합 하 고의 탄소와 양성자-기반 HSQC 스펙트럼에서 신호에 연결을 할당 합니다.
  10. 1H-1H 아늑한 상관 관계 및 HMBC 스펙트럼에 따라 탄소 골격의 연결을 지정 합니다.
  11. 가칭 구조 근거27에 따라 화학 구조를 할당 합니다. 화학 구조 데이터베이스에서 임시 구조를 검색 합니다. 참조에서 아날로그와 임시 구조를 비교 합니다.
  12. 핵 Overhauser 효과 분광학 (NOESY) 스펙트럼과 상대 구성을 할당 합니다.
    참고: 분석 및 분 광 방법에 표시 하는 상체의 id 속성은 동일, 2'-알코올 및 2'-NH2, 특히 그 어떤 화합물의 절대 구성은 해야로 결정 한 derivatization 반응입니다. Derivatization 반응 후 스펙트럼에 표시 된 차이 대부분 화합물28의 절대 구성의 명확한 임무를 촉진 한다.

7. EOG 검정 순수 화합물을 확인 하는 향기가 있는 행동 활성화

  1. 3.1-3.5 단계를 반복 합니다.
  2. 농도-응답 곡선에 대 한 준비에서 10-6 M-10-13 M 50% 메탄올/물-20 ° c에 결정 하는 분자량에 따라 저장에서 10-3 M 페로몬 재고 솔루션의 순수한 화합물의 10 희석의 10 mL 6.2 단계입니다. 온도 8 ° c.에 equilibrate를 수 있도록 반복 물 욕조에 L-아르기닌과 순수한 화합물의 작업 솔루션 유리 튜브를 넣어
  3. 3.7-3.18 단계를 반복 합니다.
  4. 4.1-4.2 단계를 반복 합니다.
  5. 임의로 할당 된 실험적인 채널을 5 분 동안 200 mL/min의 일정 비율로 연동 펌프를 사용 하 여 제어 채널에 차량 (50% 메탄올/이온된 수) EOG 감지 임계값 농도에서 순수한 화합물을 적용 합니다.
  6. 4.4-4.6 단계를 반복 합니다.

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결과

검정 안내 분별의 프로토콜에서 설명 하는 단계를 요약 하는 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜 분리 구조, 후 각 힘 및 5 putative 바다 심고 페로몬 (그림 2)의 행동 활동을 특성화 하는 단계를 포함 한다. 대량 spectrometric 및 NMR 데이터 (그림 3 및 그림 4)를 사용 하 여 petromyzene A-B 및 petromyzone A-C의 구조는 성숙한 남성 바다 lampreys22,29로 조절 하는 물에서 해명 했다.

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토론

물고기는 화합물의 아직 식별 전체 화학 세계에 살고 있습니다. 생물 검정 기반 분류 특징 masu 연어31,32, 아시아 코끼리 바다 lampreys33, 관찰 등 많은 화학적 상호 작용을 중재 하는 생리 활성 분자를 식별 하는 필수 입증 34,35. 검정 안내 분별 정확 하 게 추적 및 pinpoint 시작에서 생리 활성 화합물 정화 활성 화합물을 추출 하는 효과적인 접근 이다. 이 방법을 사용 하 여, 확인 된 생리 활성 화합물 소설 알려진된 생 합성 경로에서 예상 될 것입니다 독특한 화학 뼈대를 화합물을 밝힐 수 있다.

EOG 녹음은 분수 또는 화합물 후 각 응답을 이끌어내는 결정 실시 합니다. 몇 가지 기술적 고려 사항은...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 미국 지질 조사 하 몬 드 베이 생물학 역 그들의 연구 시설 사용 및 미국 어류 및 야생 동물 서비스 및 수 산업의 직원 및 바다 캐나다 바다 lampreys 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구는 웨이 밍 리와 애 리 대 호 어업 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
필라멘트가 있는 프리미엄 표준 벽 붕규산 모세혈관 Warner InstrumentsG150F-4기록 및 참조 전극(OD 1.5mm, ID 0.86mm)
피펫 풀러 기기NarishigePC-10EOG용 전극을 당깁니다
다이아몬드 팁 유리 절단기용 전극의일반
Precision Instruments1B150-4EOG
용 냄새 전달 튜브기록 전극 홀더 E 시리즈 직선 바디와 Ag/AgCl 펠릿 유리 모세관 OD 1.5 mm워너 인스트루먼트ESP-M15N기록 전극 홀더
참조 전극 홀더 E 시리즈 핸들 포함  Ag/AgCl 펠릿  유리 모세관 OD 1.5mmWarner InstrumentsE45P-F15NH기준 전극 홀더
1mm 핀Warner InstrumentsWC1-10- 브리지 참조 및 기록 전극 홀더
2mm 핀Warner InstrumentsWC2-5- 브리지 참조 및 기록 전극 홀더
AgarSigmaA1296전극 채우기
용 용융 한천염화칼륨 (KCl)SigmaP93333M KCl 전극 및 전극 홀더 충진
Micropipette microfilWorld Precision InstrumentsMF28G-5전극 및 전극 홀더 충
L-아르기닌SigmaA5006용 포지티브 컨트롤 부취제
Sigma34860
수조맞춤형N/AEOG에 대한 냄새 물질 보유
3-아미노벤조산 에틸 에스테르(MS222)Syndel USATricaine1GEOG 마취제
Gallamine 트리에티오드화물SigmaG8134-5GEOG 마비제
1mL 주사기BD Biosciences마성
피하 바늘 투여 301025 26G 5/8BD Biosciences마비성 롤러 클램프 투여
World Precision Instruments14043-20lamprey의 입으로 마취제의 유속을 조정합니다
염화나트륨 (NaCl)J.T. Baker3624-050.9% 식염수
V자형 플라스틱 스탠드를 표본 스테이지로주문제작N/AEOG 플라스틱 트로프 동안 lamprey를 유지합니다
주문제작N/A는동안 V자형 플라스틱 스탠드를 유지합니다
- #11EOG해부10011-00
- #3EOG 해부용Fine Science Tools10003-12
직선 초미세 집게Fine Science Tools11252-00, Dumont #5SF 집게
곡선형 초미세 집게Fine Science Tools11370-42, Moria MC40B
스트레이트 프링 가위정밀 과학 도구15003-08EOG 해부
실체 현미경ZeissDiscovery V8EOG 해부
조명ZeissCL 1500 ECOEOG 해부
용 플라스틱 튜브일반 재순환 EOG 설정 및 수조 연결용
부취제 전달 튜브맞춤 제작N/A
In 라인 필터 및 개스킷 세트Lee CompanyTCFA1201035A
MicromanipulatorsNarishigeMM-3전극 및 냄새 전달 모세관
자기 고정 장치KanetecMB-K
밸브 드라이버Arduino냄새 자극을 위한 밸브 개방을 제어하기 위해맞춤 제작
전자기 밸브Lee 회사LFAA1201618H냄새 자극 밸브
NeuroLog AC/DC 증폭기Digitimer Ltd.NL106
Digitimer Ltd.를 사용하여 선형 신호 NeuroLog DC 프리앰프NL102G전자 신호의 진폭을 증가시키기 위해
저역 통과 60Hz 필터Digitimer Ltd.NL125
디지타이저Molecular Devices LLCAxon Digidata 1440A
Axoscope 데이터 수집 소프트웨어를 실행하는 Dell 컴퓨터(OptiPlex 745)Molecular Devices LLCAxoScope 버전 10.4
패러데이 케이지맞춤형N/A전자기 노이즈 차폐
2선택 미로맞춤형N/A플라스틱 라이너로 덮인 방수 해양 등급 합판
쓰레기 펌프HondaWT30XK4A강의 물로 미로를 채웁니다
Cole ParmerMasterflex 07557-00은 미로에서 냄새 물질을 관리합니다
인버터 발전기HondaEU1000i는 강력한 펌프
릴리스 케이지맞춤형N/A미로에서 lamprey에 적응하는 데 사용
메쉬메쉬 롤러로 미로의 치수를 포함하고 물의 난기류를 최소화하는 데 사용되는일반
버킷 (5 갤런)냄새 물질을 혼합하는일반
유량계Marsh-McBirneyFlo-Mate 2000배출 측정용
XAD 7 HP 수지Dow chemical37380-43-1조절 된 물 추출용 
조절된 물 추출을 위한메탄올시그마34860
조절된 물 추출을 위한수조YamatoBM 200
동결 건조기LabconcoCentriVap Concentrator디셔닝 워터
클로로포름SigmaCX1050획 풀 분리용
실리카겔 70-230 meshSigma112926-00-8분획 풀 분리용
실리카겔 230-400 meshSigma 112926-00-8분획 풀 분리용
코팅된 실리카 젤 TLC 플레이트Sigma99571분획 풀의 분리를 위해
anisaldehyde는SigmaA88107위한 분획 풀의 분리를 위해
Sephadex LH-20GE Healthcare17-0090-01분획 풀의 분리를 위해
, Amberlite XAD 7 HP 수지SigmaXAD7HP는 조절된 물의 추출을 위해 
4, 2.5L 용량 유리 기둥에이스 유리 Inc.조절된 물 추출을 위한5820
컨디셔닝된 물 추출을 위한AcetoneSigma
TQ-S TOF LC 질량 분석기 (또는 동급)Waters Co.구조 규명을위한N / A
바이너리 HPLC 펌프Waters Co.1525분획 풀/화합물 분리용
Agilent NMR 분광계, 900MHz(또는 동급)구조 규명용AgilentN/A
Rotovap 건조 시스템조절수 추출을 위한BuchiRII
UV 램프 (254nm)Spectronics Co.박층 크로마토그래피를 위한ENF-240C
은 . EOG 붕규산 유리 모세관 절단 팁 World 진 EOG 메탄올 비305115 준비하기 위해 는 EOG 메스 블레이드 메스 손잡이용 Fine Science Tools EOG 해부용 EOG 해부용 은 헤드스테이지 의 진폭을 증가시킵니다.는 는 튜브가 있는 인근 .    컨 추출용 분 사전 : 은 , 을 , 은   650501   

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