글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

요약

이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.

초록

N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체 (NMDAR) ionotropic 글루타민 산 염 수용 체로 분류 됩니다 있고 학습과 기억에 중요 한 역할. NMDAR 오작동, 표현으로 어느 이상-또는 아래-activity 돌연변이, 변경된 식, 인신 매매, 또는 지역화로 인 한 수많은 질병, 특히 중앙 신경 조직에에서 기여할 수 있다. 따라서, 화합물 및 작은 분자의 발견을 촉진 뿐만 아니라 이해 하는 수용 체의 생물학 신경 질환에 대처 하기 위해 지속적인 노력에서 결정적 이다. 수용 체를 공부 하 고 현재 접근 제한이 낮은 처리량, 높은 비용과 excitotoxicity NMDAR 중재를 방지 하기 위해 채널 차단제의 필요한 존재로 인해 그것의 기능적인 능력을 공부 하는 무 능력을 포함 하 여. 또한, 기존의 분석 결과 시스템만 조미료에 의해 자극에 민감한 고 글리신은 NMDAR의 다른 공동 ligand에 의해 자극 감도 부족. 여기, 선물이 공동 ligands, 조미료와 D-떠들고/글리신에 감도 NMDA 수용 체를 높은 처리량 힘을 가진 첫 번째 접시 기반 분석 결과. 이 이렇게 다른 NMDAR 소 단위 구성의 연구를 허용 하 고 글리신-또는 조미료에 민감한 모드에서 수용 체의 기능 연구를 허용. 또한, 방법 측정 동안 억제제의 존재를 필요 하지 않습니다. 이 분석 결과 함께 긍정적이 고 부정적인 allosteric 변조기의 효과 검출 될 수 있다 고 NMDAR의 알려진된 약리학 우리의 시스템에 복제 되었습니다. 이 기술은 기존 방법의 한계를 극복 하 고 비용 효율적입니다. 우리는이 새로운 기술은 NMDAR 중재 병 리에 대 한 치료의 발견을 가속화 될 것을 믿습니다.

서론

현재 의학의 발전, 수명 크게; 증가 했다 그러나, 그래서 나이 관련 된 질병의 유행이 하고있다. 질병 중앙 신경 조직 (CNS) 정신 분열 증, 루 경화 증 (ALS), 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 다른 사람, 사이 등의 예외가 있으며 향후 10 년간^1, 증가 예상 ^{2 , 3}. N-메 틸-D-aspartate 수용 체 (NMDAR)로 알려진 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 고장 Alzheimer의 질병, 정신 분열 증, 외상 성 뇌 손상, 뇌졸중, 당뇨병, 및 보증, 녹 내장에 연결 되어있다는 효과적인, 질병 수정 요법^4,5,,67의 개발에 대 한 그들의 생물학을 공부 해야 합니다.

NMDARs는 4 개의 단위체 또는 소 단위^4,,

프로토콜

1입니다. 셀의 준비

참고:이 프로토콜을 데이터 생성을 포함 하 여 잠재 인코딩 NR1 및 NR2A 세포로 불리고 HEK293 세포를 사용 합니다.

1. HEK293 세포의 적절 한 수 씨 하 고 적절 한 최종 농도 (1.00 µ L 각)에서 NR1 / NR2A 바이러스를 추가 합니다. 384-잘 접시를 사용 하 여 10, 000 셀/잘 30 µ L의 최종 볼륨.
2. 또는 적절 한 휴대폰 번호와 (384-잘 접시, 10, 000 사용 하 여 셀/잘 30 µ L의 최종 볼륨에서)에 대 한 볼륨 HEK293 NR1 NR2A 셀 씨. NR2A 식 유도 및 복합 보호 추가 2 µ g/mL의 농도에서 항생물질을 추가 (100 µ M MDL105, 519 또는 5 µ M CGP070667²⁴).
3. 참고: 인코딩 NR1, NR2 잠재 5 x 10⁹ -10 x 10⁹ 밀리²⁴당 감염 단위 사이 대략 titer가 있어야 합니다.

2입니다. NMDA 수용 체 활동의 측정

1. HEK293 세포 중 보호 화합물 존재 NR1/....

결과

작은 분자의 효과 테스트 하기 전에 하나 NMDARs 최적의 ligand 농도의 최적의 식 수준을 결정 해야 합니다. 설명, HEK293 세포 384-잘 접시에 잘 당 10000 셀에서 시드 했다 5 µ M의 CGP060667, 다음 불리고 NR1 및 NR2A의 다양 한 양의 바이러스. 인큐베이션 하룻밤, ligand 유도 된 칼슘 후 유량 측정 되었다 (그림 1). 이러한 실험의 결과 공개 최고의 수량 및 각 소 단위 (그림 1, 노란색 상자)를 사용 하는 바이러스의 비율.

일단 최적의 양과 NR1와 NR2A 변환에 대 한 비율 결정 했다, ligand 적정 NMDARs의 활성화를 위한 최적의 ligand 농도 결정 하기 위해 수행 되었다. 이 위해 공동 .......

토론

이 분석 결과의 성공 사용 HEK 세포의 건강에 따라 달라 집니다. 지 수 성장을 겪고 세포와 낮은 통로 번호와 함께 사용 해야 합니다. 이 분석 결과 많은 전송 고 추가 그렇게 주의 사용 하 여 솔루션의 결과에 더 높은 정확도 보장 합니다. 화합물 및 다른 모든 시 약의 농도 또한 오류를 최소화 하기 위해 크로스 체크 해야 합니다. 칼슘 유출 분석 결과 대 한 분석 결과 버퍼와 셀 미디어를 교체할 때 접시 해야 될 기울어져 부드럽게 되도록 셀을 분리 하지 않습니다. 마지막으로,이 프로토콜에 폴 리-D-리 코팅된 접시를 사용 하 여 접시에 셀 첨부 파일을 증가합니다.

NMDAR 식에 차이 변환 시 통로 번호와 HEK293 세포의 적합성에 따라 소 단위 식에 필요한 바이러스 양의 수 있습니다. 또한,는 잠재 짧은 수명 6 개월에서 1 년까지 있다. 따라서, 바이러스의 품질이 분석이 결과 대 한 중요 한 매개 변수입니다. 표준 면역 형광 분석 결과 감지 하 여 식 수준 및 지역화 추.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HEK-293	ATCC	CRL-1573
인간 NMDA(NR1/NR2A) 수용체 세포주	ChanTest Corporation	CT6120
pFastBac 이중 발현 벡터	ThermoFisher Scientific	10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning Life Sciences	3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit	Molecular 장치	R8192
글리신	, 시그마-알드리치	G7126
글루타메이트	시그마-알드리치	49621
D-세린	, 시그마-알드리치	S4250
L701,324	토크리스,	907
HEPES 완충액	보스턴, 바이오 제품	BB-103
염화마그네슘 용액	, 시그마-알드리치	63069
염화칼슘	VWR	E506
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025-092
Probenecid	ThermoFisher Scientific	P36400
DMEM/F-12, GlutaMAX 매체	ThermoFisher Scientific	10565018
MDL105,519	NIBR	집에서
합성NVP-AAM077	NIBR	사내에서
CGP070667	NIBR	사내에서 합성

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