단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

요약

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

초록

Efferocytosis의 규칙을 공부 apoptotic 세포의 통풍 관을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis를 제어 하는 신호 및 세포 프로세스를 조사 하는 방법을 필요 합니다. 이 정량화 수행 apoptotic 세포 들은 efferocytosed 증분, 따라서 수 정확 하 게 윤곽을 그리 다 잔여 unengulfed 휴대 대 apoptotic 대상의 efferocytosed 부분 사이 방법이 필요로 하기 어려울 수 있습니다. 파편. 여기 설명 된 방법은 이중 라벨 접근 efferocytosis와 efferocytic 용량의 efferocytes 대 식 세포 등의 역학을 정확 하 게 계량을 활용 합니다. Apoptotic 세포의 cytosol apoptotic 세포의 표면 biotinylation 내 면 및 비 내 면 간의 차별화에 대 한 허용 하는 동안 모든 apoptotic 세포 유래 물질의 모니터링을 활성화 하는 셀 추적 염료와 함께 표시 됩니다. apoptotic 세포의 분수 Efferocytes의 efferocytic 용량 라이브 또는 고정 셀의 형광 이미지와 streptavidin 얼룩으로 구분으로 대 내 면된 대상, 바운드의 양을 측정 하 여 결정 됩니다. 이 방법은 cytometry, 즉 비-efferocytosed 대 efferocytosed apoptotic 세포 분수, efferocytic 역학 라이브 셀 현미경으로 측정 하는 능력의 정확한 묘사 같은 방법에 비해 몇 가지 장점이 고 용량을 붙일 레이블 transgenes 표현 하는 세포에 세포 신호의 연구를 수행 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법, efferocytic 활동을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis 동안 활성 세포 신호 경로 심문 하는 데 사용할 수 있는 유연한 실험적인 접근 방식 기반으로 제공 합니다.

서론

Apoptosis, 또는 프로그램 된 세포 죽음 대부분 다세포 유기 체에서 발생 하 고 그들의 발달 및 항상성¹에 대 한 중요 한 높은 규제 생리 적 과정 이다. 정상 세포 회전율 및 배아 개발에 참여 하 고, 이외에 apoptosis 조직에서 감염 되거나 손상 된 세포의 제거를 가능 하 게 하 고 또한 감염, 염증, 암, 응답 하 고으로 의료 개입에 의해 트리거할 수 있습니다. 방사선 치료 또는 스테로이드¹등. Apoptotic 세포 노출 "먹고-나" 다양 한 직업 및 비 직업적인 식 세포에 수용 체에 의해 인식 되는 그들의 세포 표면에 신호 총칭 하 여 "efferocytes"로. 이 수용 체의 참여 efferocytosis^2,3로 알려진 프로세스를 통해 efferocyte에 의해 통풍 관 및 apoptotic 세포의 저하를 유도 합니다. Phosphatidylserine은 최고의 특징이 먹고-저 운전 efferocytosis 신호. 그것은 일반적으로 apoptosis을 따라서⁴셀 표면 phosphatidylserine 노출이 막 비대칭 방해 지질 scram....

프로토콜

건강 한 지원자에서 혈액의 컬렉션 건강 과학 연구 윤리 위원회의는 웨스턴 온타리오 대학에 의해 승인 되었다. Venipuncture 인간의 연구에 세 배 회의 정책 성명의 지침에 따라 수행 되었다.

1. 문화 및 THP 1 Monocyte 셀 라인의 준비

1. 37 ° C + 5% CO₂T25 플라스 크에서 현 탁 액 문화로 문화 THP 1 monocytes. 셀 소 태아 혈 청 (FBS) 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640) + 10%의 5 mL에 성장 한다.
2. 부드럽게 흔들어 플라스 크, 성장 매체에 걸쳐 균등 하 게 각 날짜 일시 셀 다음 즉시는 hemocytometer 셀을 계산 합니다. 세포는 세포 밀도 도달 하면 1 x 10⁶ 셀/mL passaged 해야 합니다.

결과

밤새 Jurkat 세포의 apoptosis에 1 µ M staurosporine 결과 문화 > Annexin v (그림 1) 얼룩 확인 될 수 있다 세포의 95%. 비록 staurosporine의 농도 및 staurosporine 치료 기간 각 셀 라인에 대 한 최적화 될 필요가 있을 것 이다 다른 세포 유형,이 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 검색 및 efferocytosis의 정량화에 대 한 > 세포의 80%는 efferocytes에 그들을 추가 하기 전에 apoptotic 이어야 한다. Apoptosis (예: 열 충격, etoposide 및 UV 빛)의 다른 inducers를 사용할 수 있습니다, 하지만 우리의 경험, 이러한 생산 apoptosis와 혼합된 셀 인구 apoptotic, 괴 사 성 등을 포함 하는 결과의 더 많은 다른 유형의 유도 및 apoptotic.......

토론

이 프로토콜에서 설명 된 방법을 사용 이미징 및 고정 셀 및 라이브 셀 접근을 사용 하 여 동적 efferocytic 프로세스의 정량화. 이러한 방식을 일반적으로 고용된 흐름 cytometry 기반 방법^23,24에 여러 가지 이점을 제공합니다. 내부 고정 샘플 얼룩의 사용 속도의 더 강력 하 고 정확한 정량화와 efferocytosis의 범위를 제공 한다-실제로, 많은 교류 cytometry 기반 방법을 간단 하 게 레이블을 apoptotic 세포와 대 식 세포와 다른 fluorophores, 그리고 점수 efferocytosis 공동 apoptotic 세포 마커, 따라서 구별 하는 능력 부족으로 얼룩이 지는 세포의 일부분으로 내 면된 apoptotic 세포 소재 대 구속. 대체 흐름 cytometry 접근 apoptotic 세포²⁴을 표시 하는 pHrodo를 사용 하 여 포함 됩니.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm 원형 유리 커버슬립 #1.5 두께	Electron Microscopy Sciences	72290-08	커버슬립의 크기와 모양은 중요하지 않지만, 세포 배양을 단순화하는 표준 12웰 플레이트의 웰에 18mm가 맞습니다.
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	1mM(1,000x 스톡 용액)에서 DMSO에 용해(1,000x 원액)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	건조기에 보관합니다. 원액을 준비하지 마십시오.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
림프폴라이트-폴리 세포 분리 배지	Cedarlane Labs	CL5071
재조합 인간 M-CSF	Peprotech	200-04
재조합 인간 IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 대식 세포 세포주	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 인간 단핵구 세포주	ATCC	TIB-202
Jurkat T 세포주	ATCC	TIB-152