쥐에서 담 즙이 폐쇄 증 증후군 장황 하는 실버 나노 방법

요약

이 문서는 장황 실험 담 즙이 폐쇄 증 마우스 모델에서 담 즙이 폐쇄 증 증후군에 대 한은 나노 입자에 따라 하는 방법을 자세하게에서 설명 합니다. 시 약 준비 과정 및 신생아 마우스 주입 기술을 이해 신생아 마우스 모델 연구에 사용 되는 방법에 익숙해지도록 연구 하는 데 도움이 됩니다.

초록

담 즙이 폐쇄 증 (바)의 병 인은 아직 완전히 이해 하는 아이 들에 있는 높은 사망률과 염의 심각한 유형입니다. 바이러스 성 감염 원인 중 하나 있을 수 있습니다. 학사 학위를 공부에 대 한 사용 되는 전형적인 동물 모델 붉은 털으로 타 바이러스와 신생아 마우스 접종으로 설정 됩니다. 나노 항균 및 항 바이러스 효과; 발휘 표시 되었습니다. 바 마우스 모델에서 그들의 기능은이 연구에서 평가 됩니다. 현재, 바 동물 실험, 바 쥐의 증상을 개선 하는 데 사용 하는 방법을 통해 음식이 나 다른 약물을 주어진 일반적으로 증상 치료입니다. 이 연구의 목적은 쥐에서 바 증후군은 나노 입자의 복 주입 장황 하는 새로운 방법을 설명 하 고은 나노 젤 배합을 준비 하기 위한 자세한 방법을 제공입니다. 이 메서드는 간단 하 고 광범위 하 게 적용 하며 바, 뿐만 아니라 임상 치료 메커니즘을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다. 쥐 전시 황 달 때 바 마우스 모델에 따라, 준비 된은 나노 젤 낮은 간 표면에 intraperitoneally 주입 됩니다. 생존 상태를 관찰 하 고 생화학 지표 및 간 histopathology 검사. 이 메서드는 두 바 모델 및 소설 바 트리 트 먼 트의 설립의 더 직관적인 이해를 수 있습니다.

서론

바는 cholestasis 영구적인 황 달 특징의 한 형태 이며, 간 이식의 부재에 높은 사망률을 있다. 바이러스 성 감염 바의 병 인에 밀접 하 게 연관 된다. 세포, reovirus, 그리고로 모두 바^1,2,3병원 균으로 제안 되었습니다. 추가-intrahepatic 및 담 관, 담 즙 상피 세포 apoptosis, 포털에서 선 동적인 세포 침투를 선도 대 한 면역 dysregulation 신생아 기간 동안 바이러스 감염에 대 한 미숙한 면역 시스템의 응답 결과 지역, intrahepatic 및 extrahepatic 담 관 방해, 그리고 마지막으로, 간 섬유 증^4,,56.

학사 연구에 대 한 일반적으로 사용 되 동물 모델에서는 붉은 털으로 타 바이러스 (RRV)와 신생아 마우스의 접종 합니다. 마우스는 일반적으로 낮은 몸 무게 및 acholic 변 5-6 일 후 황 달 개발. 질병 과정에서 면역 반응의 역할은 중요, 특히 자연적인 살인자 (NK) 세포; 안티 NKG2D 항 체로이 셀의 소모는 크게 바-손상⁷감소 시킨다. 게다가, 다른 세포, CD4 포함⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, 수지상 세포, 및 규정 하는 T 세포 모두 표시 되었습니다 질병^8,9,,1011에 역할을. 모든 데이터는 학사 과정에서 면역 시스템의 필수적인 자연 제안.

나노 (AgNPs)는 몇 가지 전염 성 질환, 세균 감염¹² 등 바이러스 감염^13,,1415에 대 한 유익한 효과를 입증 되었습니다. 그러나, 피부과 사용 이외의 몇 가지 연구는 사용 AgNPs 임상 치료에 그들의 잠재적인 독성 때문에 주로. 동물 실험에서 연구팀은 일반적으로 구두¹⁶ 통해 AgNPs 관리 또는 정 맥 주사 방법¹⁷의 효능을 공부 했다. 그러나, 다른 연구원 AgNPs 관리 통해 신생아 마우스에 복 (i.p.) 주사 실험을 간단 하 고 빠른 방법을 선도 하 고 간 및 담 즙 관 동안에 더 직접적인 영향의 효능 공부 면역 시스템과 같은 다른 시스템에 독성을 감소. AgNPs NK 세포 활동¹⁸; 영향을 보였다합니다 따라서, 우리는 바 마우스 모델에서 AgNPs 관리 통해 i.p. 주입의 치료 효과 시험 했다.

프로토콜

모든 동물 실험 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 Sun 야만 센 대학 실험실 동물 센터 (#IACUC-DB-16-0602)의 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 담 즙이 폐쇄 증 마우스 모델 구축

1. 압력가 마로 소독 차 우 광고 libitum에 대 한 액세스와 25 ° C에서 12 h 다크/라이트 사이클에서 특정 병원 체 자유로운 환경에서 임신 BALB/c 마우스를 유지.
2. 준비 하려면 RRV 스트레인 MMU 18006, MA104 세포에 바이러스를 증폭 하 고 상 패 분석 결과¹⁹바이러스 titers을 측정 한다.
   참고: MA104 셀 교양 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)에 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 인큐베이터에 함께 포함 된 5% CO₂습도 분위기. 증폭 단계는 간략하게 아래 설명 됩니다.
   1. MA104 세포를 감염 (1.5 x 10⁷) 30 ml 혈 청 자유로운 매체의 트립 신 활성화 RRV [1.5 x 10⁶ 플 라크 형성 단위 (PFU)]와 150 cm² 문화 플라스 크에. 5% CO₂와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 3 일 동안 감염 된 세포를 품 어.
   2. 각 단계를 동결 하 고, 셀 녹고 다시 실내 온도;-80 ° C 냉장고에서 20 분으로 3 그리고 freeze-thaw 주기에 의해 문화 플라스 크에 감염 된 세포를 lyse 셀 관련 바이러스 입자는 상쾌한에 발표할 예정 이다. 그런 다음, 수집 하 고 표면에 뜨는 문화와 세포 lysate 15 mL 원뿔 튜브로 전송.
   3. 저속 원심 분리 (300 x g 3 분 4 ° C에서)에 의해은 lysate에서 큰 세포질 파편을 제거 합니다. 그런 다음, 동물 실험에 대 한 새로운 15 mL 원뿔 튜브로 바이러스 (약 6 mL)를 포함 하는 상쾌한 전송.
      참고:는 RRV는 titered, aliquoted, 그리고 저장 또는 사용 확대의 추가 라운드에 대 한 준비 다음. 실내 온도에 장기간 노출; 바이러스 감염 용량을 감소 시킬 것 이다 바이러스와 얼음에 배치 한다-80 ° C에 또는 액체 질소에 저장.
3. 부하 작은 볼륨 (1 mL) 인슐린에 RRV 신생아 마우스 주입에 대 한 29 G 바늘 주사 통.
   참고: 체적 주사기의 두꺼운 바늘 쉽게 이어질 마약 누설.
4. 출생의 24 시간 이내 각 신생아 20 µ L 10⁵ PFU/mL RRV 루트를 통해 i.p.; x 1.2의 관리 같은 양의 식 염 수를 사용 하 여 제어.
   참고:이 실험에 사용 되는 주사기는 1 mL 인슐린 주사기. 다른 이유로 인해 첫 2 일 안에 죽 었 다 그들의 어머니에 의해 지 루 하지 했다 감염 된 생쥐는 분석에 포함 되지 않았다.
5. 모든 신생아 쥐를 밀접 하 게 관찰 하 고 매일 그들을 무게. 일반적으로, RRV 접종 후 6 일에 황 달에 귀, 피부, 대변 된다 찰 흙 색, 나타나고 모피 된다 기름, 바 모델;의 설립 제안 이러한 증상에 대 한 확인 하십시오.
   참고: 바 H & E와 immunohistochemical 진술서와 함께 간 조직 섹션 검사 하 여 확인할 수 있습니다. 바 마우스는 AgNP 치료에 대 한 준비 다음.
   주의: 현대 인간과 동물 RV 긴장, Biosafety 수준 2 (BSL-2) 조건 하에서 처리 해야 합니다 사용 하기 위해 제공 하는 프로토콜이입니다.

2.은 나노 입자 합성

1. 준비 하 고 앞에서 설명한^12,20AgNPs 특성.
   참고: 준비 및는 AgNPs의 세부 사항은 설명 출판물에 화학의 부, 홍콩의 대학^12,20에서 C. M. 체의 팀에 의해. 솔루션의 최종 농도가 1 m m 이었다. AgNPs의 평균 직경은 10 nm (5 ~ 15까지 nm) 및 전자 현미경 검사 법에 의해 확인.

3. 실버 나노 콜라겐 혼합물의 준비

참고: AgNP 콜라겐 혼합 준비 되 고 이전²¹ 을 설명 하 고 4 ° c.에 저장 된 특징 얼음에 모든 절차를 수행 해야 합니다.

1. 첫째, 콜라겐 준비 490 µ L의 추가 나 1.5 mL 튜브에 콜라겐 (4 mg/mL)를 입력 하 고 얼음에 그것을 배치.
2. 콜라겐을 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 10 배)의 100 µ L을 추가 하 고는 피 펫을 함께 섞는다.
   1. 10 x PBS 버퍼 1 리터를 준비 하려면 80 g의 NaCl, KCl의 2 세대 및 35.8 g Na₂HPO₄^. 의 결합 12 H₂O KH₂포₄ 와 게 실 온에서 버퍼의 2.4 g.
3. 다음, 위의 솔루션에 NaOH (0.2 M)의 10 µ L를 추가 합니다.
   1. 0.2 M NaOH를 준비 하려면 증류수 1 l의 NaOH 파우더 8 g을 추가 합니다.
4. 마지막으로, 콜라겐을 AgNPs (1mm)의 400 µ L을 추가 하 고는 피 펫과 그들을 믹스.
   참고: 추가 AgNPs 마지막도 혼합 합니다. AgNP 콜라겐 혼합 4 ° C에 저장 한다 그렇지 않으면, 그것은 쉽게 실 온에서 고형화 한다.

4. 마우스 주입 방법

1. AgNP 콜라겐 혼합의 50 µ L의 i.p. 주사로 치료 RRV 그룹에 감염 된 신생아 쥐 황 달;의 외관 후에 관리 두 번째 주사를 3 d 나중을 수행 합니다.
   참고: 컨트롤 RRV (감염된 제어) 그룹에서 마우스는 같은 양의 염 분, 고 치료 받지 일반 컨트롤 그룹에 있는 마우스.
2. 주사의 시작 부분에 마우스의 다리 반지 손가락으로 비스듬히 오른쪽 허벅지 위에 누르고 15 ° 각도 (그림 1)에서 천천히 바늘을 소개. 간 (그림 2), 약 0.5 cm에서의 낮은 가장자리의 표면에 도달, 주입 AgNP 콜라겐 혼합; 그런 다음, 천천히 바늘을 철회 한다.
   참고: 조심, 주사기로 공기를 소개 후, 신생아 마우스 살해 될 수 있습니다. 신생아 쥐에 왼쪽된 복 부에는 위장과 비장 그리고 위는 우유의 가득. 이 쪽에서 주사를 관리 하는 경우 바늘 쉽게 복 부 구멍, 또는 출혈을 일으키는 비장 흘러 우유를 일으키는 원인이 되는 중 위를 입력할 수 있습니다.
   주의: 모든 손가락 부상을 방지 하 여 바늘 뚜껑을 교체, 바늘, 제거 및 sharps 컨테이너에 반드시 바늘을 주의.
3. 모든 주사 후 쥐 AgNP 콜라겐 혼합 젤 하 고 사출 사이트 사슬에서 어머니를 방지 하기 위해 수 있도록 10 분에 대 한 그들의 감 금 소 밖으로 유지. 다음, 그들의 감 금 소에는 마우스를 반환 합니다.
4. 관찰 하 고 생존 율 뿐 아니라 황 달 및 몸 무게를 포함 하 여 매일, 모든 마우스의 실제 모습을 기록.

5. 혈액 샘플 컬렉션

참고: 약 120 µ L의 혈액 샘플은 심장에 바늘을 삽입 하 여 수집 됩니다. 원심, 후 혈 청 수집된 (약 70 µ L) 간 기능 테스트입니다. 혈액 컬렉션 메서드는 다음과 같습니다.

1. 9와 12 일 RRV 접종 (이 AgNP 치료 후 3 일) 후에 쥐를 anesthetize 사용 하 여 0.5-2.5 %sevoflurane.
2. 마우스의 사지를 고정 하 고 75% 알코올로 위와 더 낮은 복 부를 소독.
3. 절단 하 여 마우스 피부, 근육, 그리고 중간 선 따라 복 막에는 칼이 위; 횡 경 막 노출 멸 균 면봉을 사용 하 여 횡 경 막 근육을 완전히 폭로 위장을 제거.
4. (1 mL 언로드된 인슐린 주사기)와 심장의 좌 심 실에 바늘을 삽입 하 고 최대 혈액 볼륨을 주사기 플런저를 천천히 당겨 다시. 다음, 1.5 mL 튜브에 혈액을 전송.
5. 실 온에서 30 분 동안 서 서 400 x g에 5 분 동안 원심을 튜브를 허용 합니다. 그런 다음, 전송 피 펫을 사용 하 여 수집 하 고 저장 추가 사용에 대 한 혈 청.
   참고: 횡 경 막, 횡 경 막 결함은 쉽게 매, 죽음, 그리고 혈액 응고, 혈액 샘플 수집 하지 이어질으로 손상 하지 마십시오.

6. 생 화 확 적인 매개 변수 검색

1. 혈 청 생화학 매개 변수 검색 단계 5.5에서에서 수집 된를 사용 합니다.
2. 자동된 생화학 분석기를 사용 하 여 다음 생 화 확 적인 매개 변수 검색: 알라닌 aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산), 총 단백질 (TP), (장백의) 알 부 민, 글로불린 (GLO), 총 빌리 루빈 (TBIL), 직접 빌리 루빈 (DBIL), 간접 빌리 루빈 (IBIL), 그리고 총 담 즙 산 (미정).

7. extrahepatic Cholangiography Extrahepatic 담 즙 덕트 Patency 관찰 하

주: 해 부 현미경 아래에서 전체 프로세스를 수행 합니다.

1. 완벽 하 게 간, 쓸 개, 그리고 extrahepatic 담 관 면봉으로 노출 합니다.
2. 관찰 하 고 간 및 담 즙 관 해 부 현미경의 외관 사진.
3. 안과 집게를 사용 하 여 담 낭의 바닥을 부드럽게.
4. 메 틸 렌 블루 솔루션 (0.05 wt.% H₂O) 1 mL 주사기를 로드 합니다. 천천히; 쓸 개 구멍에 주사기 바늘을 삽입 그리고 안과 집게와 바늘을 잡고 천천히 methylene 청색의 10-20 µ L를 달 이다.
5. 파란색 공장 extrahepatic 담 관을 통해 전달 여부를 현미경으로 관찰 하 고 사진을.

8. Hematoxylin에 오신 얼룩이 신선한 간 샘플의 수집

1. 신선한 마우스 간 조직 하룻밤에 수정 10% 포 르 말린.
2. 다음, 파라핀에 고정된 간 조직을 포함 하 고 그들을 섹션.
3. 섹션 dewax, (증류수, 각각 5 분 동안에 100%, 95%, 80% 및 70% 에탄올) 같은 에탄올 시리즈와 함께 rehydrate, 얼룩 hematoxylin으로 조직을 섹션, 1% 염 산 알코올 차별화에 그들을 주제 및 마지막으로, 얼룩은 함께 오신 섹션입니다.
4. 마지막으로, 40 X 현미경 간 histopathology를 관찰 합니다.

9. 되며 오신 얼룩진 조직 단면도의 Immunohistochemical 얼룩

1. Dewaxing 섹션 재 후, 트리 스-EDTA 버퍼 (10 mM Tris 기지, 1 m m EDTA, pH 9.0)에 섹션을 잠수와 95 ° c.에서 10 분 동안 전자 레인지에 난방 항 원 복구 수행
2. 3% 과산화 수소 솔루션 10 분에 대 한 조직 단면도 노출 하 여 내 인 성 과산화 효소를 제거 합니다.
3. 일반적인 바인딩 차단 5% 염소 혈 청으로 섹션을 처리 합니다.
4. 1 차 항 체 토끼 마우스 NKG2D 추가 (1: 100) 섹션, 그리고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
5. 실 온에서 30 분에 대 한 적절 한 보조 항 (HRP 표시 된 고분자 반대로 토끼 시스템)와 섹션을 품 어.
6. 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) chromogen로를 사용 하 여 얼룩 immunohistochemical 시각화.
7. 40 X 현미경 아래 섹션을 확인 하 고 이미지를 원하는 대로 분석을 진행.

10. 흐름 Cytometric 분석

1. 부드럽게 말하다 간 조직, 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 그것을 전달 하 고, 그것을 원심에서 4 분 4 ° C에서 270 x g 2 x.
2. 셀 펠 릿 RPMI 1640 매체에서 resuspend 및 2 색 면역 형광 단일 클론 항 체를 사용 하 여 분석.
3. 세포 형질 fluorescein isothiocyanate와 phycoerythrin 활용 된 안티-NKp46 (NK 세포, 1:1, 000)를 포함 하 여 특정 세포 표면 마커를 사용 하 여 수행 및 안티-CD4 (T-셀 하위; 1:1, 000), 교류 cytometer 함께 데이터를 분석 하 고 교류 cytometry 데이터 분석 소프트웨어와 함께
4. 앞 으로/사이드 분산형, 어떤 배경 형광에 대 한 하 고 개별 항 체에서 형광 신호에 따라 보조 분석 데이터를 대상에 isotype 컨트롤에 따라 게이트 따라 세포 인구를 선택 합니다.

결과

설치 바 마우스 모델을 기반으로, 감염 된 신생아 쥐 관리 되었다 준비 AgNP 콜라겐 혼합물 2의 i.p. 주사 황 달 전시 후 x. 마우스 생존은 매일, 확인 하 고 간 기능 검사, 간 병 리, 그리고 cytometry 수행 했다. 치료 컨트롤 바 쥐에 비해, AgNP 처리 쥐 감소 황 달 그리고 유지 하는 그들의 정상적인 몸 무게 (그림 3). 빌리 루빈 물질 대사 및 간장 transaminase 레벨 정상 제어 값, AgNPs는 크게 (표 1) 간 기능 개선 제안에 떨어졌다. Methylene 청색 얼룩과 extrahepatic cholangiography (그림 4) AgNP 치료 후 담 즙 덕트 patency 확인. H & E 염색 (그림 5) 마우스 컨트롤 마우스...

토론

AgNPs 전시 강력한 넓 스펙트럼 항균 특성 및 강한 침투성²²; 또한, 그들은 항균 의료 제품²³의 범위를 생산 하는 데 사용 됩니다. 그러나, AgNPs는 일단 그들은 장기에 축적 하 고이 속성은 독성 효과^24,25이어질 수 있습니다 취소 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 이전 연구는 쥐 실험에서 단일 i.v. 주입 후 급성 독성과 AgNPs의 genotoxicity 검사 하 고 결과 보였다 AgNPs 급성 간 및 신장 손상 발생할 수 있습니다. AgNPs는 thymus, 비장¹⁷등 주요 면역계 장기에 축적. 이 마우스 바 모델 AgNPs는 치료 ameliorated NK 세포 억제에 의해 부분적으로 중재를 제안 하는 우리의 데이터 바 증후군. 그러나, AgNPs의 장기 효과 마우스 개...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BALB/c 마우스	광동 의학 실험 동물 센터	SYXK2017-0174	동물 실험
붉은털 로타바이러스 (RRV)		ATCC ATCC  VR-1739	담즙 폐쇄증 마우스 모델
MA104 세포	ATCC	ATCC  CRL-2378.1	실험실 전용
DMEM	Thermo Fisher	10569010	포유류 세포 배양
태아 소 혈청	Thermo Fisher	10099141	포유류 세포 배양
콜라겐 유형	I CORNING	354236	연구용
PBS 완충액	OXOID	BR0014G	세척
NaOH	Sigma	1310-73-2	pH 값
조정 AgNP			Antibacterial 참고: AgNps는 홍콩 대학교 화학과의 CM Che. 교수의 선물이었습니다.
인슐린 주사기(통합 바늘 포함	BD	9161635S	의료용
15 mL 원심분리기 튜브	Corning	430791	실험실 전용
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	GEB	CT0200-B-N	실험실 전용
현미경	Nikon	ECLIPSE-Ci	실험실용
해부/생체 내 현미경	Nikon	SMZ 1000	실험실용
안티-마우스 NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	연구용
전용 안티-마우스 CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	연구용
전용 단클론 마우스 Anti-Human CD4	DAKO	20001673	연구용
전용 anti-NKG2D	RD	MAB1547	연구용
BD FACSCanto 유세포 분석기	BD Biosciences	FACS Canto Plus	실험실 전용