카페인 추출, 효소 활동 및 식물 세포 정지에서 카페인 Synthase의 유전자 발현

요약

이 프로토콜 추출 및 C. arabica L.의 셀 정지에 카페인의 정량화에 대 한 효율적인 방법론과 식 수준으로 카페인 synthase의 효소 활동을 평가 하기 위한 실험 과정에 설명 합니다. 이 효소를 인코딩하는 유전자.

초록

카페인 (1,3,7-trimethylxanthine)은 커피와 차 등 인기 있는 음료에는 퓨 린 알칼로이드 이다. 항균 성 활동은 자연 살충제로 간주 됩니다 때문에이 2 차 대사 산물 화학 방어로 간주 됩니다. 카페인 또한 주변 식물의 성장을 방지 하는 부정적인 allelopathic 효과 생성할 수 있습니다. 또한, 전 세계의 사람들이 그것의 진통 및 stimulatory 효과 대 한 카페인 소비. 때문에 카페인의 기술 응용 프로그램에 대 한 관심,이 화합물의 생 합성 통로 대 한 연구는 성장 했다. 이러한 연구는 카페인의 생 합성을 조절 하는 생 화 학적 및 분자 메커니즘을 이해에 주로 집중 했다. 조직 문화를 체 외에서 이 생 합성 통로 공부에 대 한 유용한 시스템 되고있다. 이 문서는 C. arabica L. 그것의 활동의 셀 정지에 카페인 synthase (CS) 인코딩 유전자 (CCS1)의 증명서 수준 측정에 대 한 카페인의 정량화에 대 한 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

서론

카페인은 이다 biosynthesized Coffea¹속의 식물 이차 대사 산물. 이 알칼로이드 methylxanthine 가족에 속하는 그리고 그것 병원 체와 herbivores^2,3의 부작용에 대 한 역할을 할 수 있기 때문에 화학 공장으로 간주 됩니다. 또한,이 대사 산물은 일반적으로 소모한 전세계^4,5커피 음료의 자극 속성에 대 한 책임. 그것의 속성으로 인해 여러 연구 그룹 생 합성 통로 카페인^6,7의 놓을 공부에 관심이. 현재, 식물 체 외에서 세포/조직 문화 다양 한 생물과 비 생물 적인 전략^8,9에서 카페인 축적을 평가 하기 위한 대체 역할을 합니다.

카페인 생 합성 포함 다음 주문된 N해당 ribose nucleoside에서 7 methylxanthine의 가수분해 릴리스-3-1 위치에서 methylations. 특정 S-adenosyl 메티오닌 (SAM)-종속 N-methyltransferase (NMT) 반면 7, 위치에 메 틸 화를 catalyzes 브로민 synthase (TS) 및 CS 관련에 3-고 1-methylations, 각각, 테오 브로민 제제 생산 및 카페인입니다. 고유한 NMTs를 인코딩 하는 유전자의 연구는 카페인 생산^10,11을 조절 하는 메커니즘을 이해 수 있다. N-methyltransferase 활동이 CS 카페인¹¹의 생 합성 통로의 마지막 두 단계를 catalyzes. 커피 나무 묘 목에 그것 보였다 빛 방사선 카페인 생 합성 증가 귀착되는 CS 활동을 증가할 수 있다. 최근에, 우리는 가벼운 방사선 조사에서 C. arabica L.의 셀 정지의 유지 보수는 abiotic 스트레스 요인을 카페인⁸의 생 합성 통로 영향을 미치는 생산 효과 평가 하기 위한 최적의 조건을 보였다. 이러한 연구에서 얻은 정보 같은 생체 외에서 시스템에 카페인 생 합성 통로의 연구를 극대화 하기 위한 대사 공학 및 시스템 생물학에 응용 프로그램을 할 수 있습니다.

카페인 생 합성의 연구에 대 한 적합 한 모델의 장점을 감안할 때, 우리 C. arabica L. 셀 정지에 카페인 추출 조건 최적화 그것은 또한 유전자 사본 Coffea 카페인 synthase 1 (CCS1) 인코딩이 효소의 수준을 평가 하기 위한 방법론 단계 뿐만 아니라 효소 활동 공부에 대 한 유용한 프로토콜을 개발할 수 있습니다. 여기, 우리는 추출 하 고 얇은 층 크로마토그래피와 densitometry (TLC densitometry) C. arabica 셀 정지에 카페인을 계량 프로토콜을 보고 합니다.

프로토콜

1. C. arabica L.의 셀 정지에서 카페인 추출

1. C. arabica 셀 정지⁹를 사용 합니다. 연속 광원 (8.3 W/m²) 25 ° C에서 흔들어 상수 100 rpm 격주 비주류 pH 4.3에서 Skoog와 村 重 매체에 의해 정지를 유지 합니다.
2. 11 µ m 기 공 필터 종이 부 흐 너 깔때기를 사용 하 여 진공 여과에서 세포를 수확.
3. 등록 규모를 사용 하 여 수집 된 셀의 신선한 무게, 알루미늄 호 일에 그들을 포장, 액체 질소에서 그들을 멈추게 하 고 분석까지-80 ° C에서 그들을 유지.
4. 72 h에 대 한 냉동된 세포 자료 lyophilize
5. 건조 중량 수율을 추정 하기 위해서는 동결 건조 된 셀의 무게를 등록 합니다.
6. 재사용 가능한 폴 리 에틸렌 봉투 (9 cm x 7.5 cm)에 가루 재료를 저장 합니다. 사용까지 정밀한 분말을 한 desiccator에 게 자료를 macerate.
7. 분석 규모 건조 세포 물질의 0.5 g을 측정 하 고 유리 플라스 크 (25 mL)에 그것을 추가.
   1. 동결 건조 된 셀에 아세톤 10 mL을 추가 하 고 30 대와 동 믹서에서 혼합 균질에 대 한 s. 다음, 플라스 크 알루미늄 호 일로 밀봉.
   2. 회전자를 사용 하 여 5 h를 실 온 (25 ° C)에서 100 rpm에서 혼합.
8. 15 mL 원뿔 튜브 및 13000 x g 에서 원심 분리기는 10 분 전송 액체 단계 새로운 튜브에 그것에 감소에 대 한 모든 자료를 전송 증기 두건에서 실 온에서 건조.
9. 아세톤의 25 µ L로 샘플 resuspend

2. 얇은 하 여 카페인의 평가 대 한 조건 층 크로마토그래피 (TLC)-Densitometry

1. 이전 resuspended 카페인 추출의 1 µ L 고정 단계에 적용 됩니다.
   참고: 실리 카 젤 번호판 (F254) 고정 위상으로 사용 됩니다. 적용 하기 전에 샘플, 번호판 크로마토그래피 챔버에 클로 프롬-메탄올 [9:1 v/v]의 10 mL와 함께 개발 되었다 (14 cm x 12 cm x 9.5 cm), 판 상 온에서 건조 되었다. 샘플 적용 됩니다 컬럼에 플레이트의 특성은 그림 1에 표시 됩니다. 챔버는 접시를 개발 하기 전에 용 매와 30 분 동안 포화 되었다. TLC 판 오염을 피하기 위하여 장갑을 사용 하 여 처리 해야 합니다.
2. 모바일 위상 cyclohexane 아세톤 [40:50 v/v]의 10 mL와 크로마토그래피 챔버에 TLC를 개발 합니다.
   참고:이 혼합 0.34의 보존 팩터 (Rf) 카페인의 분리 수 있습니다.
   1. 상공에서 TLC 판을 제거 하 고 실 온에서 완전히 건조 보자.
3. 짧은 파장의 자외선 빛에 카페인 밴드 시각화 (UV, 254 nm). 소형 UV 램프를 사용 합니다. 또한,이 단계 사용 하 여 UV 보호 고글.
4. 273에서 densitometry에 의해 카페인 레벨을 계량 nm. 악기는 크로마토그래피 소프트웨어 제어 됩니다.

3. Ribonucleic 산 (RNA) 절연

1. 1.1 단계와 필터 종이 (11 µ m 기 공 크기) 진공 여과 액에서 세포 정지를 가져가 라.
2. 필터 종이에서 셀룰러 자료를 수집 하 고 분석 균형에 세포질 물자의 0.5 g으로 무게 알루미늄 호 일에 그것을 포장. 액체 N₂샘플을 동결.
3. 액체 질소로 도자기 박격포에 셀 샘플을 macerate 하 고 RNA 격리 시 약까지 무 균의 1 mL를 추가 합니다.
   참고: 소독 300 ° C에 휩 싸이 다 용광로에서 도자기 박격포 6 h. RNA 격리 시 페 놀, guanidine isothiocyanate 및 다른 구성 요소를 포함.
   1. 살 균 microcentrifuge 튜브 (1.5 mL)에 500 µ L의 샘플을 전송 합니다. 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1)의 300 µ L equilibrated 페 놀 (pH 8.0)의 300 μ를 추가 합니다.
4. 와 동 믹서와 샘플을 믹스 하 고 4 ° c.에 15 분 동안 20000 x g 에서 원심
5. Microcentrifuge 튜브를 상위 단계의 300 μ를 전송 합니다. 소 프로 파 놀의 200 μ를 추가 합니다. 1 h-20 ° c.에 대 한 튜브를 품 어
6. 12000 x g 4 ° C에서 10 분 동안에 관을 원심 그리고 액체 단계를 가만히 따르다.
   1. 튜브에 펠 릿을 형성 하기 위하여 에탄올 (70%)의 1 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 12000 x g 에서 centrifuge 그리고 가만히 따르다. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
7. 건조 실 온 (25 ° C)에서 1.5 h에 대 한 샘플. Resuspend diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 25 μ와 RNA 추출 물-물 처리.
   참고: RNA 추출 물 0.1% DEPC v/v로 치료 사용 합니다.

4. Deoxyribonuclease (DNase)와 RNA 사본을의 외피

1. 살 균 microcentrifuge 관으로 총 RNA의 2 µ g 추출 추가 합니다. 10 x 반응 버퍼 (100 mM Tris HCl 25 m m MgCl₂, 1mm CaCl₂)의 1 μ를 추가 합니다. 1 U / µ L DNase의 1 μ를 추가 합니다.
   1. DEPC 처리 물으로 10 μ의 최종 볼륨을 반응을. 믹스 샘플, 1 분 동안 짧게 2000 x g 에서 원심 분리기.
2. 30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
3. 50 m m disodium ethylenediaminetetraacetate이 수화물 (나₂EDTA)의 1 μ의 추가 함께 반응 중지 하 고 10 분 동안 65 ° C에서 샘플을 품 어.
4. Agarose 젤 전기 이동 법으로 RNA의 무결성을 분석 합니다.
   1. 표준 1 %agarose 젤 준비 하 고 핵 산 얼룩 솔루션 intercalating x 3의 1 µ L와 얼룩.
   2. 500 적용 RNA의 ng는 agarose에 젤 고 젤을 실행.
   3. 젤 사진 문서 시스템을 사용 하 여 RNA의 무결성을 시각화.
   4. 의해 역전사 cDNA 합성에 대 한 템플릿으로 RNA 사용 합니다.

5. 보완 Deoxyribonucleic Acid (cDNA) 합성

1. Microcentrifuge 튜브를 총 RNA의 2.5 μ g를 추가 합니다. 올리고-deoxythymine (dT) 뇌관의 1 μ 더하고 nuclease 무료 물 관 13 μ 최종 볼륨을 채워. 샘플을 혼합 하 고 1 분 동안 2000 x g 원심.
2. 그리고 2 분 동안 4 ° C에서 65 ° C 5 분에서 샘플을 품 어.
3. 역전사 효소, deoxynucleotide 된 (dNTPs) 믹스 (각 dNTP의 10 m m)의 2 μ 및 역전사 (200 U / µ L)의 1 μ에 사용 되는 반응 버퍼 x 5의 4 μ를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 1 분 동안 2000 x g 에서 원심.
4. 그리고 10 분 동안 70 ° C에서 50 분 동안 45 ° C에서 샘플을 품 어.
5. CDNA 농도 UV 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량.
6. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 대 한 템플릿으로 cDNA를 사용 합니다.
   참고: 반응 버퍼 10으로 사용 되었다 (4.1.1 단계) x 5 x 번 집중 (5.3 단계), 각각.

6. 실시간 양이 많은 PCR (정량) CCS1 유전자 증폭

1. PCR microcentrifuge 튜브를 5-카-X-rhodamine (ROX)의 Taq DNA 중 합 효소 (0.1 U/mL) x 2, 0.1 μ M의 7.5 μ를 추가 합니다.
   참고:는 뜨거운 시작 Taq DNA 중 합 효소 2 x 2 x 집중 솔루션으로 사용 되었다.
   1. Nuclease 무료 물 5 μ를 추가 합니다.
   2. CCS1 (AB086414) 유전자를 증폭 하는 10 μ M 앞으로 역 뇌관의 각 0.75 μ 추가 (앞으로: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3'와 역: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Tubulin에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 별도 반응에 집 유지 유전자로 (앞으로: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3'와 역: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')⁹.
   3. 600 추가 cDNA 템플릿의 ng.
2. 2 분 및 5 분 동안 95 ° C 하 30 95 ° C의 40 주기 위한 실시간 PCR 시스템에 반응 품 어 50 ° C에서 증폭 반응을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s와 72 ° C 30에 대 한 s.
3. 50 ° C에서 샘플을 품 어 30 s 및 20 ° C 10에 대 한 s.
4. PCR 소프트웨어와 데이터를 분석 합니다.
5. 2 상대 식 계산-^ΔΔCT 방법 설명 Livak 및 Schmittgen (2001)¹².
   참고: 오염 제거 시 약 또는 확대 뇌관 이합체 DNA 서식 파일 (서식 파일 통제, NTC) 제외한 모든 구성 요소를 포함 하는 컨트롤 반응 분석.

7. 총 단백질 추출 L. C. arabica 세포 현 탁 액의

1. 중간-기 공 필터 종이 진공 아래 셀 정지를 필터링 합니다.
2. 1 g 세포 물자의 무게 그리고 알루미늄 호 일에 그것을 포장.
   1. 액체 질소로 샘플을 동결. 정밀한 분말을 얻기 위해 소독된 도자기 박격포에 샘플 macerate
3. 유리 유리병에 샘플을 전송 하 고 2.5 mL의 추출 버퍼 (400 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane 염 산 염 (Tris HCl), pH 8.0, 10 m m β-mercaptoethanol, 5mm 나₂EDTA 및 0.5% (w/v) 나트륨 하는데에 추가.
   1. 2 분 동안 소용돌이 믹서에 샘플을 믹스.
      참고: 샘플은 단백질 변성을 방지 하기 위해 얼음에 보관 중요 하다.
4. 4 ° C에서 20 분 20000 x g 에서 샘플 원심 고 극저온 튜브 (2 mL)에 500 µ L aliquots를 전송. 사용까지-72 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
5. 562에서 샘플의 단백질 농도 측정 표준으로 소 혈 청 알 부 민으로 bicinchoninic 산 분석 결과 사용 하 여 분 광 광도 계에 nm.

8. 효소 분석 결과 카페인 Synthase에 대 한

1. 200 µ M 샘, 메 틸 [³H]의 4.07 kBq 포함 microcentrifuge 튜브에 반응 혼합물 준비-샘, 200 µ M 브로민, 200 µ M MgCl₂및 5 µ M 카페인. PH 8.0에서 100 mM Tris HCl와 200 µ L 볼륨을 증가.
2. 얼음에 microcentrifuge 관을 유지 하 고 단백질의 밀리 그램 7-9를 포함 하는 수용 성 분수의 볼륨을 추가. 그런 다음, 소용돌이 의해 혼합 하 고 서 모스 탯 목욕/circulator에 30 ° C에서 30 분 동안 품 어. 여러 샘플의 일괄 처리에 대 한 충분 한 시간 30 분의 정확한 기간에 모든 샘플에 대 한 반응을 중지을 주고 1 분 기간에 중복에서 각 샘플을 품 어.
   1. 반응을 중지 하 고 소용돌이 믹서와 샘플을 흔들 다음 클로 프롬의 1 mL를 추가 합니다. 용 매에 방사성 카페인을 제거 하려면 3 분 소용돌이 믹서를 사용 하 여 샘플을 흔들어.
3. 샘플 5 분 11000 x g 에서 원심 하 고 신중 하 게 900 µ L의 볼륨을 복구 합니다. 그런 다음, 섬광 튜브 샘플 전송.
4. 상 온 25 ° c.에 후드에 건조를 완료 하는 데 클로 프롬을 증발 유리병에 섬광 액체의 5 mL을 추가 하 고 샘플을 혼합.
5. 섬광 카운터에 카페인에 통합 하는 방사능을 분석 합니다.

결과

여기에 제시 된 과정을 통해 얻은 카페인 추출 쓰는 그림 1에 표시 된 스키마에 따라 착 색 인쇄기 격판덮개를 샘플 하 여 TLC densitometry에 의해 분석 되었다. 이 화합물은 상업 표준의 다양 한 농도와 세포 추출 물에는 카페인, 곡선의 수준을 계량 (그림 2A)를 사용 합니다. 카페인에 대 한 흡 광도의 패턴 가시 광선 스펙트럼 (UV-VI) 273에서 최대 흡수 피크를 사용 하 여 분석 되었다 (그림 2B), 및 TLC 판에 카페인의 피크 분리 0.34 0.39 (그림 2C) 사이의 Rf 보였다.

이 프로토콜을 사용 하 여 평가 하는 카...

토론

우리가 현재 여기 카페인 콘텐츠를 평가 하기 위한 최적의 조건, CS 활동 및 수준에서 생체 외에서 식물 조직 배양, C. arabica의 셀 정지 등. 이전 보고서 유지 셀 빛 조사 하 고 문화 매체에 테오 브로민 제제의 존재는 카페인, 카페인 분리 방법을 평가 수의 수준을 높이기 위한 적합 한 매개 변수 확인 반전 단계 고성능 액체 착 색 인쇄기 (HPLC RP)를 사용 하 여. 현재, 셀 정지 생 합성 카페인 공부에 대 한 경제적 장점을 가진 간단 하 고 빠른 방법을 사용 하는 몇 가지 보고 있다. 여기, 대체 평가 사용 하 여 TLC densitometry 셀 추출 물에 카페인의 정량 분석에 대 한 효율적인 카페인에 대 한 분리 방법을 보였다. 셀에 카페인을 평가 하는 문화 셀 보고^14,15이전에 테오 브로민 제제를 피드 하는 데 필요한 아니었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
무라시게 & Skoog 기초 염 혼합물	PhytoTechnology Laboratories	M524	팩 크기: 50 L 시약 (mg/L) 암모늄 나이트레이트 (1650) 붕산 (6.2) 염화칼슘, 무수 (322.2) 염화코발트 & 황소; H2O (0.025) Cupric Sulfate• 5H2O (0.025) Na2EDTA• 2H2O (37.26) 철황산염&황소; 7H2O (27.8) 황산 마그네슘, 무수 (180.7) 황산 망간&황산; H2O (16.9) 몰리브딕산 (나트륨 소금)• 2H2O (0.25) 요오드화 칼륨 (0.83) 질산 칼륨 (1900) 인산 칼륨, Monobasic (170) 아연 황산염 & 황산; 7H2O (8.6) myo-inositol (100) 티아민 (10) 시스테인 (25) 자당 (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeine	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS 평면 크로마토그래피 관리자 소프트웨어	CAMAG	1.4.10	소프트웨어
이소아밀 알코올 (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
시클로헥산	JALMEX	C4375-13	1 L
아세톤	J.T. BAKER		900643 4 L
메탄올	J.T. BAKER	9093-03	4 L
클로로포름	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC 실리카겔 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC 플레이트
&베타;-메르캅토에탄올	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-나트륨 L-아스코르브산염	A4034	SIGMA	100 g
트리즈마 베이스	SIGMA	T6066	1 Kg
염산 36.5-38%	J.T. 베이커	9535-05	2.5 L
피어스 BCA 단백질 분석 키트	Thermo scientific	232227	키트
메틸 [3H]-S-아데노실 메티오닌	Perkin Elmer	NET155	15 Ci/mmol
액체 섬광 바이알	SIGMA	Z253081
온도 조절 수조/순환기	Cole Parmer	60714
마이크로 원심분리기	튜브Eppendorf		튜브 1.5 mL
극저온 바이알	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
원심분리기 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
도자기 모르타르	Fisherbrand	FB961B
여과지	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
분석 저울	및	HR-120	모델 HR-120
섬광 카운터	Beckman Coulter	6500
젤 사진 문서화 시스템	Bio-Rad	Chemic XRS	모델 Chemic XRS
컴팩트 UV 램프	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner 깔때기	SIGMA	2419907	Type 37600 믹서
TRIzol 시약	Thermo scientific	15596-018	200 mL
ReverdAid 역전사 효소	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 프라이머	Thermo scientific	#S0131	100 µ M
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
염화마그네슘	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
에틸렌디아민테트라아세트산	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR 마스터 믹스 (2X)	Thermo scientific	K0251	25 µ의 200 회 반응; L
PikoReal	Thermo scientific	2.2	소프트웨어
페놀, pH 8.0, 평형, 분자 생물학 등급, 초순수	USB	J75829	100 mL
이소프로필 알코올	Karal	2040	1 L
에틸 알코올	SIGMA	64175	1 L
디에틸 피로카보네이	SIGMA	D5758	100 mL
실험실 회전자	LW 사이언티픽	Mod. LW210