Saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론

Saccharomyces cerevisiae 성장 수십 생리 및 분자 메커니즘을 식별 하는 유용한 도구를 역임 했다. 성장 주로 세 가지 방법에 의해 측정 된다: 자리 테스트, 콜로 니 형성 단위, 및 성장 곡선에 대 한 직렬 희석. 이러한 기술은 특정 응답 또는 고기를 조사 하거나 기질, 환경 조건, 돌연변이, 그리고 화학 물질의 다양 한와 함께 사용할 수 있습니다.

미토 콘 드리 아 호흡 있는 성장 속도 론 성공적으로 적용 된 알 수 없는 메커니즘을 발견에 대 한 생물 학적 과정 이다. 이 경우에, 비 fermentable 탄소와 성장 매체의 보충 소스 글리세롤, 젖 산, 에탄올 (미토 콘 드리 아 호흡에 의해 대사만), 등 평가 대 한 수 있습니다 유일한 탄소 및 에너지 소스는 호흡기 성장, 산화 인 산화 활동¹에 물결을 감지 하는 것이 중요 하다는. 다른 한편으로, 그것은 발효 뒤에 메커니즘을 파악 하기 위한 방법으로 성장 운동 모델을 사용 하 여 복잡 하다입니다.

발효와 미토 콘 드리 아 호흡의 연구 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과^2,3같은 특정 고기 뒤에 분자 메커니즘을 명료 하 게 필수적 이다. 크랩 트리 효과 glycolytic 플럭스의 증가, 미토 콘 드리 아 호흡의 억압과 fermentable 탄수화물의 높은 농도의 ATP를 생성 하는 기본 통로로 발효의 설립에 의해 특징입니다 (> 0.8 m m)^4,5. 바르 부르 크 효과 되는 포유류 세포에 발효의 주요 제품 젖⁶metabolically 크랩 트리 효과 차이와 아날로그. 실제로, 바르 부르 크 효과 다양 한 트리거링 포도 당 통풍 관 및 산소⁷존재도 소비 하는 암 세포에 의해 전시 된다. 따라서, 크랩 트리 효과에 발효 호흡에서 스위치의 분자 기초 공부에 (에탄올 생산)에 대 한 바이오 영향 및 잠재적인 영향 암 연구 합니다.

S. cerevisiae 성장 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과 공부 하는 적합 한 도구 있을 수 있습니다. 이 아이디어는 효 모 지 수 단계에서 ATP를 생산 하는 데 사용 하는 중앙 통로 미토 콘 드리 아 호흡과 발효, 성장을 유지 하기 위해 필수적인 사실에 기반. 예를 들어, S. cerevisiae 의 성장 ATP 생성 통로의 기능을 밀접 하 게 관련 되어 있습니다. 포도 당 분자 당 S. cerevisiae, 미토 콘 드리 아 호흡 생산 약 18 ATP 분자, 발효만 2 ATP 분자를 생성 하는 반면 따라서 그것 전망 이다 성장 율 변화 통로와 꽉 링크는 ATP⁸생산. 이와 관련, 발효 ATP를 생성 하는 주요 경로 이면 누 룩 낮은 ATP 생산 함으로써 보완 포도 당 통풍 관의 속도 증가 합니다. 그와 반대로, 미토 콘 드리 아 호흡 주요 ATP 소스로 사용 하는 효 모 세포에 의해 포도 당 소비는 낮다. 이 ATP 생성 되는 방법을 결정 하기 전에 이해 탄수화물을 효 모에 대 한 중요 한는 것을 나타냅니다. 포도 당 가용성 발효와 미토 콘 드리 아 호흡에서의 전환에 중요 한 역할을 담당 하는 따라서, S. cerevisiae. 높은 양의 포도 당의 누 룩 발효를 ATP를 생성 하는 중앙 노선으로 좋아한다. 흥미롭게도, 누 룩을 발효 하면 특정 성장 율 최대 유지 됩니다. 다른 한편으로, 포도의 낮은 수준에서 S. cerevisiae 생성 ATP 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 낮은 성장 율을 유지 합니다. 따라서, 포도 당 및 다른 탄소 원의 사용의 농도에 변화 일 및 호흡기 성장 사이 누 룩의 기본 설정에서 변경 유도. 이 사실을 지 수 성장 방정식을 고려 하 여 한 시간 (Dt)와 특정 성장 율 (μ)를 배로 운동 매개의 생물학적 의미를 얻을 수 있습니다. 예를 들어 μ 값 효 모 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 기본 경로로 발견 되었다. 그와 반대로, 발효를 선호 하는 조건 하에서 높은 μ 값이 발견 되었다. 이 방법론 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡에 영향을 미치는 화학 물질의 가능한 메커니즘을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 S. cerevisiae.

이 문서의 목적은 심사 미토 콘 드리 아 호흡 또는 발효에 주어진된 물질/화합물의 효과 대 한 성장 속도에 따라 방법 제안.

1. 문화 미디어와 Inoculum 준비

1. 준비 2% 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 액체 매체의 100 mL (1 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 2 세대 및 2 세대 포도의 100 ml의 증류수를 추가). 15 mL 원뿔 튜브를 sterilizable으로 미디어의 3 mL을 분배. 고압 121 ° C와 1.5 psi에서 15 분에 대 한 미디어.
   참고: 미디어는 4-8 ° c.에 최대 한 달 동안 저장 될 수 있다
2. 가득-20 ° c.에 글리세롤에 보존 하는 S. cerevisiae 세포의 250 μ와 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 3 mL 원뿔 튜브를 예방 200 rpm 동요와 30 ° C에서 궤도 통에서 밤새 품 어.
3. 페 트리 접시 (60 x 15 m m²) 살 균 2% YPD agar 가득 행진 (10 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 20 g 포도 당의 20 g 그리고 증류수 1000 ml의 세균 agar의 20 g 추가) 메 마른 루프를 사용 하 여 원뿔 튜브에 성장 하는 세포. 고립 된 식민지 성장을 표시 될 때까지 30 ° C에서 배양 접시를 품 어.
4. 하나의 고립 된 식민지 가득한 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 10 mL 원뿔 튜브에 접종 하 여 사전 inoculum을 준비 하 고 200 rpm에서 지속적인 동요와 30 ° C에서 밤새 품 어.

2. 문화 미디어와 Microplate에 성장 곡선

1. 1 %YPD 국물의 10 mL를 준비 (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g과 포도의 10 ml의 0.1 g에 증류수를 추가), 2 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 포도의 0.2 g 추가) 그리고 10 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 포도의 1 g 추가). 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분.
   참고: 문화 미디어 일 성장의 컨트롤 역할을 합니다.
2. 2% 효 모 추출 물 펩 에탄올 (형식) 국물의 10 mL와 10 mL 2% 효 모 추출 물 펩 글리세롤 (YPG) 국물을 준비 합니다. 2%에 대 한 형식: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 에탄올의 0.2 mL를 추가. 2 %YPG: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 글리세롤의 0.2 mL를 추가. 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분.
   참고: 글리세롤과 에탄올은 독점적으로 미토 콘 드리 아 호흡에 의해 물질 대사로 변화 비 fermentable 탄소 소스. 이러한 이유로, 호흡기 성장 컨트롤로 사용 됩니다. 이 단계에서 효 모 추출 물 펩 (YP) 국물 (10 g의 효 모 추출 물 및 증류수 1000 mL에 카 세 인 펩의 20 g)를 기본으로 하 여 성장 표현 형에 영향을 테스트 유형과 문화 미디어에서 탄소 소스의 농도 변경할 수 있습니다. 탄소 이외의 다른 영양소의 효과 테스트 하려면 합성 완료 (SC) 매체 실험의 목표에 따라 보충 된다. 사우스 캐롤라이나 매체에 대 한 자료는 아미노산, 황산 암모늄 5 g 없이 기본 효 질소의 1.8 g [(NH₄)₂등₄], 1.4 g의 글루타민 인산 염 (NaH₂포₄), 드롭 아웃의 2 세대 1000 mL의 증류수에 혼합. 탄소 소스와 필요한 농도에서 추가 질소 소스 미디어를 보충.
3. 실험 설계에 대 한 적합 한 문화 미디어의 145 μ 뚜껑 살 균 미 판 (10 x 10-잘)의 각 음을 추가 하 고 사전 inoculum의 5 μ와 예방.
   참고: 지금까지 목표는 화면에 누 룩의 에너지 대사 물질/화합물의 영향, 경우에 그 물질/화합물이이 단계 동안 추가 되어야 합니다. 또한, 모든 유형의 뚜껑 microplate 유용 해야 한다.
4. 다 잘 접시 200 rpm에서 48 h. 측정 600에서 광학 밀도 (OD)에 대 한 지속적인 동요와 30 ° C에서 microplate 리더에 품 어 nm 매 30 또는 60 분.
   참고: microplate 리더에는 미 판 품 어 하는 옵션이 없는 경우 그것은 수 있습니다 알을 품는 OD의 모든 측정 사이 동일한 조건에서 궤도 통에.

3. 성장 곡선 소동된 원뿔 플라스 크에

1. 20 mL 원뿔 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 4.8 mL를 추가 합니다. OD_600nm ~ 2 쿨, 무 균 2 %YPD 국물에서에서 사전 inoculum 문화 200 μ와 각 플라스 크 예방 24 h에 대 한 250 rpm에서 일정 한 동요와 30 ° C에서 그들을 품 어.
   참고: 잠복기 24 h 보다 높은 경우에, 50 mL 원뿔형 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 12 mL를 추가 합니다. 그들의 사전 inoculum 500 μ와 예방. 그것은 또한 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당) 및 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올)을 고려 하는 것이 중요.
2. 흔들린된 원뿔 플라스 크 문화 100 μ 걸릴 하 고 900 μ 1 mL 분 광 광도 계 베트에 증류수에 희석 pipetting으로 부드럽게 혼합. 600에서 OD를 측정 nm 마다 2 h 분 광 광도 계를 사용 하 여. 진짜 세를, 10에 의해 결과 곱하면 됩니다.

4. 데이터 처리 및 운동 매개 변수 계산

1. 통계 패키지 소프트웨어에서 새 프로젝트 파일을 만듭니다. "새 테이블및 그래프" 섹션에서 "XY" 옵션을 선택 합니다.
   1. 옵션 선택: "예제 데이터" 섹션에서 "빈 데이터 테이블로 시작" .
   2. "포인트 및 연결선" 그래프 유형을 선택 합니다. "X" 섹션 "복제 또는 오류 값에 대 한 Subcolumns"의 세그먼트에서 선택 하지 않은 상태로 두고 "Y" 섹션 옵션을 선택: "나란히 subcolumns에서 (10) 복제 값을 입력 하 고 작의 의미 및 오류 SD". 만들기를 클릭 합니다.
      참고: 테이블 형식 X 열 및 여러 Y 열, 각각 이전 선택 10 subcolumns 있다.
2. 쓰기는 OD에 측정 X 열에서 찍은 시간 (예를 들어, 0, 30, 60, 90 분 또는 0, 1, 1.5, 2 h). Y 열에서 문화에서 가져온 OD 값을 작성 합니다.
3. 로그 Y 열 데이터를 변환 하는 지 수 성장 단계를 식별 합니다. "분석" 버튼을 클릭, 선택 "변환" 분석, Y를 사용 하 여 Y 값 선택 = Log(Y). "결과의 갤러리", 선택 "변환" 데이터 테이블 "분석" 버튼을 클릭 하 고 "선형 회귀" 분석을 선택 이동 합니다. 선형 동작을 따르지 않는 OD 값을 제외 합니다. 값을 제외 하려면 데이터 테이블에 그들을 선택 하 고 "Ctrl + E"를입력 합니다.
   참고: 그것은 이후 지 수 성장 방정식 잘 지 수 단계에 맞는 지 수 단계를 수행 하지 값을 제외 하는 것이 중요.
4. "데이터 테이블 갤러리"데이터 테이블 선택 "데이터 1". "분석" 버튼을 클릭 하 고 "XY 분석" 가운데 "비선형 회귀 (곡선 적합도)" 분석을 선택 합니다.
5. 분석 하 고 "확인" 버튼을 클릭 하 여 데이터 집합을 선택 합니다. "맞춤" 탭에서 "지 수 방정식" 섹션을 선택 하 고 선택 "지 수 성장 방정식" ( X 는 세포 농도, X₀ 는 0에, μ 셀 농도 특정 성장 속도 이며 t 는 시간). 피팅 방법으로 "최소 제곱 적합" 사용 하 고 보간 섹션 선택 되지 않은 둡니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다.
   참고: 비선형 맞는 결과 탭 "결과의 갤러리"입니다. 소프트웨어 두 배로 시간 (Dt)와 특정 계산 성장 율 (μ). 소프트웨어는 결과 탭에 K 로 μ 를 표시합니다.
6. 새 프로젝트 파일을 열고 "새 테이블 및 그래프" 섹션에서 열 선택을 선택 합니다. "빈 데이터 테이블로 시작" 옵션을 선택 하 고 원하는 그래프를 선택 합니다. Sd. "만들기" 버튼을 선택와 의미를 선택 합니다.
7. "결과의 갤러리" 에 있는 비선형 맞는 결과 탭에서 μ 또는 Dt 값을 복사 하는 열에 붙여 넣을. 마지막으로, "분석" 버튼을 선택 하 고 다른 nutrimental 조건의 운동 매개 변수를 비교 하는 "열 분석" 섹션에 원하는 분석을 선택 합니다.
   참고: 운동 매개 변수 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당)에서 얻은 고 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올) 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡의 임계값을 설정 하는 데 도움이 각각. 비교는 운동 영양 상태와 물질/화합물 호흡과 발효 성장 분석에서 매개 변수는 호흡 또는 발효 대사에 가능한 영향을 식별할.

성장 곡선 예비 호흡과 발효 효 모 S. cerevisiae 에서 고기를 구분을 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리 일 성장을 유도에 보고 된 다른 포도 당 농도 배치 문화 S. cerevisiae (BY4742)의 수행: 1%, 2% 및 10% (w/v)9. 문화 일 형을 보여주는 작은 지연 위상 있고 높은 성장 율 (그림 1)와 지 수 단계. 에탄올, 글리세롤, 및 젖 산 염은 호흡; 통해서만 metabolized 수 탄소 소스 따라서, 우리는 그 탄소 소스를 사용 하 여 효 문화를 수행. 주로 산화 인 산화에 의해 에너지를 얻는 문화 더 긴 래그 단계 및 성장 단계에서 지 수 (그림 2)의 느린 속도 보였다.

성장 곡선의 분석 제공만 질적 정보; 따라서, 그것은 양적 정보를 얻기 위해 운동 매개 변수를 계산 하는 것이 중요입니다. 우리는 Dt 와 μ 지 수 성장 방정식 (그림 3)를 사용 하 여 계산. 우리 Dt ≥11.5 h와 μ ≤0.059 호흡기 성장 값에 대 한 임계값 설정 / h. Dt ≤6.5 h와 μ ≥0.149에서 일 성장에 대 한 임계값 설정 / h (그림 3).

이 검사 도구의 유용성을 증명 하기 위해 우리는 S. cerevisiae BY4742 셀에 다른 에너지 상태 (그림 4)에 다른 레 스 베라 트롤 (RSV) 농도의 효과 평가 하기 위한 첫 번째 3 실험을 설계 동요 플라스 크입니다. 두 번째 실험 S. cerevisiae BY4742의 에너지 대사에 다른 황산 암모늄 (NH4+) 농도의 영향을 검출 하는 목적으로 (그림 5)는 미 판에. 마지막으로, 세 번째 탄소 소스 변경 내용을 두 개의 서로 다른에 일 성장에 미치는 영향을 설명 하기 위한 S. cerevisiae 긴장 (W303 및 WLP530 맥주 발효에 사용 하는 산업) (그림 6). RSV를 사용 하 여 실험에 셀 에너지 상태는 포도 당 농도 변화 하 여 수정 되었습니다. 10% 포도 당, 모든 RSV 농도 테스트 효 respiro 발효 단계를 변경 하지 않은 하지만 호흡 단계를 감소 않았다 (diauxic shift 동안 S. cerevisiae 대사에 의해 지 수 단계 생산 하는 에탄올 산화 인 산화)입니다. Μ 값 확인 모든 조건 테스트, S. cerevisiae 2% 글리세롤 (호흡 제어로 사용 조건)에 성장 하는 때 그것의 표현 형에 반대 일 행동을 보여주었다 (그림 4a). 셀 1% 포도 당만을 격려 했다, μ 값 확인는 0.1, 1, 10, 및 100 µ M RSV, respiro 발효 단계에서 일 행동은 영향을 받지 않습니다. 그러나, diauxic 변화 하는 동안 호흡 단계에 있는 감소는 관찰 되었다. 또한, 1000 µ M의 농도에서 RSV 세포의 성장을 완전히 억제.

두 번째 실험에서 세포는 10% 포도 당 농도에 크랩 트리 효과 유발 하기에 충분 한 고려와 함께 보충 되었다 S. cerevisiae. 따라서, 우리는 뉴 햄프셔4+ 발효 대사에 다양 한 농도의 보충에 의해 추진 효과 관찰 수 있습니다. Dt 값 제안 그 0.13, 0.66, 1.99% NH4+ 호의 발효 대사, 그리고 그것은 관찰 될 수 있다 성장 곡선에 이러한 농도 문화 지 수 단계 확장. 그럼에도 불구 하 고, 3.31% mM NH4+, Dt 가치에 있는 증가이 농도 respiro 발효 대사 유도 보였다. 이 형 지 수 단계 (그림 5)에서 성장 곡선 및 느린 성장 속도에 확장된 지연 단계를 보였다.

세 번째 실험 두 개의 서로 다른 세포에서에서 S. cerevisiae 긴장 (W303 및 WLP530) 자당 또는 Dt 값에 탄소 소스의 효과 테스트를 갈 락 토스의 다른 농도에서 성장 했다 변형에 따라 다릅니다. 발효 제어로 두 종자 2% 포도에서 성장 했다 그리고 일 성장에 대 한 임계값을 설정 하려면 Dt 값 계산 했다. 일 Dt 값 긴장 했다, ≤3.25 W303 스트레인 및 ≤6.84는 WLP530에 대 한 h h와 스트레인. 따라서, 그것은 사용 하는 다른 긴장에 대 한 Dt 임계값 유효성 검사에 대 한 필요성을 강조 하는 것이 중요. 또한, 자당 탄소 소스로 사용 되었다 때 모두 긴장에서 10%와 2% 일 형 관찰 되었다. 그러나, 갈 락 토스를 사용 하면 스트레인 W303에서는 테스트, WLP530 긴장 2% 갈 락 토스에 발효 표현 형을 보였다 동안 농도에서 발효 동작을 표시 하지 않았습니다. 흥미롭게도, W303 긴장 두 탄소 소스 테스트의 모든 농도에서 성장 했다. 하지만, WLP530 긴장 탄소 사용 (0.01%)의 낮은 농도에서 성장을 보여주지 않았다. 이 WLP530 맥주 산업에서 사용 되는 노출은 탄소 농도 일반적으로 훨씬 더 높은 (그림 6) 때문에 있을 수 있습니다.

모두,이 세 가지 실험에서 데이터 성장 곡선 및 운동 매개 변수는 S. cerevisiae에 호흡과 발효 성장 사이 예비 차별 하는 데 유용 증명. 또한, 에너지 물질 대사 연구의 다양 한 측면에서 사용할 수 있는 다양 한 도구 임을 강조 하기 위해 중요 하다.

그림 1: S. cerevisiae 성장 형에 다른 포도 당 농도의 효과. 성장 곡선 600에서 광학 밀도 측정 하 여 건설 되었다 nm 48 h에 대 한 모든 30 분. S. cerevisiae 세포 발효 문화 했다 짧은 지연 위상 및 빠른 성장 율 지 수 단계. Respiro 발효 단계 성장 감속 단계 (호흡 상), 발효에 의해 생산 하는 에탄올 산화 인 산화 통로 사용 하 여 대사는 다음 고정 단계에 도달 하면 뒤에 수 있습니다. 데이터는 평균 ± 표준 오류로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: S. cerevisiae 성장 형에 호흡 탄소 원의 효과. 성장 곡선 600에서 광학 밀도 측정 하 여 건설 되었다 nm S. cerevisiae 의 48 헤 셀 마다 30 분 장기 지연 위상 및 느린 성장 율 지 수 단계 그리고 일반적으로 diauxic 변화를 보여주지 않았다. 데이터는 평균 ± 표준 오류로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 탄소 소스와 S. cerevisiae 운동 매개 변수에의 집중의 효과. 의 다른 탄소 소스; 아래 S. cerevisiae BY4742 성장 (는) Dt 값 S. cerevisiae BY4742 성장 다양 한 탄소 소스의 다른 농도에서 (b) μ 값입니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. 통계 분석 Dunnett의 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 했다 (*p < 2% 포도 당 대 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 다른 셀 에너지 상태에 resveratrol 보충의 효과. 10% 포도 당;를 사용 하 여 (a) 성장 표현 형 및 μ 값 (b) 성장 표현 형 및 μ 값 1% 포도 당을 사용 하 여. 성장 곡선에서 데이터 평균 ± 표준 오류로 표시 됩니다 고 μ 값은 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. Μ 값에 대 한 통계 분석 Dunnett의 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다 [*p < 2% 글리세롤 (RC)과 0.01 vs. 호흡기 컨트롤]. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: S. cerevisiae 에너지 대사에 황산 암모늄 보충의 효과. 성장 곡선 600에서 광학 밀도 측정 하 여 건설 되었다 nm 48 헤에 대 한 모든 30 분 성장 곡선에서 데이터 평균 ± 표준 오차도 제공 됩니다 및 μ 값은 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. Dt 값에 대 한 통계 분석 Dunnett의 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다 [* p < 2% 글리세롤 (RC)과 0.01 vs. 호흡기 컨트롤]. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6:의 발효 물질 대사에 있는 갈 락 토스와 자당 농도의 효과 Saccharomyces cerevisiae. W303 실험실 긴장 및 (b) Dt 값 WLP530 산업 긴장에 대 한 (는) Dt 값입니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. Dt 값에 대 한 통계 분석 Dunnett의 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다 [* p < 0.01 대 2% 포도 당 (발효 제어)]. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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