방법 논문

공장 수용 성 단백질과 소화 탄수화물 콘텐츠를 사용 하 여 옥수수 (지 시 메이 스)를 표본으로 측정

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⸱

DOI:

10.3791/58164

⸱

2018년 8월 6일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

이 논문에서

요약

여기에 설명 된 프로토콜 수용 성 단백질 및 식물 조직에서 소화 (비 구조) 탄수화물 콘텐츠 측정을 위한 명확 하 고 친근 한 방법론을 제공 합니다. 이 두 공장 macronutrients 계량 수 식물 생리학, 영양 생태학, 식물-초 상호 작용 및 식품 웹 생태 분야 진출을 위한 중요 한 의미를 갖는다.

초록

원소 데이터 일반적으로 herbivores 자원으로 식물 품질을 유추 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 탄소 생체에서의 유비, 포함 하는 질소 식물 방어 화합물 및 질소와 식물 단백질 콘텐츠 모든 종의 수천에서 존재 이러한 추정의 정확도 제한 합니다. 또한, 식물에 초점을 맞춘 연구 및/또는 초 식 동물 생리학 필요 하지 사용 하 여 이루어집니다 정확도의 수준을 일반화 상관 관계. 여기에 제시 된 방법 공장 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물, 동물 생리 적 성능에 가장 밀접 하 게 연결 하는 두 식물 macronutrients 직접 측정을 위한 명확 하 고 빠른 프로토콜 연구를 제공 합니다. 프로토콜은 정확 하 고 재현 가능한 결과 제공 하는 최적화 된 공장 관련 소화 단계 잘 특징이 색도계 분석 실험을 결합 한 제품. 조직 표시 이러한 분석 실험 감도에서 변화를 감지 하는 다른 달콤한 옥수수의 우리의 분석 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 여러 공간 비늘에 걸쳐 공장. 이러한 포함 하는 식물 사이 성장 하는 지역 및 식물 종 또는 품종, 뿐만 아니라 공장 내 조직 종류에 차이 같은 조직 내에서 심지어 위치 차이. 원소 데이터 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 결합도 식물 미네랄 영양 식물 생리 프로세스와 연결할 식물 생물학에 있는 새로운 기회를 제공. 이러한 분석은 또한 수용 성 단백질 및 영양 생태학, 식물-초 상호 작용 및 생리 및 생태 연구에 향상 시킬 것입니다 음식 웹 역동성을 공부 하는 데 필요한 소화 되기 쉬운 탄수화물 데이터 생성 도움이 됩니다.

서론

식물 바이오 매스는 사실상 모든 지상파 음식-웹의 기초를 형성 한다. 식물 뿌리 시스템을 통해 토양에서 영양 요소 확보를 생체 합성 조직 그들의 잎에 햇빛. 특히, 탄소와 질소 탄수화물, 단백질 (아미노산의 구성)를 만드는 데 사용 됩니다 빌드하고 지질 하는 데 필요한 식물 바이오 매스 (주목 해야 한다 그에 식물 생리학 용어 "다량 영양소" 종종 N, 등 토양 요소 참조 그러나 P, K, S,,이 문서를 통해이 기간을 참조 합니다 쓰이므로, 단백질, 탄수화물, 지질 등). Herbivores 소비 공장 설비 재료, 식물 조직에 포함 된 macronutrients 그들의 구성 부분으로 세분화 되며 소비자의 생리 적 프로세스를 구동 하는 데 사용. 이 방법에서는, 식물 macronutrients 높은 순서 생태 상호 작용 및 음식 웹 역동성에 대 한 중요 한 의미와 함께 소비자 생리학에 강한 영향이 있다.

동물의 왕국에 걸쳐 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 macronutrients 생존, 재생산, 그리고 성능1에 가장 밀접 하 게 묶여 있습니다. 또한, 동물의 대다수는 적극적으로 그들의 생리 적 요구1,2를 충족 하기 위해 이러한 두 개의 macronutrients의 그들의 섭취를 조절 합니다. 이 사실이 특히 식물 조직, 설탕 및 아미노산의 농도 감지 하는 곤충 herbivores에 대 한 차례로 먹이 행동을 지시 하는. 그 결과, 수용 성 단백질을 식물 그리고 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 식물 곤충 상호 작용의 진화에 강한 역할을 했다.

우세는 동안 공장 수용 성 단백질에 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 데이터 상대적으로 드물다 (6,7,,89,10,11참조), 식물 원소 콘텐츠 (탄소, 질소, 인)에서 사용할 수 있는 데이터입니다. 크게이 요소는 식물 미네랄 영양3,,45에 기본 역할 때문입니다. 요소, 측정 어디 상관 관계 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물의 양을 추정 하는 데 사용 되었습니다 하지만 정확한 계산 종종 얻기 어렵다. 예를 들어, 탄소는 모든 유기 화합물에 편 존재 하기 때문에 공장 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠의 지표로 서 탄소를 사용 하 여 아니다. 원소 질소 공장 수용 성 단백질 콘텐츠, 사이 강한 관계가 그리고 일반화 된 질소-단백질 변환율은 종종 활용. 그러나, 질소-단백질 변환 높은 종의12,13,14,15, 하 게 일반화 된 변환의 사용 가능성이 있다는 강력한 증거가 있다 부정확 한. 이 때문에, 질소-단백질 변환 요소는 종종 특히 정도로 herbivores에 영양 연구에 필요한 정밀을 부족 합니다. 또한, N 포함 된 식물 allelochemicals, 미치 죠 및 glucosinolates는 herbivores, 독성 등의 존재는 이러한 변환을 혼동 수 있습니다.

여기, 우리는 수용 성 단백질과 식물 조직에서 소화 되기 쉬운 탄수화물의 농도 측정 하기 위한 두 개의 화학 분석을 제공 합니다. 이 분석 실험, 제시 하지만 그 그들은 동시에 사용할 수 같은 식물 샘플을 분석 하 식물 macronutrients의 보다 포괄적인 분석을 달성 하기 위하여 건의 된다. 둘 다 비슷한 방법론을 정량화 하 여 흡 광도 통해 다음 추출 단계의 구성 된 사용 합니다. 식물 샘플 준비는 또한 쉽게 연동에서 모두 분석을 실행 하려면 두 프로토콜에 대 한 동일 합니다. 이 분석 실험의 유틸리티 할 그들의 참신에서 줄기 하지 그들은,에 의존 (브래드 포드, 존스, 뒤부아) 확고 색도계 분석 실험16,17,18, 하지만 여기서 우리는 명확 하 고 쉽게 따라 조직 더 애매 한 특정 식물 추출 기술17,19 이러한 메서드를 결합 하 여 이러한 분석의 응용 식물 관련 필드에 액세스할 수 있도록 하는 프로토콜입니다.

두 분석 실험에 대 한 식물 macronutrients는 동결, lyophilizing, 및 식물 소재를 연 삭 하 여 물리적으로 추출 처음. 수용 성 단백질 분석 결과 대 한 추가 화학 추출17,19 vortexing 및 난방 NaOH 솔루션에서 샘플의 몇 라운드를 통해 수행 됩니다. Coomassie 화려한 블루 G-250를 활용 하 여 잘 알려진 Bradford 분석 실험 다음 수용 성 단백질과 3000-5000 Daltons16,17사이 polypeptides를 계량 하는 데 사용 됩니다. 이 분석 결과 1-20 µ g 미 판 당 총 단백질 사이 탐지 범위 잘 또는 < 25 µ g/mL, 하지만 하지 측정 무료 아미노산을 않습니다. 소화 되기 쉬운 탄수화물 분석 결과의 추출 단계 스미스 그 외 여러분 의 희석 산 방법에 따라 20 녹는 설탕, 전 분, 그리고 fructosan-하지만 하지 구조 탄수화물의 격리에 대 한 수 있습니다. 페 놀 황산 산 정량화 방법 뒤부아 외 에서 가져온 것입니다. 18 모든 모노-, 올리고-고 류 뿐만 아니라 (메 틸 유도체) 측정. 이 분석 결과 특정 설탕을 계량 수 하지만 여기 우리가 총 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 표시기로 사용 (참조 스미스 외. 20 더 자세한 분석을 위해). 함께,이 분석 실험 공장 환경 생리학 및 초 성능, 지상파 음식-웹의 기지에서 리소스 품질에 중요 한 데이터를 제공 하 강하게 연결 된 두 개의 macronutrients를 측정 합니다. 이러한 프로토콜을 제시 식물 생리학, 초 식 동물의 영양 생태학, 식물-초 상호 작용의 더 철저 한 이해를 얻기 위하여 식물 다량 영양소 데이터 집합 생성을 촉진 합니다.

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프로토콜

1. 식물 수집 및 처리

  1. 수집 및 공장 샘플 처리
    1. 식물 샘플 수집 후 플래시 동결 샘플 집게와 저장소-80 ° c.에 액체 질소로 공장 설비 재료를 찍기로 식물 샘플을 수집 하는 경우는 너무 커서 플래시 동결, 신속 하 게 최대한 빨리 드라이 아이스 및 전송-80 ° C 냉장고를 사용 하는 샘플을 냉각. 식물 재료의 다량 영양소 콘텐츠 컬렉션 후 즉시 공장 샘플을 동결 하는 것이 중요 하다 그래서 조직 공장에서 분리 된 후 변경할 수 있습니다.
      주의: 액체 질소는 피부 접촉 시 심한 동상을 발생할 수 있습니다. 승인 된 용기에 액체 질소를 수송 하는 곳을 알아내는-장갑, 아이 구글, 얼굴 방패, 앞치마, 그리고 실험실 외 투를 포함 하 여, 처리 하는 동안 적절 한 보호구를 착용 했는지 확인 하십시오.
    2. 공장 설비 재료 물 제거 되 고 하는 동안 조직 metabolically 활성 되지 않습니다 보장 하기 위해 동결 건조 기를 사용 하 여 lyophilize 샘플의 질량까지 드라이 모든 물 제거 되도록 안정화.
    3. 일단 샘플 건조, 분쇄기 또는 밀을 사용 하 여 정밀한 분말에 갈기. Desiccating 캐비닛 분석까지 샘플을 저장 합니다.

2. 수용 성 단백질 분석 결과

  1. 샘플 준비
    1. 각 조직, 약 20 m g 각각의 복제 샘플 무게 1.5 mL 폴리스 티 렌 microcentrifuge 튜브 및 튜브 라벨에. 이후 알 수 없는 샘플으로 이러한 샘플을 지칭 합니다. 이 정보 각 불명된 한 견본에서 % 녹는 단백질을 계산 하는 데 필요한 것으로 각 샘플의 정확한 질량을 기록 합니다. 잠금 뚜껑, microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 샘플 솔루션의 손실을 후속 난방 단계 비 잠금 뚜껑 열 수 있습니다.
  2. Solubilize 및 알 수 없는 샘플 단백질 분리
    1. 마이크로 pipettor 사용 하 여, 각 튜브를 0.1 M NaOH의 500 µ L를 추가 합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 30 분 동안 sonicate. 뜨거운 물에 예 열 목욕 90 ° c.
      주의: 수산화 나트륨 강력한 기반 이며 피부 접촉 시 화상을 일으킬 수 있습니다. 0.1 M NaOH 낮은 농도 나타내지만, 피부 자극을 피하기 위해 보호 장갑을 착용 하십시오.
    2. 15 분 동안 뜨거운 물 목욕에 있는 선반에 튜브를 배치 합니다.
    3. 10 분간 15000 x g에서 튜브를 원심. 각 샘플에 대 한 새로운 피 펫 팁을 사용 하 여 새 레이블된 microcentrifuge 튜브 표면에 뜨는 액체 플라스틱. 10 분 동안 펠 릿과 다시 15000 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 튜브를 0.1 M NaOH의 300 µ L를 추가 합니다. 또, 표면에 뜨는 액체를 수집 하 고 동일한 샘플에서 다른 표면에 뜨는 액체 결합. 정지점, 잠재적인 이며 샘플에 저장 될 수 4 ° C 하룻밤 필요한 경우.
  3. 식물 단백질을 침전
    1. 각 샘플 솔루션에 리트머스 종이 담거 서 5.8 M HCl. 확인 ~ 7의 pH의 11 µ L을 추가 하 여 표면에 뜨는 해결책의 pH를 중화.
      주의: 염 산 (피부 응용 프로그램 또는 흡입) 피부 접촉 시 화상 일으킬 수 있는 강한 부식성 산 이다. HCl을 처리 하는 동안 피부 자극을 방지 하기 위해 장갑을 착용 합니다.
    2. 각 관에 100 %trichloroacetic 산 (TCA)의 90 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 튜브를 품 어. 단백질의 강수량은 불투명 클리어에서 솔루션을 돌 것 이다. 이 분 후 발생 하지 않으면, 1 시간 동안 튜브를 냉동. 정지점, 잠재적인 이며 샘플에 저장 될 수 4 ° C 하룻밤 필요한 경우.
      주의: Trichloroacetic 산 부식성입니다. 피부와의 접촉을 방지 하 고 흡입 방지를 처리할 때 장갑을 착용 합니다.
    3. 4 ° c.에서 10 분 동안 13000 x g에서 원심 분리기 샘플 정밀한 유리 제 micropipette 팁 (동일한 팁 샘플에서 사용할 수 있습니다)에 연결 된 진공 라인을 사용 하 여 밖으로 suctioning에 의해 표면에 뜨는 TCA를 조심 스럽게 제거. 무거운 흡입을 피하 및 피 펫 팁과 펠 릿 사이의 적절 한 거리를 유지 하 여 단백질 펠 렛을 방해 하지 마십시오.
    4. -20 ℃ 아세톤의 100 µ L로 신속 하 게 펠 릿을 세척. 이 단계는 후속 Bradford 분석 실험;을 방해할 수 있는 펠 릿에서 모든 나머지 TCA를 제거 합니다. 그러나, 아세톤 아세톤 다음 신속 하 게 추출 된 펠 릿에서 5 초 이내에 추가 되어야 합니다 그래서 너무 오래 접촉에 남아 있는 경우 단백질 펠 릿을 분해 하기 시작 합니다.
    5. 아세톤 증기 두건 또는 냉장고에 튜브를 삽입 하 여 증발을 허용 한다. 다음, 각 튜브를 1 mL의 0.1 M NaOH 추가 하 여 단백질 pellet을 디졸브. 뜨거운 물에 난방의 여러 라운드를 필요할 수 있습니다 완전히 펠 릿을 녹이는 목욕, vortexing, 및 sonicating.
      참고: 더 이상 튜브 증기 두건에서 앉거나 냉장고와는 건조 알 약 얻을, 그들은 다시 solubilize 하는 것이 더 어려운. 그것은 30 분 동안 건조 한 펠 릿을 제안 하 고 아세톤의 존재에 대 한 확인 될 때까지 10-15 분 마다 아세톤 증발 했다 해제 (없음 아세톤 가스는 감지).
  4. 표준 솔루션을 혼합 하 고 알 수 없는 샘플 솔루션을 희석 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 알 수 없는 샘플의 총 단백질 함량을 계량.
    1. 소 면역 글로불린 G (IgG) 표 1 (동결 건조 된 또는 IgG 재고 솔루션 각 농도 달성 하기 위해 이온된 수와 혼합 수 있습니다)에 나열 된 농도 따라 표준 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에 표준 저장 96 잘 접시에 잘 플레이트의 A1 위치에서 triplicate 시작에서 각 IgG 표준 솔루션의 160 µ L 추가 (0 µ g / µ L에 A1, A2, A3 위치, B1, B2, b 3에서 µ 0.0125 µ g/L 위치, 등).
    2. 증류수의 950 µ L을 0.1 M NaOH의 50 µ L을 추가 하 여 희석된 NaOH 솔루션을 준비 합니다. 빈 부정적인 제어로 3 (G1, G2, G3 위치) 중에 잘 접시에이 솔루션의 60 µ L를 추가 합니다.
    3. 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 증류수의 950 µ L를 각 샘플 솔루션의 50 µ L을 추가 하 여 알 수 없는 샘플의 희석을 준비 합니다. 그런 다음, H1 위치에서 시작 하는 3 중에 잘 접시에 각 희석된 샘플의 60 µ L를 추가 합니다. 96 잘 접시 6 표준, 1 공백, 및 3 중에서 읽을 때 25 알 수 없는 샘플의 분석에 대 한 허용 해야 합니다. 각 잘 플레이트 분석 자체 IgG 표준 및 빈 샘플을 포함 해야 합니다.
    4. 모든 빈 고 알 수 없는 샘플 우물에 증류수 100 µ L를 추가 합니다. 이제 각 잘 총 160 µ L. 다중 채널 피 펫 (8 채널)를 사용 하 여 포함 한다 Coomassie 화려한 블루 G-250 단백질의 40 µ L 염색 잘 잘 플레이트의 첫 번째 열에 있는 모든 추가. 여러 번 급락 하 여 예제와 함께 염료를 혼합. 피 펫 팁 오염을 피하기 위하여 대체 다른 모든 열에 대해 반복 합니다.
      주의: Coomassie 화려한 블루 G-250 자극 하 고 피부, 눈와 접촉 또는 폐를 피해 야 한다. 피부 접촉을 방지 하기 위해 장갑을 착용 합니다. 발생 하는 피부와 접촉 하는 경우이 제품 얼룩 것입니다.
    5. 미 판 분 광 광도 계 읽기 방해할 수로 우물에 있는 모든 거품을 팝업 하는 바늘을 사용 합니다. 웰 스 사이 오염을 피하기 위하여 바늘을 청소. 5 분 동안 실 온에서 품 어 미 판 하자.
    6. 각 잘 595에서 흡 광도 값을 기록 microplate 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm.
    7. 3 빈 우물에 대 한 평균 흡 광도 기록 하 고 각 표준 및 알 수 없는 샘플 읽기에서이 값을 뺍니다. 그런 다음 각 표준 및 알 수 없는 샘플에 대 한 평균 흡 광도 기록 합니다.
      참고: 표준 곡선을 사용 하 여 각 불명된 한 견본에 있는 단백질의 양을 계산 하는 단백질에 각 표준의 마이크로 그램에 대 한 각 표준의 평균 흡 광도 떠올리게 하는 가장 쉬운 하지만 하나 단백질 농도 (μ를 플롯할 수 있습니다. g / µ L) 바람직한 경우 각 표준의. 그러나 다음 계산,, 마이크로 그램, 아니라 농도 (µ g / µ L)에 따라 표준 곡선을 참조 하십시오.
    8. 각 표준 음 (표 1)에 단백질의 총 금액에 대해 각 표준의 평균 흡 광도 플롯 합니다. 이러한 데이터에 선형 회귀선 적합 하 고 잘 평균 흡 광도 (그림 1a)에 따라 각 알 수 없는 샘플에서 (µ g) 단백질의 양을 계산 하는 방정식을 사용 하 여.
      참고:이 줄의 상관 계수 (r 값) 보다 큰 0.98 정기적으로 0.99 근처 이어야 한다. 표준 회귀 각 접시에 적용 됩니다, 그리고 각 접시에 알 수 없는 샘플 웰 스를 별도로 분석 해야 따라서.
    9. 단백질의 평균 금액은 각 알 수 없는 샘플 잘 계산 됩니다, 일단 다음 방정식을 사용 하 여 각 원래 샘플에서 (µ g) 단백질의 총 금액을 계산 하.
      Mp = (((Wp/60) x 1000) / 50) * 1000
      Mp = 원래 견본에 있는 단백질의 µ g
      Wp 잘 불명된 한 견본에 있는 단백질의 µ g =
      1. 다음, 다음 수식을 사용 하 여 각 샘플에서 단백질의 비율을 결정.
        Pp = ((Mp/1000) /Mi) * 100
        Pp = 샘플에서 % 단백질
        M나 샘플 (mg)의 초기 질량 =
        참고: 경우에 따라 샘플 위 흡 광도 임계값을 능가 수 있습니다. 그렇다면, 샘플 솔루션 필요할 수 있습니다 추가 희석 단계 2.4.3에서.
        다음 후속 계산에 추가 희석에 대 한 차지 해야 합니다. 일부 microplate 리더 브랜드는 또한 자동으로 표준 곡선 데이터에 따라 각 알 수 없는 샘플의 평균 단백질 농도 계산 하는 컴퓨터 소프트웨어를 제공 합니다.

3. 소화 되기 쉬운 탄수화물 분석 결과

  1. 샘플 준비
    1. 각 조직의 약 20mg 각 복제 샘플 무게를 다 십시오, 스크류 캡 고무 줄 (길이 100 m m)와 15 mL 튜브 유리에. 이후 알 수 없는 샘플으로 이러한 샘플을 지칭 합니다. 방수 마커 또는 뚜껑에 테이프 라벨 튜브 라벨 고 기록 각 샘플의 정확한 질량이이 정보 각 불명된 한 견본에 % 탄수화물을 계산 하는 데 필요한 것입니다.
  2. 알 수 없는 각 샘플에서 소화 되기 쉬운 탄수화물을 추출 합니다.
    1. 4 각 튜브와에 나사 뚜껑을 단단히 튜브 그래서 0.1 M H2의 1 mL를 추가 합니다. 1 시간 동안 끓는 물 욕조에 배치 합니다.
      주의: 황산은 매우 부식성. 그래서 H2를 처리할 때 장갑, 아이 구글, 그리고 앞치마 착용4 증기 두건에서이 단계를 수행 하 고.
    2. 미지근한 물 욕조에 튜브에서 멋진. 붓고 튜브 내용을 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (일부 식물 소재 남아 유리 튜브에 하는 경우 염려 되지 않음).
    3. 10 분간 15000 x g에서 튜브를 원심. 새 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 마이크로 pipettor와 장소 표면에 뜨는 액체를 제거 합니다. 관 수 수 냉장 하룻밤이 시점에서. 분석 결과 함께 계속, 단계 3.3.2 참조.
  3. 표준 솔루션을 혼합 하 고 알 수 없는 샘플의 총 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 계량.
    1. D(+) 포도 당 농도와 표준 솔루션 표 2에 나열 된 준비. 각 표준 솔루션의 400 µ L로 6 개의 유리 시험관을 준비 합니다.
    2. 자체 테스트 튜브에 알 수 없는 각 샘플의 15 µ L 플라스틱 고 각 시험관에서 400 µ L의 전체 볼륨에 대 한 각 증류수의 385 µ L를 추가 합니다. 증기 두건에서 각 표준 및 알 수 없는 샘플 테스트 튜브에 5% 페 놀의 400 µ L을 추가 하 고 신속 하 게 플라스틱 집중된 H2의 2 개 mL 등4 각 튜브에. 피 펫 팁 테스트 튜브 내용을 터치 하지, 그냥 화면에 추가할 솔루션 (리피터 피 펫이에 대 한 최고의 작품).
    3. 10 분 동안 품 어 관 게 그리고 신중 하 게 소용돌이 내용을 혼합 튜브. 30 분 추가 대 한 품 어.
      주의: 페 놀 및 황산 부식성 irritants 있습니다. 피부, 눈, 그리고 흡입 노출에서 보호를 포함 하는 적절 한 보호구를 사용 하 여 화학 증기 두건에서이 단계를 수행: 얼굴 방패 또는 눈 고글, 고무 장갑, 랩 앞치마, 그리고 부츠. 혼합 페 놀 황산도에서 발열 반응 결과는 뜨겁게 되 고 튜브에서 발생 합니다.
    4. 각 3 폴리스 티 렌 1.5 mL 세미 마이크로 큐 벳 (샘플 당 3 기술 복제)의 각 관에서 샘플의 800 µ L 플라스틱. 490에서 읽을 분 광 광도 계를 설정 nm. 포함 된 증류수 표준 또는 알 수 없는 샘플, 읽기 전에 간헐적으로 샘플 읽기에 걸쳐 빈 베트를 보정. 분 광 광도 계를 통해 각 베트를 실행 하 고는 흡 광도 기록. 기술에 걸쳐 평균 각 알 수 없는 샘플에 대 한 복제합니다.
      참고: 경우에 따라 샘플 위 흡 광도 임계값을 능가 수 있습니다. 그렇다면, 샘플 단계 3.2.3에 희석 한다. 희석도 후속 계산에 대 한 차지 해야 합니다.
    5. 각 표준에 대 한 평균 흡 광도 계산 합니다.
      참고: 표준 곡선을 사용 하 여 각 알 수 없는 샘플에 총 소화 되기 쉬운 탄수화물의 양을 계산 하는 D (+) 포도 당 각 표준에의 마이크로 그램에 대 한 각 표준의 평균 흡 광도 복귀 하기 쉬운 하지만 하나 또한 수 있습니다. 바람직한 경우 각 표준의 D (+) 포도 당 농도 (µ g / µ L)를 플롯 합니다. 그러나 다음 계산,, 마이크로 그램, 아니라 농도 (µ g / µ L)에 따라 표준 곡선을 참조 하십시오.
    6. 각 표준 솔루션에서 D (+) 포도 당 (µ g)의 총 금액에 대 한 평균 흡 광도 그려서 표준 곡선을 계산 합니다. 이러한 데이터에 선형 회귀선 적합 하 고 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 각 알 수 없는 샘플에서 (µ g) 탄수화물의 총 금액을 계산:
      Mc = (((x -A b)/m)/(15)) * 1000
      Mc 샘플에서 탄수화물의 µ g =
      X = 알 수 없는 샘플의 평균 흡 광도
      b = y-절편 (표준 회귀 선)
      m = 경사 (표준 회귀 선)
      이 라인의 상관 계수 보다 큰 0.98 정기적으로 0.99 근처 이어야 한다. 다음, 다음 수식을 사용 하 여 각 샘플에서 탄수화물의 비율을 결정.
      Pc = ((Mc/1000) / (Mi)) * 100
      Pc % 탄수화물 =
      M나 샘플 (mg)의 초기 질량 =

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결과

이러한 방법의 유용성을 표시 하려면 우리는 수용 성 단백질 및 4 개의 다른 분야와 곤충 herbivores에 대 한 개별 잠재적인 영양 자원 역할 sweetcorn 조직의 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠를 분석 했다. 우리는 미국 (미네소타, 노스캐롤라이나, 텍사스)에서 3 개의 농업 지역에서 옥수수의 귀를 수집 달콤한 옥수수 (즉, genotypes)의 5 개의 다른 다양성 및 한의 다양 한 필드 옥수수는 outgroup로 포괄. 표 3 옥수수 샘플 및 그들이 수집에 대 한 요약을 보여 줍니다. 모든 품종 완성도, 수집 하지만 품종 간의 발달 차이 그들은 아니었다 심기 후 같은 날에 수집 된 모든. 우리는 신속 하 게 (수정된 잎 둘러싸고 cob) 껍질을 분리 하 여 별개 조직으로 귀를 처리 하 고 방법에 표시 된 모든 조직으로-80 ° C에서 저장 하기 전에 귀에서 실크 (빛나는 섬유 껍질과 커널 사이). 각 조직 했다...

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토론

효과적인 식물 관련 추출 프로토콜 확고 색도계 분석 실험을 결합 함으로써 여기 설명 하는 분석 실험 공장 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠를 측정 하기 위한 합리적이 고 정확한 방법을 제공 합니다. 우리의 결과 옥수수를 사용 하 여 모형 다른 생물학으로 관련 공간 스케일에서 정확한 측정을 얻기 위해 이러한 프로토콜을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 예를 들어 우리 공장 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 지리적 지역, 종류 (또는 genotypes), 조직 유형, 그리고 심지어 공간 분리 조직 간의 차이 감지할 수 있었다. 모두 분석을 할 수 있는 일반적인 실험실 장비 및 시 약, 요구만 기본적인 실험실 기술를 사용 하 고 짧은 시간 내 샘플 (50-75)의 비교적 큰 숫자를 분석할 수 있습니다.

비록 상대적으로 쉽게 수행 하기 위해, 몇 가지 단계, 다른 사람 보다 더 중요 한 그리고 제대로 수행 하는 경우는 결과의 정확도 제한할 수 있습니다. 예...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

달콤한 옥수수 필드 컬렉션 도움을 우리의 공동 작업자의 모든 감사 러 벅, 텍사스의 도미 닉 Reisig와 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 댄 모트와 텍사스 A & M 대학에서 팻 포터를 포함 합니다. 감사 피오나 Clissold 프로토콜을 최적화 하 고 제공 하는이 원고를 편집. 이 작품 텍사스 A에 의해 부분적으로 지원 되었다 & M C. Everette Salyer 친목 (곤충학과)과 생명 공학 위험 평가 그랜트 프로그램 경쟁 미국 농 무부에서 no. 2015-33522-24099 부여 (가스에 게 수 여 하 고 STB)입니다.

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마이크로플레이트 리더(분광 광도계)Bio-Rad모델 680 XR
Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축Bio-Rad#5000006450mL
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참고문헌

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