Saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론

요약

여기 선물이 지 수 성장 방정식에 Saccharomyces cerevisiae 의 지 수 성장 피팅 하 여 호흡과 발효 대사를 추정 하는 프로토콜. 운동 매개 변수 계산 발효 또는 미토 콘 드리 아 호흡 물질/화합물의 영향의 심사에 대 한 수 있습니다.

초록

지 수 단계에 saccharomyces cerevisiae 세포 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 ATP를 생산 하 여 그들의 성장 유지. Fermentable 탄소 농도 주로 효 모 세포에서 ATP;를 생성 하는 방법을 제어합니다 따라서, fermentable 탄수화물 수준에 변화 S. cerevisiae의 에너지 대사를 드라이브. 이 신문은 추정의 농도 변경 효과 호흡과 발효 대사에 탄소 소스의 자연 지 수 효 모 성장에 따라 높은 처리량 방법을 설명 합니다. S. cerevisiae 의 성장 한 microplate에 측정 또는 원뿔 동요 600에서 광학 밀도 (OD)를 결정 하 여 플라스 크 nm. 그런 다음, 성장 곡선 그리기 세 시간, 식별 및 지 수 위상의 선택을 허용 하 고 운동 매개 변수를 지 수 성장 방정식은 장착 대에 의해 만들어집니다. 높은 두 배로 시간 낮은 특정 성장 속도 일반적으로 호흡기 성장을 나타냅니다. 반대로, 낮은 배로 시간 높은 특정 성장 율 일 성장을 나타냅니다. 임계값의 시간과 특정 성장 율을 두 배로 잘 알려진 호흡 또는 발효 조건, 비-fermentable 탄소 소스 등 fermentable 설탕의 높은 농도 사용 하 여 견적 된다. 이 각 특정 스트레인에 대 한 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 계산 된 운동 매개 변수 효 모 발효 및/또는 호흡기 성장을 보여줍니다 여부 설정 임계값 값으로 비교 됩니다. 이 방법의 장점은 일 또는 호흡 대사에는 물질 또는 화합물의 효과 이해 하기 위한 상대적 단순입니다. 성장 한 복잡 하 고 복잡 한 생물 학적 과정; 강조 하는 것이 중요 하다 따라서,이 방법에서 예비 데이터 산소 소비량의 정량화와 발효 부산물의 축적에 의해 뒷받침 해야 합니다. 따라서,이 기술은 화합물/방해 하거나 발효 또는 호흡기 신진 대사를 향상 시킬 수 있는 물질의 예비 심사로 사용할 수 있습니다.

서론

Saccharomyces cerevisiae 성장 수십 생리 및 분자 메커니즘을 식별 하는 유용한 도구를 역임 했다. 성장 주로 세 가지 방법에 의해 측정 된다: 자리 테스트, 콜로 니 형성 단위, 및 성장 곡선에 대 한 직렬 희석. 이러한 기술은 특정 응답 또는 고기를 조사 하거나 기질, 환경 조건, 돌연변이, 그리고 화학 물질의 다양 한와 함께 사용할 수 있습니다.

미토 콘 드리 아 호흡 있는 성장 속도 론 성공적으로 적용 된 알 수 없는 메커니즘을 발견에 대 한 생물 학적 과정 이다. 이 경우에, 비 fermentable 탄소와 성장 매체의 보충 소스 글리세롤, 젖 산, 에탄올 (미토 콘 드리 아 호흡에 의해 대사만), 등 평가 대 한 수 있습니다 유일한 탄소 및 에너지 소스는 호흡기 성장, 산화 인 산화 활동¹에 물결을 감지 하는 것이 중요 하다는. 다른 한편으로, 그것은 발효 뒤에 메커니즘을 파악 하기 위한 방법으로 성장 운동 모델을 사용 하 여 복잡 하다입니다.

발효와 미토 콘 드리 아 호흡의 연구 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과^2,

프로토콜

1. 문화 미디어와 Inoculum 준비

1. 준비 2% 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 액체 매체의 100 mL (1 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 2 세대 및 2 세대 포도의 100 ml의 증류수를 추가). 15 mL 원뿔 튜브를 sterilizable으로 미디어의 3 mL을 분배. 고압 121 ° C와 1.5 psi에서 15 분에 대 한 미디어.
   참고: 미디어는 4-8 ° c.에 최대 한 달 동안 저장 될 수 있다
2. 가득-20 ° c.에 글리세롤에 보존 하는 S. cerevisiae 세포의 250 μ와 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 3 mL 원뿔 튜브를 예방 200 rpm 동요와 30 ° C에서 궤도 통에서 밤새 품 어.
3. 페 트리 접시 (60 x 15 m m²) 살 균 2% YPD agar 가득 행진 (10 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 20 g 포도 당의 20 g 그리고 증류수 1000 ml의 세균 agar의 20 g 추가) 메 마른 루프를 사용 하 여 원뿔 튜브에 성장 하는 세포. 고립 된 식민지 성장을 표시 될 때까지 30 ° C에서 배양 접시를 품 어.
4. 하나의 고립 된 식민지 가득한 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 10 mL 원뿔 튜브에 접종 하 여 사....

결과

성장 곡선 예비 호흡과 발효 효 모 S. cerevisiae 에서 고기를 구분을 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리 일 성장을 유도에 보고 된 다른 포도 당 농도 배치 문화 S. cerevisiae (BY4742)의 수행: 1%, 2% 및 10% (w/v)⁹. 문화 일 형을 보여주는 작은 지연 위상 있고 높은 성장 율 (그림 1)와 지 수 단계. 에탄올, 글리세롤, 및 젖 산 염은 호흡; 통해서만 metabolized 수 탄소 소스 따라서, 우리는 그 탄소 소스를 사용 하 여 효 문화를 수행. 주로 산화 인 산화에 의해 에너지를 얻는 문화 더 긴 래그 단계 및 성장 단계에서 지 수 (그림 2)의 느린 속도 보였다.

토론

오랜 시간 이후 J. Monod¹⁰ 표현 세균성 문화의 성장 연구 미생물학의 기본 메서드는 통과 했다. 분자의 출현 지연 사용 및 연구 기법으로 성장 합니다. 수많은 상호 프로세스를 포함 하는 성장의 복잡성에도 불구 하 고 그것의 근본적인 메커니즘 수학적 모델¹¹을 사용 하 여 설명할 수 있습니다. 이것은 가장 복잡 한 분자 메커니즘¹²명료 하 상호 보완적인 도구로 사용할 수 있는 강력한 접근입니다.

이 방법에서 신뢰할 수 있는 결과 얻으려면, 그것은 다음 중요 한 단계를 고려 하는 것이 중요입니다. 250 rpm 동요 호흡기 성장, 교 반 속도 (150-180 rpm) 우리가 관찰 호흡기 조건에서 성장 감소 낮은 사용 하는 경우 때문에 발휘 하는 낮은 탄소 소스에서 좋은 성장을 달성 하는 데 매우 중요 하다. 신선한 소재를 사용 하는 프로토콜을 시작 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
오비탈 쉐이커	Thermo Scientific	4353	접종 배양 또는 원뿔형 파스크 배양용
Bioscreen	성장 곡선	C MBR	마이크로플레이트의 배치 배양용
포도당	시그마	G7021	YPD 육수 준비용
카제인에서 추출한 펩톤, 효소 분해	Sigma	82303	YPD 육수 제제
효모 추출물	Sigma	09182-1KG-F	YPD 국물 준비
세균학 한천	시그마	A5306	YPD 한천 준비용
NaH2PO4	Sigma	S8282	SC 육수 준비
용(NH4)2SO4	Sigma	A4418	SC 육수 준비용
아미노산과 황산암모늄이 없는 효모 질소 기반	시그마	Y1251	SC 육수 준비용
효모 합성 드롭아웃 매체 보충제	Sigma	Y1501	SC 육수 제제용
황산 암모늄 과립	J.T. Baker	0792-R	중간 보충제 예
Resveratrol	Sigma	R5010	중간 보충제 예:
갈락토오스	시그마	G8270	중간 영양 보충 예:
설탕	시그마	S7903	배지 보충제의 경우
Absolut ethanol	Merck	107017	배지 보충제의 경우
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	배지 보충제의 경우
GraphPad Prism	GraphPad 소프트웨어		데이터 분석용
Honeycomb 마이크로플레이트	Thermo Scientific	9502550	마이크로플레이트 배양용