만능 줄기 세포 유래 Teratomas 외부 빔 방사선을 사용 하 여 작은 동물 모델에서의 타겟 및 선택적 치료

요약

만능 줄기 세포 유래 teratomas 위한 치료 전략에 대 한 연구는 줄기 세포 치료의 임상 번역 중요 합니다. 여기, 우리 첫째, 쥐에서 그리고, 선택적으로 대상 줄기 세포 유래 teratomas를 생성 하 고 생체 조건 작은 동물 irradiator를 사용 하 여 이러한 종양을 치료 하는 프로토콜을 설명 합니다.

초록

"줄기 세포 관광," 전세계 줄기 세포의 관계가 없는 이식의 피해자의 증가 줄기 세포 이식의 안전에 대 한 우려를 제기 했다. Teratomas 아직도 이식 시 잔여 미 분화 줄기 세포의 존재에서 발생할 수 있습니다 또는에 자발적인 돌연변이에서 분화의 이식 분화 보다는 미 분화 세포는 일반적인 관행, 비록 셀입니다. 줄기 세포 치료는 종종 해부학 민감한 사이트에 전달 됩니다, 때문에 작은 종양 임상, 실명, 마비, 인지 이상, 그리고 심장 혈관 장애의 결과로 파괴 될 수 있습니다. 이 사이트에 대 한 외과 액세스 제한, 몇 가지 치료 옵션과 함께 환자를 떠나 있을 수 있습니다. 줄기 세포 비행 제어는, 따라서, 줄기 세포 치료의 임상 번역에 대 한 중요 한입니다.

외부 빔 방사선 장기 주변에 부상을 최소화 하면서 기형종 부담을 줄이려면 타겟된 치료 제공의 효과적인 수단을 제공 합니다. 또한,이 방법은 유전자 조작 방지 또는 줄기 세포는 바이러스 성 변환 추가 임상 안전성 및 효능 우려와 관련 된. 여기, 우리는 쥐에 있는 pluripotent 줄기 세포 유래 teratomas를 만들려고 하 고 선택적으로 이러한 종양 vivo에서 ablate을 외부 빔 방사선 치료를 적용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

서론

조직 재생을 위한 줄기 세포 치료의 개발이 발생 했습니다 장벽 수를 지난 몇 십년에 효율적인 임상 배포에 대 한 노력을 방해. 이러한 장애물에 전달, 줄기 세포 immunogenicity 및 양식 teratomas¹종양 약 잠재력의 사이트에서 가난한 셀 보존을 포함 됩니다. Tumorigenicity은 특정 임상 관심사의 줄기 세포 이식 받는 사람²를 손상 시킬 수 있습니다. 종양의 형성 때문에 관계가 없는 줄기 세포 주사의 계정은 이미 여러 임상 설정^3,,45에 보고 되었습니다. 기형종 형성을 위한 잠재력은 가장 자주 만능 줄기 세포 (PSC) 개발에서 임상 관심사를 인용 했다 지연 및 여러 높은 프로필 배아 줄기 세포 (ESC)의 취소 귀착되 고 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 실험^6,7,,89. 따라서, 이러한 의원 성 종양 발생 해야 적절 한 치료를 제공 하는 쪽으로 전용 변환 조사에 대 한 긴급 한 필요는 있다.

날짜 하려면, 줄기 세포 비행 제어를 대부분 전략 tumorigenic 잠재적인^2,10Psc의 수를 줄임에 집중 했다. 불행 하 게도, (예를 들어., 1 x 10⁴ 1 x 10⁵ 셀¹¹) 잔여 세포 수가 적은 검출 한계 보다 훨씬 현재 사용할 수 있는 분석^12, 에 의해 인용 된다 기형종 형성에 필요한 ¹³. 이러한 preseparation 메서드를 사용 하 여 다른 제한 등 낮은 효율 및 높은 비용, 새로운 조직 공학 접근, 및 세포의 잠재적인 손상에 대 한 적절 하지 않을 수 있습니다 단일 셀 정지에 대 한 의존도 생존 그리고 engraftment입니다.

몇 연구 치료 옵션 다음 기형종 형성 언급. 아마도 가장 잘 공부 전략으로 줄기 세포^14,15"자살" 유전자의 결합 이다. 이 방법은 유전자 줄기 세포를 유도할 수 있는 apoptosis 활성화 유전자 주입된 셀 teratomas를 생산 하는 경우 그로 인하여 구조 접근을 제공 하는 약리 자극 postinjection에 의해 활성화 될 수 있는 통합 조작 포함. 그러나이 방법은,,의 Psc와 약물 저항¹⁶의 점진적 개발에 대 한 잠재력의 유전 수정 오프 대상 결과 포함 하 여 중요 한 단점이 있습니다 겪고 있다. 이와 비슷한 방식을 안티 apoptotic 통로¹⁷의 억제를 통해 Psc의 선택적 세포 죽음을 유도 하는 작은 분자를 이용 한다. 다른 그룹의 세포 죽음 같은 podocalyxin 같은 단백질 1 (PODXL)¹⁸pluripotency 표면 표식에 대 한 항 체를 사용 하 여 Psc의 대상 있다. 작은 분자 또는 항 체의 타이밍 너무 일찍 배달 하 고 있습니다 너무 늦게 전달 하는 경우 치료 효능 부족 Psc의 치료 가능성에 상당한 영향을 의미 합니다. 또한, 작은 분자와이 패션에 사용 되는 항 체의 조직 효과 하지 공부 되었습니다.

이러한 종양을 치료 하는 대체 접근 외부 광속 방사선 요법 (EBRT)를 사용 하 여 의존 하고있다. EBRT 현재¹⁹단단한 종양 치료에 고용 기본 형식 중 하나입니다. 등각 EBRT 기형종 주소 지정을 위해 이상적이 게 만들어서 정상 조직에 손상을 피하고 있는 동안 병 적인 구조의 향상 된 타겟팅 EBRT, 양성자 빔과 정위 적 radiosurgery의 개발을 포함 하 여 혁신 활성화 해부학 적인 몸의 민감한 구조²⁰에 형성입니다. 또한,이 방법은 유전자 조작 이나 둘 다 추가적인 임상 안전 함께 고민 하는, 줄기 세포의 바이러스 성 변환 방지 및 효능 우려¹⁵. 마지막으로, 마이크로-균 장치에 진보는 설치류²¹에 EBRT의 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다.

이 문서에서 우리는 인간의 Ipsc 쥐에 주입 하 여 기형종 형성의 작은 동물 모델을 만드는 방법을 보여 줍니다. 우리 다음 선택적으로 이러한 종양 vivo에서 주위 조직에 최소한의 피해를 근절 하기 위해 EBRT를 적용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 방법은 생물학 분자 및 펩 티 드의 조직 배달은 Psc의 유전자 조작의 대상 오프 효과 피하는 동안 PSC 파생 teratomas에 대 한 타겟된 치료를 제공 합니다. 조사 가능한 목적, 생물 발광 영상 (씨)를 통해 방사선 치료 종양 응답을 추적 취재 원 유전자와 줄기 세포 transduce 위해를 제공 합니다.

프로토콜

이 동물 실험 승인 하 고 제도적 검토 보드와 스탠포드 대학에서 실험실 동물 관리에 관리 패널에서 수행 했다.

1. Ipsc의 세포 배양

1. 인간의 Ipsc lentiviral 프로그래밍 6 잘 플레이트 지하실 멤브레인 매트릭스 (예: matrigel, 라고도 매트릭스 hereon) 코팅에 의해 파생 된 성장.
2. 매일 변경 풍부한 문화 매체와 Ipsc의 미디어 (참조 테이블의 자료) 37 ° C, 5% CO₂배양.
3. 일단 셀 도달 80-90% 합류 (약 매 4 일), 추가 재조합 세포 분리 효소의 1 mL ( 재료의 표참조) 당 잘 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 품 어.
4. 5 분 후 pipetting으로 우물에서 세포를 분리 하 고 15 mL 튜브에 그들을 전송 300 x g에서 원심.
5. 원심, 후는 상쾌한 발음 고 풍부한 문화 매체로 셀 펠 릿 resuspend 1:1,000 희석에서 Y27632 억제 물 농축 ( 재료의 표참조).
6. 천연된 셀의 셀 수를 수행 하 고 4 × 10⁵2 x 10⁵ 의 밀도에서 매트릭스 코팅 6 잘 플레이트에 셀 replate.

2. 더블-퓨전 취재 원 유전자와 Ipsc의 변환

1. Ipsc 루틴에 의하여 6 잘 플레이트에 통과 하 고 풍부한 문화 매체 추가 (참조 테이블의 재료) 포함 6 µ g/mL hexadimethrine 평범한 사람.
   참고: 이상적인 식민지 크기는 200-400 셀/식민지 최고 변환 효율을 얻을.
2. 자동 비활성화 lentivirus 들고 반딧불 luciferase 및 녹색 형광 단백질 (FLuc eGFP) 남서 29 회전자 앙금 원심 분리에 의해 인간의 유비퀴틴 promotor-c 구동 50000 x g 2 h 4 ° c.에 대 한 집중
3. 6 잘 플레이트 10의 감염 (MOI)의 다양성에 있는 Ipsc을 바이러스 집중을 추가 하 고 5% CO₂에서 37 ° C에서 밤새 품 어.
   참고: 감염의 다양성 (FACS) 스캔 정렬 형광 활성화 된 세포에 의해 분석 하는 단위체 형광 단백질의 식에 의해 결정 되었다.
4. 다음 날, 실 온에서 6 분에 대 한 300 x g 에서 iPSC 6 잘 플레이트의 원심 분리 하 여 바이러스를 제거 합니다.
5. 매일 풍부한 문화 매체와 미디어를 변경 ( 재료의 표참조) 및 프로토콜에 의하여 통행. EGFP에 대 한 대략적인 변환 효율을 결정 하는 형광 현미경을 사용 합니다.
6. 30-40%의 효율성은 FACS 정렬에 충분 합니다. 경우 30-40% 이상 익스프레스 eGFP eGFP 표현 hiPSCs FACS를 진행 합니다.
7. Ex vivo FLuc 활동 확인을 잘 당 5000 세포의 밀도에 FACS에 의해 정렬 GFP를 표현 하는 셀 접시.
8. 품 어 transduced 셀 및 비 불리고 세포 (부정적인 제어 될 것입니다) 생물 발광 기자와 프로브 D-소 (100 μmol/L) 6 헤 미 판 spectrofluorometer와 생물 발광을 측정.

3. Immunodeficient 쥐에서 기형종 형성 등 측면에서 Psc의 이식

1. 재조합 세포 분리 효소 혼합 문화 (섹션 2 참조)에서 더블-퓨전 취재 원 유전자 (GFP FLuc)으로 불리고 인간의 Ipsc를 포함 하는 6-잘 접시 당 1 mL을 추가 하 고 5 분 동안 품 어.
2. 잠복기, 후 피 펫 포부와 식에 의해 셀 분산. 문화 매체의 동일한 볼륨을 추가 하 고 4 분 250 x g 에서 원심.
3. 원심 분리를 완료 한 후 표면에 뜨는 솔루션을 발음 하 고 행렬의 30 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend 한 주입 전에 그것의 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에 놓습니다. hemocytometer를 사용 하 여 1 x 10⁶ 셀의 수확을 확인 합니다.
4. 더블-퓨전 리포터 유전자 transfected 세포를 활용 하 여, 매트릭스의 30 µ L에서 (2 절)에서 더블-긍정적인 FACS 세포를 일시 중단 합니다.
5. 8-10 주 athymic 누드 마우스 1 L/min 산소 2 %isoflurance 사용 하 여 마 취를 유발 하 고 산소의 1 L/min로 유지 보수 2 %isoflurane 날짜를 사용 하 여.
6. 셀/매트릭스 혼합물을 주사 28.5 G 주사기를 사용 하 여 총 5 x 10³ 5 x 10⁶ 셀 (주입 당 약 100 ul)를의 주사에 대 한 목표 측면에서 피하 공간으로 (참조 테이블의 재료) 서 스 펜 션.
7. 연장된 기간 및 큰 종양의 성장 예측에 대 한 마우스를 유지 하려는 경우 더 꼬리 사출 사이트를 고려 하십시오.
8. 마 취 동물 외래까지 온수 패드에 복구할 수 있습니다 (일반적으로 < 1 h) 호흡 속도의 모니터링, 외래까지 발가락의 색깔을 피부.

4. 생물 발광 기형종 성장 및 세포 생존을 평가 하기 위해 이식된 세포의 (BLI) 이미징

1. 접종 후 원하는 timepoints에 375 mg/kg는 쥐로 기자 프로브 D 소의의 복 (IP) 주사를 수행 합니다.
2. IP 주사, 이미지는 생물 발광 후 10 분 30 분 1 분 수집 윈도우를 사용 하 여 5 분 간격에 대 한 마 취 동물 (3.5에 설명 된 단계로 수행 됨)에 신호.
   참고: 주간 이미지 인수 하는 것이 좋습니다. 마 취 동안 유지 영상 제공 함으로써 isoflurane 통해 코 콘 흡입.
3. 데이터 분석에 대 한 관심 (ROI) 영역 씨 신호에 그리고, 다음, 계량 단위로 스테라디안 (/sr 광자/s/cm²) 당 평방 센티미터 당 초당 최대 광자의 방출에 수집 시간에 대 한 정상화.

5. 기형종 방사선 전 임상 이미지 기반 Irradiator (그림 1)를 사용 하 여

1. 100% 산소 1 L/min의 유량에서 isoflurane 2%를 사용 하 여 최저의 상자에 마우스 anesthetize 마우스는 완전히 마 취 후 이미지 기반 사전 임상 irradiator의 침대에 전송 ( 재료의 표참조). 2 %isoflurane 마 취 유지 지속적으로 통해 코 콘.
2. 400 프로젝션 이미지 40 kVp, 2 mA x 선 빔를 사용 하 여 360 ° 이상으로 마이크로-CT 이미지를 수집 하 고 그 0.2 m m의 등방성 픽셀 크기와 체적 이미지로 재구성.
3. RT_Image 소프트웨어 패키지 (http://rtimage.sourceforge.net/)를 사용 하 여 마이크로-CT 이미지를 사용 하 여 방사선 치료를 계획 하 고 치료를 수행 합니다.
   참고: 두 개의 225 kVp x 선 광선, 마우스의 나머지의 표면 굽 도리 널 고 살려주는 기본 내장 하면서 표면 대상 기형종 통과 지향 사용 된 치료 계획에 의하여 이루어져 있다. 광선에 대 한 노출 시간이 대상 종양의 센터에서 복용량은 6 Gy를 분기별 시스템 교정 데이터에 따라 조정 됩니다.
4. 대상 종양에 18 Gy의 총을 제공 하는 3 연속적인 일에 처리 과정을 반복 합니다.
5. 동물 들 표준 치료 후 유지 합니다.

결과

일반적으로 주입 된 쥐 씨 (그림 2)를 영상으로 확인 4-8 주 후 기형종 성장 형성을 시연할 예정 이다. 종양은 luciferase 신호 (그림 2)에서 크게 감소의 결과로 주어진 셀 납품 후 1 개월 18 Gy의 누적 복용량 방사선 때 극적으로 축소 됩니다. 중요 한 것은, 정상 조직의 조사 사이트에서 5mm를 가져온 어떤 상당한 피해 (그림 3)에 표시 되지 않습니다.

그림 1: EBRT와 종양의 치료에 대 한 프로토콜의 도식.

토론

전 임상 데이터와 "줄기 세포 관광"의 피해자에서 일화 적인 사례 teratomas를 개발의 위험 PSC 치료²³와 관련 된 심각한 단점이 되는지 확인 합니다. 방지 하 고 치료 하는 줄기 세포 치료와 관련 된 종양 약 위험 주의 접근의 발달은, 그러므로, 재생 줄기 세포 치료의 임상 번역 촉진에 중요 한 단계. 이 문서에서 우리는 PSC 관련 teratomas EBRT를 사용 하 여 마우스 모델에서의 치료 대상으로 하는 방법을 설명 하 고 씨 이미지를 사용 하 여 조사 종양의 동적 위축 보여주었다.

우리 인간의 Ipsc 활용 lentivirus 메서드를 프로그래밍 하 여 만든 고 정리 teratomas vivo에서 형성 누드 마우스 모델에 주입. 누드 마우스를 사용 하 여 셀의 간 종 주입 초기 면역성 거부를 방지합니다. 면역 결핍 쥐를 사용 하 여 potentiates tumorigenic 잠재력, 동안 동일한 프로토콜 immunoc...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유도 만능 줄기 세포 제어 라인	Stanford University	Nguyen Lab	세포 배양 iPSC
Corning matrigel 기저막 매트릭스 354234	Fisher Scientific	CB-40234	iPSC
Essential 8 배양 배지	ATCC-The global bioresource center	30-2203	iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	의 세포 배양iPSC
Y27632 억제제 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	iPSC
렌티바이러스	Cyagen	P170721-1001cjn	이중 융합 리포터 유전자를 이용한 iPSC 형질도입
폴리르브레네 감염/형질주입 시약	Millipore Sigma	TR-1003-G	이중 융합 리포터 유전자
를 이용한 iPSC 형질도입유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 Fluc-eGFP 리포터 유전자	스탠포드 대학교	샘 갬비르 연구소 이중	융합 리포터 유전자를 이용한 iPSC의 형질도입
D-루시페린	퍼킨 엘머	122799	이중 융합 리포터 유전자와 BLI
유세포 분석기 (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	이중 융합 리포터 유전자를 사용한 iPSC의 트랜스duction
(Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	이중 융합 리포터 유전자를 이용한 iPSC 트랜스duction
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	조사
X-Rad SmART 이미지 유도 조사기	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	조사
RT_Image 소프트웨어 패키지	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	방사선 조사