방법 논문

쥐에 있는 일반적인 경 동맥 수리 통해 Reperfusion를 허용 하는 중간 대뇌 동맥 폐색

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DOI:

10.3791/58191

⸱

2019년 1월 23일

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Psychology and Behaviour, University of Leicester, 2Preclinical Imaging Facility, Core Biotechnology Services, University of Leicester, 3School of Psychology, University of Nottingham

이 논문에서

요약

중간 대뇌 동맥의 Intraluminal 필 라 멘 트 폐색 설치류 실험 뇌졸중의 가장 자주 사용 된 vivo에서 모델입니다. 일반적인 경 동맥 복구를 허용 하는 다른 수술 접근 여기, 일반적인 경 동맥의 reperfusion 및 중간 대뇌 동맥 영역 전체 reperfusion 수 있습니다 수행 됩니다.

초록

허 혈 성 뇌졸중 성인 장기 장애 및 죽음은 전세계의 주요 원인입니다. 현재 치료 가능한만 조직 플라스 미노 겐 활성 제 (tPA) 허 혈 성 뇌졸중을 대상으로 승인 된 약물 치료와 함께 제한 됩니다. 허 혈 성 뇌졸중의 분야에서 현재 연구 개발 하 고 새로운 제약 대상 조사 선의 이상 더 나은 이해에 집중 한다. 신뢰할 수 있는 실험 선 모델은 잠재적인 치료의 진행에 대 한 중요 한. 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델 임상 관련 이며 가장 자주 설치류에서의 뇌경색 수술 모델을 사용 합니다. 그러나, 병 변 볼륨 등이 모델의 결과 다양성, 특히 쥐의 상부와 연결 됩니다. 여기에 설명 된 대체 MCAO 모델에서는 일반적인 경 동맥 (CCA)의 reperfusion와 배, 그리고는 향상 된 복구 fibrinogen 기반 실 란 트와 조직 패드를 사용 하 여 중간 대뇌 동맥 (MCA) 영토의 증가 관류 외부 경 동맥 (ECA) 결 찰을 피 함으로써 쥐의 복지. 이 마우스에 변수 해부학 높은 것으로 알려져 있다 윌리스의 원형에 대 한 의존도 줄일 수 있습니다. 대표적인 데이터는 전통적인 MCAO 접근 및 여기에 설명 된 대체 접근 사이 병 변 양에 있는 변화를 감소이 대체 수술 방법을 사용 하 여 보여줍니다.

서론

대뇌 치기의 주요 원인은 중간 대뇌 동맥의 영토에 초점 국 소 빈 혈 이다. 조직 플라스 미노 겐 활성 제 (tPA)는 수많은 임상 약물 실험 대상으로 뇌경색1,2하에 불구 하 고 입증 된 효능 함께 사용할 수만 약리학 처리 이다. 그러나, 안전 관심사 및 좁은 치료 창 (< 4.5 h)의 모든 뇌졸중 환자 ~ 15%만 tPA, 받을 수 있습니다 하 고 recanalization 요금 < 503,4수 있습니다 키를 누릅니다.

스트로크의 재현할 수 및 임상 관련 동물 모델 알려 새로운와 잠재적인 뇌졸중 치료 치료의 개발에 필수적인 간주 됩니다. 그러나, 일관성 및 동물 모델 결과에 변화에 대 한 우려로 인해 병원에 전 임상 연구에서 번역을 개선 하기 위해 기존 vivo에서 모델을 수정 하는 것이 중요 남아 있습니다. 임상 사용의 잠재적인 치료 전 임상 실험 효능에서 번역의 부족은 뇌졸중 연구5에 대 한 지속적인 관심사 이다. 번역의 오류에 대 한 이유는 여러 될 것 하 고 관련이 있을 수 있습니다, 예를 들어 시험 설계, 치료 지연, 임상 획이 고 동물 모델의 한계 사용6. 뇌졸중 연구를 위한 핵심 과제 안전 하 고 효과적인 치료의 개발에 남아 있다.

Intraluminal 필 라 멘 트 삽입에 의해 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)는 가장 자주 사용 된 vivo에서 설치류 모델 실험 선의. 이 모델에는 허 혈 유도, 인간의 선7에서 발생 하는 이벤트를 흉내 낸 후 혈액 흐름의 복원을 수 있습니다. 그러나, 특히 쥐, 다양 한 표준 편차와 다른 유형의 병 변 볼륨 발생 정의 하더라도 수술 프로토콜 적용된8,,910합니다. 그것은 전형적인 작은 striatal 및 큰 striato 외피 병 변의 볼륨11의 모달 분포를 볼 수입니다. 허 혈을 유도 하는 필 라 멘 트 일반적으로 CCA 또는 다음 영구적으로 합자12남아 있는 ECA의 절 개를 통해 삽입 됩니다. CCA의 영구 결 찰 내부 경 동맥 (ICA)와, 그 후, MCA 영역에 혈액 흐름의 재건 립을 방지합니다. 윌리스의 원형 (소) 내에서 부수적인 공급에 의존 하는 reperfusion을 발생 합니다. 암소 구조는 C57BL/6 마우스는 스트레인 뇌졸중 연구13 vivo에서 일반적으로 사용에 특히 개별 동물 사이의 해부학 적 변화. ECA를 통해 필 라 멘 트 삽입의 다른 방법, CCA, 하지만이 방법은 타협을 통해 지속적인된 관류에서는에 표시 되었습니다, 쥐, 동물의에 해로운 효과가 ECA 지역 동맥 공급 웰빙14.

부수적인 공급 및 설립된 MCAO 모델에서 reperfusion 암소에 대 한 의존도, 부분적으로, 다음 폐색 병 변 볼륨 변화에 대 한 계정. 따라서 허용 CCA, 암소의 독립을 통해 reperfusion ECA 결 찰은 피할 수 및 CCA 절 개, 수리는 다른 murine 외과 절차를 설명 합니다. CCA 절 개 수리 이전 보였다 쥐에 CCA15통해 성공적인 reperfusion 귀착되 기 위하여. 우리 마우스11 에서 성공적으로이 방법을 적용 하 고 여기 프로토콜 병 변, 실험 선 연구에 사용 되는 주요 결과 측정에에서 감소 된 가변성에 어떤 결과 보고 합니다.

이 프로토콜 MCAO reperfusion를 허용 하는 조직 패드 및 실 란 트 응용 프로그램을 포함 하는 CCA 선박 수리 뒤 CCA 배 필 라 멘 트 삽입을 통해 수행 하는 방법을 보여 줍니다.

프로토콜

이 프로토콜 및 데이터 보고 및 기관 윤리 승인에 따라 영국 동물 (과학적인 절차) 행위 1986 (프로젝트 라이센스 60/4315)에 따라 실시 했다. 모든 실험 동물 연구에 따라 보고 됩니다: Vivo에서 실험 (도착) 지침16의 보고.

1입니다. 준비

  1. 성인 남성 C57BL/6 쥐 수술 치료 (예, 환경, 침구, 복구 식품)을 숙지 수술 전에 적어도 48 h.
    참고: 게시물 MCAO 동물은 자주 먹고 수술 후 음주와 어려움이 있다.
    1. 수술 후 과도 한 체중 손실을 방지 하려면 순응, 어떤 게시물 MCAO 다이어트에 동물 예를 들어 새 장 바닥에 직접 재 젤, 젤, 음식과 흠뻑 젖은 정상적인 다이어트 알 약을 배치.
    2. 흰 종이 칩 등 수술 침구 케이지 침구를 변경 합니다.
  2. 수술 설정 또는 절차를 시작 하기 전에 모든 수술 도구를 소독.
    1. 이렇게 하려면 압력가 마로 소독 (121 ° C, 15 분 15 psi의 최소)와 도구 또는 에틸렌 산화물 (8-10 h에 대 한 올바른 제조업체의 지침에 따라) 사용.
    2. 프로시저를 설정 하기 전에 모든 표면 소독. 무 균 수술 커튼 또는 압력가 호 일 수술 하는 동안 처리 해야 하는 항목에 대 한 모든 표면 커버. 절차의 기간에 대 한 무 균 기술을 사용 합니다.
      참고: 압력가 호 악기 또는 수술 하는 동안 개최 하는 장비를 사용할 수 있습니다. 멸 균 장갑과 기술을 사용 하 여, 호 일 수 적용 되 고, 메 마른 필드에 항목을 배치 하는 다음. 이 따라, 메 마른 장갑 변경 하셔야 합니다.

2. 중간 대뇌 동맥 폐색 수술

  1. 성인 남성 C57BL/6 마우스의 수술의 때에 24-31 g를 무게를 사용 합니다. O2, 빨간 플라스틱 마 취 실에서 2 L/분에 5 %isoflurane 사용 하 여 마 취를 유도.
  2. 얼굴 마스크 외과 의사의 낮은 폐품 시스템에 의해 제공 (예를 들어, 70% N2O230% O2에서 1.5-2%), 수술에 대 한 적절 한 마 취 깊이 유지 하기 위해 isoflurane 감소 유도, 다음 isoflurane에 노출입니다.
    참고: 질소 산화물 (N2O2) 사용할 수 있습니다 산소 (O2)와 함께에서 적절 한 마 취 깊이 isoflurane의 필요한 금액을 줄이기 위해.
  3. 조직의 무 통 수술 전 관리 [carprofen, 10 mg/kg 피하 (사우스)] 요정-operatively 절 개를 취 사이트 (bupivacaine, 2 mg/kg 사우스, 0.9% 식 염 수에 희석된 1시 10분).
  4. 수술 전 복 (ip.) 살 균 prewarmed 0.9 %NaCl 용액의 200 µ L의 주사에 의해 체액 관리 합니다.
  5. 오른쪽의 모피를 면도 일시적인 지역 및 작은 발기를 사용 하 여 피부를 노출 하는 복 부 목 지역. 치료는 수술 동안 건조에서 그들을 방지 하기 위해 3 분 두 눈에 적용 눈 윤 활 유에 대 한 5% 액체 솔루션을 사용 하 여 피부 영역.
    참고: 모니터 혈액 산소 포화, 심장 박동, 호흡 속도 펄스 프로브가 판독에 필요한 경우 머리의 뒷 다리를 제 모 크림을 사용 합니다. 깨끗 한 면을 사용 하 여 크림을 적용 새싹 그리고, 제 모 후 희석 액체 솔루션 지역을 씻어. 무 균 수술 필드를 오염 하는 느슨한 모피의 위험을 최소화 하기 위해 수술 영역에서이 단계를 수행 합니다. 연구원은 현지 연습에 따라 다른 수술 사이트 준비를 사용 하 여 싶을 수 있다.
  6. 외과 영역에 마우스를 이동 하 고 무 균 드 레이프에 의해 포함 하는 homeothermic 열 매트에 수 그린 위치에 두십시오. 마 취를 통해 코 콘 유지 합니다. 마우스의 온도 모니터링 하 고 37.0 ±에 그것을 유지 하는 직장 프로브 삽입 0.6 ° c.
    1. 어떤 외과 절 개 전에 뒷 발 철수 반사를 확인 하 고 마 취 깊이 확인 하는 반사를 깜박.
  7. MCA 영역에 혈액 흐름을 기록 하는 레이저 도플러 flowmetry (LDF) 프로브를 연결 합니다.
    1. 해 부 stereoscope 사용 하 여, 오른쪽 눈과 귀를 15 번 메스를 사용 하 여 노출된 시간 피부에의 중간에 < 1 ㎝의 절 개를 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 두개골을 덮고, 부드럽게 뼈에서 이것을 근 근이 고 멸 균 면봉으로 표면 건조 내부 조직 해 부.
      참고: 합니다 주의 하지 temporalis 근육 손상에.
    2. 0.7 m m, 편평한 가장자리, 도넛 모양의 프로브 홀더,이 겨 내 고 섬유의 끝에 광학 일치 하 젤의 작은 금액을 놓고 하는 날카로운 메스를 사용 하 여 그것의 끝을 잘라 LDF 모니터에 연결 하는 유연한 단일 광섬유 프로브 잡고 가져가 라.
    3. 프로브 홀더;의 아래쪽 가장자리 주위 방수 슈퍼 접착제 접착제의 작은 금액을 놓으십시오 이 부분적으로 건조 하 고 볼품 없는 될 수 있습니다.
    4. 측 뼈 위에 두개골을 건조 하 고 뼈, 하 원에서 국 소 조직 접착제의 작은 금액을 장소 충분히 프로브 홀더.
    5. 이 지역 (6 m m 옆 2mm는 bregma에서 원심)에 장소에 이미 섬유 광섬유 프로브 프로브 홀더를 배치 합니다.
    6. 접착제 건조;에 대 한 시간 허용 일단 건조 하 고 연결 된 LDF 데이터 기록을 시작 합니다.
  8. 부드럽게 넘겨 동물 부정사 위치, 레이저 도플러 프로브를 지원 하 고 그것의 초연을 방지 하도록 배려. 부드럽게 미소 한 구멍이 있는 의료 테이프, 한 켤레 면 싹 (또는 이와 유사한, 닫힌된 집게 등) 아래 지역 고 긴장을 만들 슬라이딩으로 내려 두 forepaws를 테이프. 무 균 보험을 유지 하기 위해 무 균 드 레이프와 마우스를 커버.
  9. 해 부와 노출 CCA의 시작.
    1. 15 번 메스 블레이드를 사용 하 여 노출 된 복 부 목에 1.5 c m 중간 절 개를 확인 합니다.
    2. 부드러운 둔 기 절 개 기술을 사용 하 여, 부드럽게 기도 노출 양쪽에 침 샘을 철회.
    3. 무뚝뚝한 절 개를 사용 하 여, 주변 조직과 vagal 신경에서 CCA 해 부.
      참고: vagal 신경에 손상을 이동성, 먹이, 그리고 호흡 저하 될 수 있습니다로 직접 vagal 신경을 만지지 마십시오.
  10. CCA, 선박 그리고 vagal 신경에 복 부를 등 쪽 아래 6-0 봉합 비 분해할의 섹션과 작은 (2 cm)를 전달 합니다. 외과 의사를 가까이 한 실크 넥타이 그리고 CCA (근 위 타이) 주위 단단히 묶어. 느슨하게 묶어 ICA/ECA의 분기점 방향으로 두 번째 실크 넥타이 (원심 타이).
  11. CCA의 섹션을 시작 하려면 바로 위에 원심 넥타이 하지만 분기를 방해 하지 microvascular 클립을 적용 됩니다. 마이크로 욕실이 위를 사용 하 여 CCA에 작은 구멍을 확인 합니다.
    참고:는 ECA 있어야 합니다 특허 항상. CCA 절 개 선박 및 쉽게 접근할 수 있는 복 부 위치; 폭의 더 이상 40% 이어야 합니다. 이 선박 수리 단계 게시물 MCAO에 중요 한 역할을 재생 됩니다.
  12. CCA, microvascular 클립 쪽으로 전진에 7-0 실리콘 코팅 monofilament를 삽입 합니다.
    참고: 필 라 멘 트 크기 설정 해야 합니다; 수술 전에 마우스의 무게에 따라 제조업체의 지침을 참조 하십시오.
    1. 그것 손상 없이 자리에는 필 라 멘 트를 고정 하는 원심 넥타이, 충분히 조입니다. Microvascular 클립 클립 홀더를 사용 하 여 제거 합니다.
      참고: 혈액 손실 없이 보여야 한다이 시점에서. 혈액의 역류 경우 넥타이 필 라 멘 트를 들고 꽉 충분히 않습니다.
  13. ICA에는 필 라 멘 트를 사전.
    1. 필 라 멘은 ICA 내 남아 pterygopalatine 동맥 (PPA)에 전달 하지 않습니다 확인 합니다. 이렇게 약간 해제 하 고 동물의 시체의 외부 측면에 실크 넥타이, 중 하나를 사용 하 여 CCA를 당기 그리고 PPA의 내부적으로 직면 오프닝 과거 휘게 하 필 라 멘 트를 조종.
      참고: 한 번 MCA 지점 원점에 고급, 제공 된 영토에 상대 혈에 한 방울 LDF 값;에 표시 됩니다. 이 필 라 멘 트 배치를 확인합니다.
  14. 필 라 멘 트를 안전한 장소에서 원심 실크 넥타이,이 매와 엄격한. 폐색 기간 동안 자리에 두고.
    참고: 종속 개별 프로토콜에 동물 복구 케이지로 이동할 수 있습니다, 다음 복구, 봉합 상처 또는 폐색 기간 동안 마 취 하에서 남아 있다. 후자의 경우, 상처를 살 균 prewarmed 0.9 %NaCl 식 염 수를 사용 하 여 밖으로 건조에서 삭제할 확인 하십시오.

3입니다. 후 폐색

  1. MCAO 기간의 끝에, 백색 필 라 멘 트 머리 명확 하 게 표시 될 때까지 즉시는 필 라 멘 트를 철회.
  2. 그런 다음 느슨하게 원심 CCA 충분히 제거는 필 라 멘 트 머리 대부분 선박 탈출구의 넥타이.
    참고: 필 라 멘 제거할 수 있습니다 완전히이 시점에서 의사는 혈액 손실을 방지 하기 위해 원심 넥타이 넥타이 속도와 확신 하는 경우.
  3. CCA 분기 원심 넥타이 옆으로 수평 위치에 한 microvascular 클립을 배치 합니다. 원심 넥타이 느슨하게 하 고는 필 라 멘 트를 완전히 제거. 외과 의사를 향해 근 CCA 넥타이 아래 다른 microvascular 클립을 추가 합니다.
    참고: 선박 어떤 미끄럼을 방지 하기 위해 클램프의 고정으로 충분히 멀리 확인 하십시오. 클립의 배치 클립 removers 쉬운 접근을 지키는 나중 단계 동안 필수적 이다. 클립은 더 나은 정리 및 조직 패치, 주변 근육에서 클립을 가로로 배치의 배치 수 있도록 선박을 리프트 수 있도록 사용할 수 있습니다.
  4. 조심 스럽게 뒤 몽 #5 포 셉 또는 마이크로 욕실이 위를 사용 하 여 두 실크 넥타이 제거 하 고 건조 멸 균 면봉을 사용 하 여 영역.
    참고: 배려 하지 잘라 통해/그릇을가지고 한다.
  5. 멸 균 페 트리 접시에 fibrinogen 및 트 롬 빈 실 란 트 솔루션 1과 2 ( 재료의 표참조), 2 개의 물질을 보장 유지, 별도 준비 나중 혼합 추가 합니다.
    참고: 에이전트의 단지 아주 작은 볼륨은 필수 (< 0.25 mL 각). 두 성분 사이 조기 반응을 방지 솔루션을 별도 유지 합니다. 반응 하 고 주사기 내 설정 에이전트를 발생할 것 이라고 두 개의 주사기의 교차 오염을 방지 하기 위해 제거 되었습니다 대로 뚜껑 같은 방식으로 대체 됩니다 있는지 확인 합니다. 이전에 사용,-20 ° c.에 솔루션 저장 첫 번째 수술에 대 한 필요한 경우 실내 온도에 실 란 트를 해 동. 실 란 트; refreeze 하지 마십시오 그것은 실내 온도에 있어야 하 고이 방식으로 저장할 수 있습니다. 그건 비용; 여러 수술에서 주사기를 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리가 오염을 방지 하기 위해 같은 유리병 1 주 이상 사용 하지 않는 것이 좋습니다.
  6. 조각과 더 이상 1 m m 두꺼운 근육의 최고의 섬유 따라 보장 조직 패드에 사용할 sternocleidomastoid 근육의 얇은 복 부 슬라이스를 Dumont 아니 5 집게와가 위 욕실이 마이크로 근육 따라 무딘 해 부를 사용 합니다.
    참고:로이 크게 기능 저하 됩니다 통해/전체 근육, 자르지 않는다. 조직은 CCA 절 개를 편안 하 게 커버 하기에 충분 해야 합니다.
  7. Dumont #5 집게를 사용 하 여 조직 패드 고 직물을 혼합 때 균등 하 게 두 fibrinogen 및 트 롬 빈 두 약 사이 채널을 형성 하는 실 란 트 솔루션. 응고가 빨리; 발생 합니다. 최대한 빨리 응고 시작, CCA 절 개를 조직 패드를 제거 합니다. 매체 회사 압력 및 오픈 겸 평면 아래로 조직 패드를 놓습니다.
    1. 신속 하 게 원심 microvascular 클립 부드럽게 장소에 조직 패드를 들고 아직도 하는 동안 제거.
      참고: 일부 역류를 혈액 더 활성화 fibrinogen 및 트 롬 빈 실 란 트 시 약의 수 있습니다. 그냥 충분 한 압력은 고정 패드를 완벽 하 게 선박을 차단 하지 않도록 필요.
    2. 천천히 혈액 절 개 영역에서 흐름 수 있도록 조직 패드에서 압력을 완화. 자, 천천히 그리고 부드럽게 해제 인접 microvascular 클립에서 압력을 완전히 제거 합니다.
    3. 참고: 그릇은 완전히 특허 된다 있도록 조직 패드의 배치 및 microvascular 클립 제거 발생 합니다 신속 하 게 조직 패드는 CCA의 내부 밀봉 되지 않도록. 그러나, 적은 양의 혈액 누설이 있는 경우에, 다시 응고 형성 및 씰링 발생을 위한 시간을 추가 허용 조직 패드에 가벼운 압력을 놓습니다. 혈액 누설은 실질적인 또는 조직 패드 씰링 수 나타나지 않습니다, 경우 혈액 손실을 방지 하 여 절 개 분리 하 여 추가 혈액 손실을 방지 모두 CCA microvascular 클립 교체 압력을 유지 합니다.
  8. 조직 패드 선박 봉인 하지 않습니다, 경우 두 번째 시도 할 수 있다, 단계 3.3-3.7.3 다음.
  9. 일단 배는 봉인 분해할 수 있는 6-0 봉합을 사용 하 여 상처를 봉합. LDF 녹음 수술 내내 계속 되었다, 두개골에서 LDF를 제거 하 고 봉합 상처 분해할 수를 사용 하 여 6-0 봉합.

4. 수술 치료

  1. Prewarmed 복구 케이지 (온수 선반/매트 35 ° C에서 또는 열된 챔버 내에 위치한)에 동물을 놓습니다.
    참고: 연구원은 다른 온도 현지 연습에 기간을 사용 하 여 싶을 수 있다.
  2. 제공 모든 동물 prewarmed 0.9 %NaCl 염 분 사우스 4 h 후 작업, 그리고 2 x에서 즉시 후 작업의 200 µ L 매일 72 h에 대 한.
    참고: prewarmed 0.9%의 NaCl는 동물 지도. 더 필요한 경우 더 많은 체액 좋은 복구를 보장 하기 위해 시행 수 있습니다.
  3. 복구 장에 동물 무제한 액세스 젖은 다이어트 알 약, 건조 다이어트 알 약, 재 젤, 그리고 물에 대 한 광고 libitum 액세스 함께 젤 음식을 제공.
  4. 24 시간 후 작업에 캐롤라이나 carprofen 주입을 반복 (단계 2.3 참조).
    참고: 모든 동물 받은 carprofen;의 동일한 복용량 어떤 신경 보호 효과 무시할 수 있을 것입니다.
  5. 48 h에 대 한 정기적으로 진통 더 관리 결정을 돕기 위해 통증 수준을 평가 하기 위해17 득점 수술 마우스 얼굴을 찡 그리기를 수행 합니다.
  6. 수술과 절차에 따라 다음 매일 직전 동물 무게. 매일 관찰 및 완전 한 복지 시트 그들의 음식 및 물 섭취 량과 임상 증상을 모니터링을 수행 합니다.
  7. 24 시간 및 48 h 후 운영에 기능 관측을 수행. 초점 적자 규모에 마우스를 평가 합니다. 그들의 몸 대칭, 의무적으로 돌고, 걸음 걸이, 45 ° 그리드 등반, 행동, 앞 다리 비대칭, 그리고 수염 터치 응답18,,1920도 평가 합니다.

5. 자기 공명 영상 및 이미지 처리

  1. 구조 자기 공명 영상 (MRI)를 사용 하 여 병 변 볼륨 (LV)를 측정 합니다.
    참고: 조직학 얼룩 triphenyltetrazolium 염화 (TTC)와 같은 대체 방법, 이전 사용 및 구조 MRI 데이터 연결. 그러나,이 방법만 연구 하 고 경도 하지 끝점에서 사용할 수 있습니다. 경도 MRI 스캔을 사용 하 여 연구에 필요한 동물의 수를 줄일 것입니다.
    1. 48 h, 다음, MCAO의 유도 후 (5 %isoflurane 유도 대 한 O2 의 1 L/분), 유지 보수에 대 한 1.5-2% isoflurane isoflurane와 마우스 anesthetize.
    2. MRI 요람에 마우스를 전송 하 고 그것의 호흡 속도 모니터링 하기 위한 호흡 센서에 스캔 하는 동안 그것의 온도 모니터링 하기 위한 직장 온도 프로브를 이식. 장소 2 채널 마우스 뇌 RF 신호에 대 한 두뇌에 코일 및 장소 9.4 T 수평에 요람 구멍 스캐너 합니다.
      참고: 여기, 72 m m 내부 직경을 가진 볼륨 코일은 RF 전송을 위해 사용 되었다.
    3. 빠른 스핀-에코 시퀀스를 사용 하 여 t 2가 중 검사 취득. Mm 시야 (FOV)로 반복 시간 (TR) 3000 ms 및 40 양 사용 18 18 x 에코 시간 (TE)를 설정 하 고 조각 18 m m x 0.8 m m와 약 10 분에 3 개의 신호 평균 256 x 256 수집 행렬을 얻을.
    4. 확산 텐서 영상 (DTI) 빠른 스핀-에코 시퀀스를 사용 하 여 획득. 1,730 ms에 TR, 35 ms에 테, 20 m m x 20 m m, FOV를 설정 하 고 신호 평균 16 m m x 1 m m, 2, 14 확산 인코딩 방향, 그리고 최대 b의 조각과 128 x 128 인수 매트릭스를 얻을-1024 s/m m2의 값.
    5. T 2가 중 이미지는 이미지 디스플레이 사용 하 여 소프트웨어 패키지를 측정에 LV를 측정 합니다. 함께 (MRI 스캔 하는 동안 설정) MRI 슬라이스 두께 고려 하는 동안 총 병 변 볼륨을 계산 하는 값을 정렬할 lesioned 영역을 측정 합니다.
    6. 고려 모든 붓기와 지역 병 변 볼륨의 백분율 전체 contralateral 및 동측 반구를 측정 하는 동안. 모든 뇌 병 변의 볼륨을 측정 하는 간접 메서드를 사용 하는 부 종으로 인해 붓기에 대 한 올바른 설명 이전21,22. 피 질 조직 및 전 두 엽 또는 overcorrection 피하기 위해 표준 마우스 뇌 아틀라스에 따르면 소 뇌 조직을 포함 하는 조각을 포함.
  2. 병 변 확산 매개 변수를 측정 하 고 관심의 핵심 penumbra 지역.
    1. 적절 한 MRI 분석 소프트웨어를 사용 하 여 확산 텐서 이미지에서 명백한 확산 계수 (ADC) 및 분수 이방성 (FA) 지도 생성 합니다.
    2. 이미지의 선형 등록을 수행할 수 있는 적절 한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 t 2가 중 이미지와 DTI 이미지를 맞춥니다. 등록, 다음 보급 중 병 변 마스크를 (허 혈 성 코어) (허 혈 성 코어와 penumbra) penumbra 지역 추정 병 변 t 2가 중 마스크에서 뺍니다. 코어 및 penumbra 확산 매개 변수 척도를 ADC 및 FA 지도 결과 마스크 (코어 및 penumbra) 적용 됩니다.
    3. 비교 contralateral ADC 및 FA 값을 얻기 위해 동측 코어와 뇌 중간에 대해 penumbra 마스크를 번역 합니다.

결과

총 24 성인 남성 C57BL/6 마우스, 수술의 때에 24-31 g 사이 무게의 연구에 사용 되었다. 한 동물 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)을 따라 죽 었 고 하나 수술 합병증으로 인해 제외 됐다. 여기에 제시 된 데이터는 저자에 의해 이전에 게시 작업에서 가져옵니다. 이러한 MCAO 결과11에 선박 수리의 효과 설명 하기 위해 사용 되었다. 모든 데이터는 thr 평균 ± 표준 편차로 표현 됩니다. 데이터는 다 봉 agostino 피어슨 다 수 정상 테스트를 사용 하 여 정상에 대 한 통계적으로 평가 됐다. 파라메트릭 데이터 학생의 t를 사용 하 여 비교 했다-(두 의미)에 대 한 테스트 및 일방통행 ANOVA Sidak 테스트 (여러 의미)와 함께. 비-파라미터 데이터는 맨-휘트니 U 테스트를 사용 하 여 비교 되었다. 파라메트릭 데이터의 변화는 F를 사용 하 여 평가 했다-테스트, 비 파라미터 데이터 변화 Levene의 테스트를 사용 하 여 평가 했다 그리고.

일반적으로, MCAO 절차, occluding 필 라 멘 트 삽입 되는 CCA는 ECA는 ICA 보다는 ECA에 통과에서이 필 라 멘이 트를 방지 하기 위해 출혈 및. ECA 결 찰의 회피와 진통의 감소 된 체중 감소 추세에서 보였다 MCAO-48 h 포스트, 반면 같은 MCAO 시간 없이 무 통으로 ECA 결 찰을 사용 하 여 같은 외과 의사에 의해 착수 하는 이전 연구에서 데이터에 비해 LV 영향을 받지 않는 등장, 그림 1을 참조 하십시오.

마우스는 60 분 MCAO 유발 허 혈을 reperfusion CCA 선박 수리 또는 CCA 접근의 전형적인 결 찰을 이어서 받았다. 합자 및 unligated 수리 CCA의 회로도 그림 2에 표시 됩니다.

레이저 도플러 flowmetry는 혈액 흐름 관류 영토에서 MCAO에 MCA의 CCA 선박 수리 전후 확인 하 사용 되었다. 그림 3 에서는 그 5 분 필 라 멘 트 제거, MCA의 두뇌 지역에서 크게 증가 하 여 지역 대뇌 혈 류 (rCBF)를 다음을 보여 줍니다. 관류 CCA 선박 수리, CCA 수리에 대 한 의존도에 비해 허 혈 성 영역을 증가 혈액 관류 허용 제안 다음 표시 MCA 영토를 관류의 증가와 선박 수리까지 유지 되었다 원의 윌리스 혼자입니다.

그리고 MRI T2가 중 전체 LV를 결정 하기 위해 사용 DTI 검사 핵심 라스베가스, MCAO는 후 48 h를 결정 하는 데 사용 했다. 그림 4A 수리 및 합자 프로시저 그룹 사이 총 또는 코어 LV에 큰 차이 보여줍니다. 그러나, 둘 다에 대 한 데이터 변화 총 및 평가 대 한 Lavene의 테스트를 사용 하 여 라스베가스, 코어 비패라메트릭 또는 F-파라미터 데이터에 대 한 테스트, CCA 수리 그룹 내에서 크게 감소 했다. 총 라스베가스 했다로 분해 외피와 subcortical 라스베가스, 그림 4B와 같이. 대뇌 피 질의 부분 하위 외피 부분의 병 변은 두 절차 그룹 사이 영향을 받는 반면 CCA 복구 그룹에 훨씬 적은 변수를 했다.

전력 분석 치료 그룹 당 적은 동물 MCAO CCA 수리 대 전형적인 CCA 출혈 절차를 사용 하 여 다음 LV 30% 감소 입증, 표 1을 참조 하는 데 필요한 될 것 이라고 지적 했다. 전원 1-β의 가정 = 0.8 및 의미 수준 α = 0.05와 예측 가상 제어 및 테스트 간의 LV 30% 감소의 그룹은 전력 분석을 위해 사용 되었다. 또한, 동일한 분산 그룹 사이 간주 되었다. 표 1 테스트에 필요한 동물의 수를 표시 하 고 컨트롤 그룹 중 전형적인 CCA 출혈 메서드를 사용 하는 경우 또는 업데이트 CCA 복구 방법, 여기에 설명 된 대로 사용 됩니다. 테스트 그룹 가상 치료 동물의 그룹과 컨트롤 그룹을 나타내는 참조 하기 가상 제어 그룹; 두 그룹 MCAO 받을 것 이다.

figure-results-1
그림 1: 결합 된 무 통 치료 및 결과 MCAO 다음에 결 찰 ECA의 생략. (A) 사전 MCAO 무게의 백분율로 표시 된 체중 감소 MCAO 두 그룹에 대 한 다음 첫 번째 2 d. ECA unligated 그룹 (진통-MCAO에서 아무 ECA 결 찰으로 치료)는 MCAO 다음 두 번째 날에 감소 된 체중 감소 추세를 보였다. (B)이이 패널 표준 triphenyltetrazolium 염화 (TTC)는 MCAO 후 48 h 얼룩에 의해 측정 병 변 볼륨 (m m3)을 보여 줍니다. 표시 된 데이터는 평균 ± 표준 편차. ECA 출혈: n = 17, ECA unligated: n = 10. 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2
그림 2: 표준 CCA 방법과 대체 CCA를 보여주는 회로도 복구 방법 MCAO 다음. (A)이이 도식 묘사 오른쪽 CCA의 영구 결 찰에 결과로 영구적으로 합자 CCA CCA 절 개의 양쪽에 적용 하는 비 분해할 수 있는 봉합을 사용 하 여. (B)이이 회로도 대체 CCA repair 메서드를 보여 줍니다. 작은 조직 패드 fibrinogen 코팅 하 고 트 롬 빈 실 란 트 오른쪽 CCA의 전체 관류 있도록 봉인 CCA 절 개를 커버 하는 데 사용 됩니다. 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-3
그림 3: 지역 대뇌 혈액 흐름 (rCBF) 매개 변수 MCAO 다음. rCBF 그룹에 대 한 두 CCA 출혈 및 CCA 수리 (게시물-MCAO)는 rCBF에 상대적인 MCAO 필 라 멘 트 제거 MCAO 동안 측정 후 5 분을 변경. 이 패널은 CCA 선박 수리 (사전 수리) 직전 및 CCA 수리 (수리 후)를 따라 5 분 rCBF 데이터를 보여줍니다. 상당한 증가 rCBF에서 두 그룹에 필 라 멘 트 제거 (게시물-MCAO) 후 5 분을 표시 됩니다. rCBF에서 추가 증가 CCA 복구 그룹에 CCA 수리 (수리 후)을 따라 표시 됩니다. rCBF에 차이가 5 분 포스트-MCAO 및 사전 복구 사이 표시 됩니다. 표시 된 데이터는 분석된 시간 코스 데이터 보고 키 시간 포인트, 평균 ± 표준 편차로 여기에서에서 집 광. CCA 출혈: n = 10, CCA 수리: n = 10; P < 0.01, * * *P < 0.001, ns: 비-중요 한. 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-4
그림 4: MRI 기술에 의해 얻은 병 변 볼륨 분석. (A)이이 패널 MCAO, t 2가 중 MRI 이미지 (전체 LV)에서 가져온 총 LV 및 DTI 검사 및 분석 (코어 LV)에서 가져온 핵심 LV 48 h에 병 변 볼륨 (LV; m m3)을 보여줍니다. 대표 이미지 적용 DTI 코어 병 변 볼륨 마스크 T2 스캔 슬라이스 이미지에서 총 병 변 볼륨을 표시 합니다. 그룹 내의 다양성 모두 총 LV에 크게 감소 했다 (P = 0.015, CCA 수리: n = 10, CCA 출혈: n = 10, F-테스트)와 코어 LV (P = 0.043, CCA 수리: n = 9, CCA 출혈: n = 6, Lavene의 시험), F를 사용 하 여 평가-파라미터 데이터 또는 비-파라미터 데이터에 대 한 Levene의 테스트를 위해 테스트. (B)이이 패널에서 48 h MCAO, t 2가 중 MRI 이미지에서 촬영 하 고 외피와 subcortical 병 변 영역으로 나누어 다음 LV를 보여줍니다. CCA 복구 데이터 다양성 감소 (P = 0.03, F-테스트) 병 변, 하지만 데이터에 영향을 주지 않습니다의 대뇌 피 질 부분에 바꾸어 부분의 병 변에서 다양성을 표시 했다. CCA 수리: n = 10, CCA 출혈: n = 10. 표시 된 데이터는 평균 ± 표준 편차. # P < 0.05 (F-테스트), xP < 0.05 (Lavene의 시험). 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

접근병 변 볼륨
(LV; m m3평균 ± 사 우 스 다코타)		전원의미 수준Anticiapted 차이필요한 그룹 크기
CCA 출혈 (전통적인 방법)94.08 ± 53.790.80.0530% n = 58
CCA 수리 (새로운 방법)51.73 ± 22.780.80.0530% n = 35

표 1: 대표적인 전력 분석 비교는 대안 전통적인 CCA 결 찰 CCA 복구 방법은 여기에 설명 했다. 이 표에서 컨트롤 그룹, 전통적인 또는 대체 (새로운) 접근, 그리고 테스트 그룹 (예측) 사이의 LV에 큰 차이 감지 하는 데 필요한 예상된 그룹 크기를 계산 하기 위해 실시 하는 전력 분석을 보여 줍니다. 그룹으로 크기 표에서 필요한 0.8의 힘은 가정, 0.05의 의미 수준 적용 되 고 라스베가스에 비해 예측된 테스트 그룹에 30% 차이 보여줍니다 하는 경우 제어 그룹. 표 (CCA 출혈 및 CCA 수리)는 라스베가스에 30% 차이 얻을 하는 데 필요한 동물의 수에 차이 확인 하기 위해 두 MCAO 접근에 대 한 결과 두 방법에 대 한 동등한 차이 테스트 및 제어 그룹 사이 간주 됩니다. 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11.

토론

설치류에 과도 MCAO의 필 라 멘 트 유도 가장 자주 사용 되는 실험적인 뇌졸중 모델 reperfusion 임상 뇌경색7다음 이벤트의 발생을 흉내 낸, 영향을 받는 영역에 있습니다. 여기에서 보고 된 쥐에 있는 필 라 멘 트 유도 과도 MCAO의 전통적인 방법에 다른 외과 접근 방법이 이다. 무 통 치료, ECA 결 찰 회피, 그리고 CCA 절 개 수리, 관련 된 다른 접근 감소 LV 가변성 MRI 및 조직학 얼룩 방법11를 사용 하 여 평가 하는 경우에 발생 합니다.

크게 MCAO를 유도 하는 기존의 방법과 transection, 또는 의존을 보여줘 왔다, 쥐, 음주 행동과 MCAO14다음 몸 체중 증가 영향을 미칠 ECA의 적어도 결 찰. 여기, ECA 결 찰 및 진통 또한, 회피와 쥐에서 정의 된 프로토콜 다음 병 변 볼륨에 아무런 영향 MCAO 몸 체중 감소에 있는 감소를 제안 했다. 진통의 사용은, 또는 적어도 하지 보고, 대부분의 실험적인 뇌졸중 연구, 실험 결과에 가능한 혼동 효력 때문에. 그러나, 무 통을 완전히 피하는 항상 정당화 되지 그리고 과학적인 목표의 공적을 가진 동물의 복지 요구를 균형을 필요.

동물 크기 차이, 스트레인, 뇌혈관 해부학, 필 라 멘 트 크기와 형식 유사 이외에 모든 스트로크 결과23,24에 영향을 제안 했다. 여기에 설명 된 대체 접근 reperfusion, 따라서 감소, 적어도 부분에서 병 변 볼륨에서 동물 사이 본 변화 하는 동안 암소에 대 한 의존도 방지 합니다. 암소 해부학은 쥐, 높게 가변 특히는 C57BL /6 변형 실험 뇌졸중 연구에서 자주 사용 되는. C57BL/6 마우스의 90%는 다양 한 사후 통신 동맥 (PcomA) patency, MCA 영토13, 의 외부 구조의 부족 한 관류로 인 한 허 혈 성 손상의 볼륨에 영향을 미칠 수 있습니다 인해 불완전 한 암소는 25. 그림과 같이 마우스에 CCA를 복구, 혈액의 재건 립에 결과 통해 앞에서 설명한 쥐15에 허 혈 성 지역에 CCA 흐름. 대표적인 데이터 없지만 CCA에 혈액의 흐름은 직접 측정 하지는 CCA의 수리 reperfusion, 증가 보여 줍니다. 그러나, 인접 및 복구 위치에 원심 트렁크, 따라 pulsing 및 전체 상태에 반환으로 선박 수리 다음 혈액으로 CCA reperfuse를 시각화 하는 외과 의사에 대 한 가능 하다. 이 시각적 확인, 허 혈 성 영역의 레이저 도플러 flowmetry 읽기 함께 그릇의 성공적인 복구를 확인 하 사용할 수 있습니다. 조직 패드 응용 프로그램과 CCA에서 선박 클립의 제거 사이의 시간 조직 패드 응용 프로그램 사이의 시간을 줄이는 CCA의 결과 patency에 영향을 미칠 수 있습니다 하 고 클립 제거를 o 준수에서 조직 패드를 막을 것 이다 CCA의 pposite 쪽입니다. 비록 기술적으로 도전적인, 여기 설명 대체 MCAO 절차 보다 쥐에서 MCAO 수술 유도 하는 데 필요한 모든 추가 능력을 필요 하지 않습니다.

전통적으로 결과 측정에 높은 가변성을 연관, 실험적인 뇌졸중 연구 underpowered 될 하는 경향이 있을 수 있습니다. 경제적이 고 실용적인 우려와 함께에서 윤리 및 복지 요구 되 underpowered 연구에 기여할 수 있습니다. 결과 있는 가변성을 감소 하 고, 따라서, 실험적인 그룹에서 더 일관 된 병 변의 결과 생산, 적절 하 게 구동 되 고 연구의 궁극적인 목표와 더불어 더 효과적인 전력 계산을 수행할 수 있습니다.

결론적으로,이 대체 CCA 수리 절차, 쥐, 병 변 볼륨 실험 선 다음에 더 적은 가변성에 결과 및 가능 하 게 작은 실험 그룹을 적절 한 때 치료 효과 테스트 해야 전원 계산 사용 됩니다.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품 교체, 구체화 및 연구 (NC3Rs; 동물의 감소를 위한 국가 센터에 의해 투자 되었다 CG에 NC/M000117/1). 저자는 그녀의 통계 조언에 대 한 실험 동물 및 마리아 Viskaduraki의 그들의 관리에 대 한 사단의 생물 의학 서비스, Leicester의 대학의 직원을 감사합니다. 대표 결과 질병 모델 & 메커니즘11허가 적응.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.7mm 유연한 단일 광섬유 프로브Moor Instruments, UKP10d마스터 프로브 코드와 함께 사용: VP10M200ST
7-0 실리콘 코팅 모노필라멘트Doccol, USA701956PKRe동물의 크기와 무게에 따라 다름 - 제조사 지침을 사용하십시오. 여기의 제품 코드는 문서에 표시된 대표적인 결과에 사용되었습니다.
9.4T 전임상 MRI 시스템Agilent Technologies, Santa Clara, California, USAMY11520101마우스 뇌 이미징에 적합한 그라디언트 및 RF 코일 장착
동물 모니터링 및 게이팅 장비SA Instruments, Stony Brook, New York, USA22124005MRI 호환 온도 및 호흡 모니터링
BupivacaineNational Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK512345Marcaine
C57BL/6 MiceCharles River, Oxford, UKB6JSIMA49D
CarprofenNorbrook Laboratories143658Carprieve 5% w/v 주사용 소형 동물 용액
클로르헥시딘 4% 핸드 클렌저 솔루션VWR International Ltd, Lutterworth, UKMOLN10008780HibiScrub 항균 핸드 클렌저, Molnlycke Health Care
면봉National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK213512모든 플라스틱 몸체, 면봉 팁은 고압멸균으로 멸균 처리되면 적합합니다.
입체 내시경Carl ZeissOPMI99상주 장비.
x1-x5 배율이 가능한 모든 양안 해부 입체경이 적합합니다.
용해성 6-0 봉합National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK9544흡수성 봉합사 Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon 코드: W9981)
도넛 프로브 홀더Moor Instruments, 영국마우스용 PHDO프로브 홀더, 레이저 도플러 유량 기계와 함께 사용할 때 단일 광섬유 프로브와 함께 사용해야 합니다.
dumont #5 forcepsWorld Precision Instruments, 영국 하트퍼드셔500342
피브리노겐 및 트롬빈 실란트박스터, 버크셔, 영국1502243TISSEEL 실란트 2mL 젤 식품용 즉시 사용 가능한 솔루션
Datesand group, 영국 맨체스터72065022Diet Gel Recovery
Image display and measuring software package3D Slicerhttps://www.slicer.org/버전 4.0
이미지 표시 및 측정 소프트웨어 패키지NIH, Maryland, USAhttps://imagej.nih.gov/ij/index.htmlNIH/ImageJ
LDF 모니터Moor Instruments, 영국moorVMS-LDF
마이크로 반나스 가위InterFocus Ltd, Linton, UK15000-08다른 microvannas 스프링 가위를 대안으로 사용할 수 있지만 미세한 팁이 필요합니다.
미세혈관 클립World Precision Instruments, Hertfordshire, UK1591110 G Vessel Clip
미세혈관 클립 홀더World Precision Instruments, Hertfordshire, UK14189
MRI 수집 및 분석 소프트웨어Agilent Technologies, Santa Clara, California, USAVnmrJ 버전 4.2개정판 A
no. 15 메스과학 실험실 용품, 영국 노팅엄INS4678멸균 No15 메스 - 제조 번호 P305. 다른 공급업체를 사용할 수 있습니다.
Non-disolvable 6-0 sutureNational Veterinary Services, Stoke-on-trent, UKW529Ethicon Mersilk Sutures
Ocular lubricantNational Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK847288Lacrilube (5100G13)
Optical matching gelMoor Instruments, UKPMG
Pulse Oximetry ReaderStarr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USAMouseOxMouseOx - 쥐 & 마우스 맥박 산소 농도계 & 생리학적 모니터
마우스 허벅지 센서와 함께 사용하십시오.
Rehydration gelDatesand group, Manchester, UK70015022HydroGel
소형 이발기vetproductsuk.comHS61Contura 무선 트리머/클리퍼
멸균 0.9% NaCl 용액VWR International Ltd,
Lutterworth, UK		LOCA3528286염화나트륨 0.9% W/V 정맥 주입 BP 500ML ECOFLAC½ PLUS
멸균 페트리 접시VWR International Ltd, Lutterworth, UK516802150mm 멸균 페트리 접시. 모든 브랜드가 적합합니다. 최소 50mm 직경이 필요합니다.
국소 티슈 접착제World Precision Instruments, Hertfordshire, UK503763GLUture 국소 티슈 접착제
방수 초강력 접착제록타이록타이트 초강력 접착제 Precision Max대부분의 철물점에서 구입할 수 있습니다.
흰 종이 칩Datesand 그룹, 맨체스터, 영국CS1BPBPure-O'Cel
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쥐에 있는 일반적인 경 동맥 수리 통해 Reperfusion를 허용 하는 중간 대뇌 동맥 폐색
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