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방법 논문

생물 검정 기반 분류를 사용 하 여 바다 심고 페로몬의 식별

8.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58059

⸱

2018년 7월 17일

 ,  , 

이 논문에서

요약

여기, 선물이 분리 하 고 특성 구조, 후 각 힘, 및 바다 lampreys의 상 상속 페로몬 화합물의 행동 응답 프로토콜.

초록

검정 안내 분별 분리와 활성 페로몬 화합물의 식별 가이드 생리 및 행동 생물 검정의 결과 사용 하는 반복적인 접근 방식을입니다. 이 방법은 다양 한 동물 종에에서 페로몬으로 그 기능 화학 신호의 성공적인 특성에 결과 있다. 바다 lampreys 행동 또는 생리 적인 응답을 중재 하는 페로몬을 감지 하는 후각이에 의존 합니다. 우리 상 상속 페로몬의 기능을 멋 부리 다 하 고 절연 및 활성 페로몬 구성 요소 식별 가이드 물고기 생물학의이 지식을 사용 합니다. 크로마토그래피는 추출, 집중, 바른된 물에서 화합물을 분리 하는 데 사용 됩니다. 전기-olfactogram (EOG) 녹음 어떤 분수 유도 후 각 응답을 결정 하기 위해 수행 됩니다. 2 선택 미로 행동 분석 다음 경우 향기가 있는 분수의 또한 행동 활성화 되며 특혜를 유도 결정 하는 데 사용 됩니다. Spectrometric 및 광 메서드는 분자량 및 구조 설명 지원 구조 정보를 제공 합니다. 순수한 화합물의 bioactivity EOG 및 행동 분석 실험으로 확인 된다. 미로에서 관찰 된 행동 응답 궁극적으로 자연 스트림 환경에서 그들의 기능을 확인 하는 필드에에서 확인 되어야 합니다. 이러한 생물 검정 1) 분류 과정을 안내 하 고 2) 확인을 이중 역할 추가 격리 된 구성 요소 bioactivity를 정의 하 고. 여기, 우리는 검정 기반 분류 방식의 유틸리티를 예증 해 심고 페로몬 식별의 대표적인 결과 보고 합니다. 식별 해 심고 페로몬의 페로몬 통신 시스템의 변조 침략 바다 심고 Laurentian 오대호에서 제어 하는 것으로 간주 하는 옵션 중 하나입니다 있기 때문에 특히 중요 하다. 이 메서드는 taxa의 광범위 한 배열에서 화학 커뮤니케이션 특성 및 waterborne 화학 생태학에 쉽게 적응 될 수 있다.

서론

페로몬은 특정 화학 신호 음식 소스를 찾는, 포식 자 감지 conspecifics1의 사회적 상호 작용을 중재에 그들을 원조 하는 개인에 의해 발표. 곤충에 페로몬 통신이 되었습니다 잘 공부2; 그러나, 화학 물질 식별 및 수생 척추 동물 페로몬의 생물 학적 기능 하지 되었습니다 공부 했다으로 광범위 하 게. 정체성의 지식과 발표 페로몬의 기능 위협된 종3,4 또는 제어 해충 종5,6의 복구를 촉진 하기 위하여 적용할 수 있습니다. 이러한 기술의 응용 프로그램 격리 및 생리 활성 페로몬 구성 요소 특성화를 필요로합니다.

페로몬 식별 천연 제품 화학의 지점 이다. 페로몬 연구에 진행 부분적으로 페로몬 분자 자체의 특성으로 인해 제한 되었습니다. 페로몬은 종종 불안정 하 고 소량, 출시 그리고 몇 가지 샘플링 기술을 분 양의 휘발성7,8 또는 수용 성....

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 미시간 주립 대학교 (안녕히 # 03/14-054-00, 02/17-031-00)에 의해 승인 되었습니다.

1. 수집 및 바다 심고의 추출 물 조절

  1. 성적으로 화난된 휴런 호수 물 16-18 ° c.에 유지의 250 L와 함께 제공 된 탱크에서 남성 바다 lampreys (15-30 동물)을 성숙 하는 장소
  2. 6 월에서 7 월 각 밤 내내 남성 단련 물을 수집 합니다.
    참고: 바다 lampreys 산란 후 자연스럽 게 죽는다. 물고기의 인생에서이 시점에 근접, 신선한 성숙한 남성으로 교체.
  3. 단단한 단계 적 출에 의해 조건된 물을 추출 합니다.
    1. 열에 로드 하기 전에 4 h에 대 한 메탄올에 수 지를 담근 다. 수 지는 열에 로드 한 다음 유기 용 매를 제거 하는 열을 통해 물 10 L 펌프.
    2. 열의 위쪽에 펌핑 시스템을 통해 물고기 잡고 탱크에서 조절된 물을 전달 합니다. 온건 하 게 극 지 고분자 이온 교환 수 지 (예:., Amberlite: XAD 7 HP 수 지), 4의 시리즈에 포함 된 2 kg의 침대를 통과 하는 물 2.5 L 용량 유리....

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결과

검정 안내 분별의 프로토콜에서 설명 하는 단계를 요약 하는 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜 분리 구조, 후 각 힘 및 5 putative 바다 심고 페로몬 (그림 2)의 행동 활동을 특성화 하는 단계를 포함 한다. 대량 spectrometric 및 NMR 데이터 (그림 3 및 그림 4)를 사용 하 여 petromyzene A-B 및 petromyzone A-C의 구조는 성숙한 남성 바다 lampreys22,29로 조절 하는 물에서 해명 했다.

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토론

물고기는 화합물의 아직 식별 전체 화학 세계에 살고 있습니다. 생물 검정 기반 분류 특징 masu 연어31,32, 아시아 코끼리 바다 lampreys33, 관찰 등 많은 화학적 상호 작용을 중재 하는 생리 활성 분자를 식별 하는 필수 입증 34,35. 검정 안내 분별 정확 하 게 추적 및 pinpoint 시작에서 생리 활성 화합물 정화 활성 화합물을 추출 하는 효과적인 접근 이다. 이 방법을 사용 하 여, 확인 된 생리 활성 화합물 소설 알려진된 생 합성 경로에서 예상 될 것입니다 독특한 화학 뼈대를 화합물을 밝힐 수 있다.

EOG 녹음은 분수 또는 화합물 후 각 응답을 이끌어내는 결정 실시 합니다. 몇 가지 기술적 고려 사항은.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 미국 지질 조사 하 몬 드 베이 생물학 역 그들의 연구 시설 사용 및 미국 어류 및 야생 동물 서비스 및 수 산업의 직원 및 바다 캐나다 바다 lampreys 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구는 웨이 밍 리와 애 리 대 호 어업 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
필라멘트가 있는 프리미엄 표준 벽 붕규산 모세혈관 Warner InstrumentsG150F-4기록 및 참조 전극(OD 1.5mm, ID 0.86mm)
피펫 풀러 기기NarishigePC-10EOG용 전극을 당깁니다
다이아몬드 팁 유리 절단기용 전극의일반
Precision Instruments1B150-4EOG
용 냄새 전달 튜브기록 전극 홀더 E 시리즈 직선 바디와 Ag/AgCl 펠릿 유리 모세관 OD 1.5 mm워너 인스트루먼트ESP-M15N기록 전극 홀더
참조 전극 홀더 E 시리즈 핸들 포함  Ag/AgCl 펠릿  유리 모세관 OD 1.5mmWarner InstrumentsE45P-F15NH기준 전극 홀더
1mm 핀Warner InstrumentsWC1-10- 브리지 참조 및 기록 전극 홀더
2mm 핀Warner InstrumentsWC2-5- 브리지 참조 및 기록 전극 홀더
AgarSigmaA1296전극 채우기
용 용융 한천염화칼륨 (KCl)SigmaP93333M KCl 전극 및 전극 홀더 충진
Micropipette microfilWorld Precision InstrumentsMF28G-5전극 및 전극 홀더 충
L-아르기닌SigmaA5006용 포지티브 컨트롤 부취제
Sigma34860
수조맞춤형N/AEOG에 대한 냄새 물질 보유
3-아미노벤조산 에틸 에스테르(MS222)Syndel USATricaine1GEOG 마취제
Gallamine 트리에티오드화물SigmaG8134-5GEOG 마비제
1mL 주사기BD Biosciences마성
피하 바늘 투여 301025 26G 5/8BD Biosciences마비성 롤러 클램프 투여
World Precision Instruments14043-20lamprey의 입으로 마취제의 유속을 조정합니다
염화나트륨 (NaCl)J.T. Baker3624-050.9% 식염수
V자형 플라스틱 스탠드를 표본 스테이지로주문제작N/AEOG 플라스틱 트로프 동안 lamprey를 유지합니다
주문제작N/A는동안 V자형 플라스틱 스탠드를 유지합니다
- #11EOG해부10011-00
- #3EOG 해부용Fine Science Tools10003-12
직선 초미세 집게Fine Science Tools11252-00, Dumont #5SF 집게
곡선형 초미세 집게Fine Science Tools11370-42, Moria MC40B
스트레이트 프링 가위정밀 과학 도구15003-08EOG 해부
실체 현미경ZeissDiscovery V8EOG 해부
조명ZeissCL 1500 ECOEOG 해부
용 플라스틱 튜브일반 재순환 EOG 설정 및 수조 연결용
부취제 전달 튜브맞춤 제작N/A
In 라인 필터 및 개스킷 세트Lee CompanyTCFA1201035A
MicromanipulatorsNarishigeMM-3전극 및 냄새 전달 모세관
자기 고정 장치KanetecMB-K
밸브 드라이버Arduino냄새 자극을 위한 밸브 개방을 제어하기 위해맞춤 제작
전자기 밸브Lee 회사LFAA1201618H냄새 자극 밸브
NeuroLog AC/DC 증폭기Digitimer Ltd.NL106
Digitimer Ltd.를 사용하여 선형 신호 NeuroLog DC 프리앰프NL102G전자 신호의 진폭을 증가시키기 위해
저역 통과 60Hz 필터Digitimer Ltd.NL125
디지타이저Molecular Devices LLCAxon Digidata 1440A
Axoscope 데이터 수집 소프트웨어를 실행하는 Dell 컴퓨터(OptiPlex 745)Molecular Devices LLCAxoScope 버전 10.4
패러데이 케이지맞춤형N/A전자기 노이즈 차폐
2선택 미로맞춤형N/A플라스틱 라이너로 덮인 방수 해양 등급 합판
쓰레기 펌프HondaWT30XK4A강의 물로 미로를 채웁니다
Cole ParmerMasterflex 07557-00은 미로에서 냄새 물질을 관리합니다
인버터 발전기HondaEU1000i는 강력한 펌프
릴리스 케이지맞춤형N/A미로에서 lamprey에 적응하는 데 사용
메쉬메쉬 롤러로 미로의 치수를 포함하고 물의 난기류를 최소화하는 데 사용되는일반
버킷 (5 갤런)냄새 물질을 혼합하는일반
유량계Marsh-McBirneyFlo-Mate 2000배출 측정용
XAD 7 HP 수지Dow chemical37380-43-1조절 된 물 추출용 
조절된 물 추출을 위한메탄올시그마34860
조절된 물 추출을 위한수조YamatoBM 200
동결 건조기LabconcoCentriVap Concentrator디셔닝 워터
클로로포름SigmaCX1050획 풀 분리용
실리카겔 70-230 meshSigma112926-00-8분획 풀 분리용
실리카겔 230-400 meshSigma 112926-00-8분획 풀 분리용
코팅된 실리카 젤 TLC 플레이트Sigma99571분획 풀의 분리를 위해
anisaldehyde는SigmaA88107위한 분획 풀의 분리를 위해
Sephadex LH-20GE Healthcare17-0090-01분획 풀의 분리를 위해
, Amberlite XAD 7 HP 수지SigmaXAD7HP는 조절된 물의 추출을 위해 
4, 2.5L 용량 유리 기둥에이스 유리 Inc.조절된 물 추출을 위한5820
컨디셔닝된 물 추출을 위한AcetoneSigma
TQ-S TOF LC 질량 분석기 (또는 동급)Waters Co.구조 규명을위한N / A
바이너리 HPLC 펌프Waters Co.1525분획 풀/화합물 분리용
Agilent NMR 분광계, 900MHz(또는 동급)구조 규명용AgilentN/A
Rotovap 건조 시스템조절수 추출을 위한BuchiRII
UV 램프 (254nm)Spectronics Co.박층 크로마토그래피를 위한ENF-240C
은 . EOG 붕규산 유리 모세관 절단 팁 World 진 EOG 메탄올 비305115 준비하기 위해 는 EOG 메스 블레이드 메스 손잡이용 Fine Science Tools EOG 해부용 EOG 해부용 은 헤드스테이지 의 진폭을 증가시킵니다.는 는 튜브가 있는 인근 .    컨 추출용 분 사전 : 은 , 을 , 은   650501   

참고문헌

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
  3. Zhu, J., et al.

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