여기 선물이 지 수 성장 방정식에 Saccharomyces cerevisiae 의 지 수 성장 피팅 하 여 호흡과 발효 대사를 추정 하는 프로토콜. 운동 매개 변수 계산 발효 또는 미토 콘 드리 아 호흡 물질/화합물의 영향의 심사에 대 한 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
지 수 단계에 saccharomyces cerevisiae 세포 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 ATP를 생산 하 여 그들의 성장 유지. Fermentable 탄소 농도 주로 효 모 세포에서 ATP;를 생성 하는 방법을 제어합니다 따라서, fermentable 탄수화물 수준에 변화 S. cerevisiae의 에너지 대사를 드라이브. 이 신문은 추정의 농도 변경 효과 호흡과 발효 대사에 탄소 소스의 자연 지 수 효 모 성장에 따라 높은 처리량 방법을 설명 합니다. S. cerevisiae 의 성장 한 microplate에 측정 또는 원뿔 동요 600에서 광학 밀도 (OD)를 결정 하 여 플라스 크 nm. 그런 다음, 성장 곡선 그리기 세 시간, 식별 및 지 수 위상의 선택을 허용 하 고 운동 매개 변수를 지 수 성장 방정식은 장착 대에 의해 만들어집니다. 높은 두 배로 시간 낮은 특정 성장 속도 일반적으로 호흡기 성장을 나타냅니다. 반대로, 낮은 배로 시간 높은 특정 성장 율 일 성장을 나타냅니다. 임계값의 시간과 특정 성장 율을 두 배로 잘 알려진 호흡 또는 발효 조건, 비-fermentable 탄소 소스 등 fermentable 설탕의 높은 농도 사용 하 여 견적 된다. 이 각 특정 스트레인에 대 한 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 계산 된 운동 매개 변수 효 모 발효 및/또는 호흡기 성장을 보여줍니다 여부 설정 임계값 값으로 비교 됩니다. 이 방법의 장점은 일 또는 호흡 대사에는 물질 또는 화합물의 효과 이해 하기 위한 상대적 단순입니다. 성장 한 복잡 하 고 복잡 한 생물 학적 과정; 강조 하는 것이 중요 하다 따라서,이 방법에서 예비 데이터 산소 소비량의 정량화와 발효 부산물의 축적에 의해 뒷받침 해야 합니다. 따라서,이 기술은 화합물/방해 하거나 발효 또는 호흡기 신진 대사를 향상 시킬 수 있는 물질의 예비 심사로 사용할 수 있습니다.
서론
Saccharomyces cerevisiae 성장 수십 생리 및 분자 메커니즘을 식별 하는 유용한 도구를 역임 했다. 성장 주로 세 가지 방법에 의해 측정 된다: 자리 테스트, 콜로 니 형성 단위, 및 성장 곡선에 대 한 직렬 희석. 이러한 기술은 특정 응답 또는 고기를 조사 하거나 기질, 환경 조건, 돌연변이, 그리고 화학 물질의 다양 한와 함께 사용할 수 있습니다.
미토 콘 드리 아 호흡 있는 성장 속도 론 성공적으로 적용 된 알 수 없는 메커니즘을 발견에 대 한 생물 학적 과정 이다. 이 경우에, 비 fermentable 탄소와 성장 매체의 보충 소스 글리세롤, 젖 산, 에탄올 (미토 콘 드리 아 호흡에 의해 대사만), 등 평가 대 한 수 있습니다 유일한 탄소 및 에너지 소스는 호흡기 성장, 산화 인 산화 활동1에 물결을 감지 하는 것이 중요 하다는. 다른 한편으로, 그것은 발효 뒤에 메커니즘을 파악 하기 위한 방법으로 성장 운동 모델을 사용 하 여 복잡 하다입니다.
발효와 미토 콘 드리 아 호흡의 연구 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과2,3같은 특정 고기 뒤에 분자 메커니즘을 명료 하 게 필수적 이다. 크랩 트리 효과 glycolytic 플럭스의 증가, 미토 콘 드리 아 호흡의 억압과 fermentable 탄수화물의 높은 농도의 ATP를 생성 하는 기본 통로로 발효의 설립에 의해 특징입니다 (> 0.8 m m)4,5. 바르 부르 크 효과 되는 포유류 세포에 발효의 주요 제품 젖6metabolically 크랩 트리 효과 차이와 아날로그. 실제로, 바르 부르 크 효과 다양 한 트리거링 포도 당 통풍 관 및 산소7존재도 소비 하는 암 세포에 의해 전시 된다. 따라서, 크랩 트리 효과에 발효 호흡에서 스위치의 분자 기초 공부에 (에탄올 생산)에 대 한 바이오 영향 및 잠재적인 영향 암 연구 합니다.
S. cerevisiae 성장 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과 공부 하는 적합 한 도구 있을 수 있습니다. 이 아이디어는 효 모 지 수 단계에서 ATP를 생산 하는 데 사용 하는 중앙 통로 미토 콘 드리 아 호흡과 발효, 성장을 유지 하기 위해 필수적인 사실에 기반. 예를 들어, S. cerevisiae 의 성장 ATP 생성 통로의 기능을 밀접 하 게 관련 되어 있습니다. 포도 당 분자 당 S. cerevisiae, 미토 콘 드리 아 호흡 생산 약 18 ATP 분자, 발효만 2 ATP 분자를 생성 하는 반면 따라서 그것 전망 이다 성장 율 변화 통로와 꽉 링크는 ATP8생산. 이와 관련, 발효 ATP를 생성 하는 주요 경로 이면 누 룩 낮은 ATP 생산 함으로써 보완 포도 당 통풍 관의 속도 증가 합니다. 그와 반대로, 미토 콘 드리 아 호흡 주요 ATP 소스로 사용 하는 효 모 세포에 의해 포도 당 소비는 낮다. 이 ATP 생성 되는 방법을 결정 하기 전에 이해 탄수화물을 효 모에 대 한 중요 한는 것을 나타냅니다. 포도 당 가용성 발효와 미토 콘 드리 아 호흡에서의 전환에 중요 한 역할을 담당 하는 따라서, S. cerevisiae. 높은 양의 포도 당의 누 룩 발효를 ATP를 생성 하는 중앙 노선으로 좋아한다. 흥미롭게도, 누 룩을 발효 하면 특정 성장 율 최대 유지 됩니다. 다른 한편으로, 포도의 낮은 수준에서 S. cerevisiae 생성 ATP 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 낮은 성장 율을 유지 합니다. 따라서, 포도 당 및 다른 탄소 원의 사용의 농도에 변화 일 및 호흡기 성장 사이 누 룩의 기본 설정에서 변경 유도. 이 사실을 지 수 성장 방정식을 고려 하 여 한 시간 (Dt)와 특정 성장 율 (μ)를 배로 운동 매개의 생물학적 의미를 얻을 수 있습니다. 예를 들어 μ 값 효 모 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 기본 경로로 발견 되었다. 그와 반대로, 발효를 선호 하는 조건 하에서 높은 μ 값이 발견 되었다. 이 방법론 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡에 영향을 미치는 화학 물질의 가능한 메커니즘을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 S. cerevisiae.
이 문서의 목적은 심사 미토 콘 드리 아 호흡 또는 발효에 주어진된 물질/화합물의 효과 대 한 성장 속도에 따라 방법 제안.
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프로토콜
1. 문화 미디어와 Inoculum 준비
- 준비 2% 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 액체 매체의 100 mL (1 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 2 세대 및 2 세대 포도의 100 ml의 증류수를 추가). 15 mL 원뿔 튜브를 sterilizable으로 미디어의 3 mL을 분배. 고압 121 ° C와 1.5 psi에서 15 분에 대 한 미디어.
참고: 미디어는 4-8 ° c.에 최대 한 달 동안 저장 될 수 있다 - 가득-20 ° c.에 글리세롤에 보존 하는 S. cerevisiae 세포의 250 μ와 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 3 mL 원뿔 튜브를 예방 200 rpm 동요와 30 ° C에서 궤도 통에서 밤새 품 어.
- 페 트리 접시 (60 x 15 m m2) 살 균 2% YPD agar 가득 행진 (10 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 20 g 포도 당의 20 g 그리고 증류수 1000 ml의 세균 agar의 20 g 추가) 메 마른 루프를 사용 하 여 원뿔 튜브에 성장 하는 세포. 고립 된 식민지 성장을 표시 될 때까지 30 ° C에서 배양 접시를 품 어.
- 하나의 고립 된 식민지 가득한 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 10 mL 원뿔 튜브에 접종 하 여 사전 inoculum을 준비 하 고 200 rpm에서 지속적인 동요와 30 ° C에서 밤새 품 어.
2. 문화 미디어와 Microplate에 성장 곡선
- 1 %YPD 국물의 10 mL를 준비 (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g과 포도의 10 ml의 0.1 g에 증류수를 추가), 2 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 포도의 0.2 g 추가) 그리고 10 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 포도의 1 g 추가). 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분.
참고: 문화 미디어 일 성장의 컨트롤 역할을 합니다. - 2% 효 모 추출 물 펩 에탄올 (형식) 국물의 10 mL와 10 mL 2% 효 모 추출 물 펩 글리세롤 (YPG) 국물을 준비 합니다. 2%에 대 한 형식: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 에탄올의 0.2 mL를 추가. 2 %YPG: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 글리세롤의 0.2 mL를 추가. 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분.
참고: 글리세롤과 에탄올은 독점적으로 미토 콘 드리 아 호흡에 의해 물질 대사로 변화 비 fermentable 탄소 소스. 이러한 이유로, 호흡기 성장 컨트롤로 사용 됩니다. 이 단계에서 효 모 추출 물 펩 (YP) 국물 (10 g의 효 모 추출 물 및 증류수 1000 mL에 카 세 인 펩의 20 g)를 기본으로 하 여 성장 표현 형에 영향을 테스트 유형과 문화 미디어에서 탄소 소스의 농도 변경할 수 있습니다. 탄소 이외의 다른 영양소의 효과 테스트 하려면 합성 완료 (SC) 매체 실험의 목표에 따라 보충 된다. 사우스 캐롤라이나 매체에 대 한 자료는 아미노산, 황산 암모늄 5 g 없이 기본 효 질소의 1.8 g [(NH4)2등4], 1.4 g의 글루타민 인산 염 (NaH2포4), 드롭 아웃의 2 세대 1000 mL의 증류수에 혼합. 탄소 소스와 필요한 농도에서 추가 질소 소스 미디어를 보충. - 실험 설계에 대 한 적합 한 문화 미디어의 145 μ 뚜껑 살 균 미 판 (10 x 10-잘)의 각 음을 추가 하 고 사전 inoculum의 5 μ와 예방.
참고: 지금까지 목표는 화면에 누 룩의 에너지 대사 물질/화합물의 영향, 경우에 그 물질/화합물이이 단계 동안 추가 되어야 합니다. 또한, 모든 유형의 뚜껑 microplate 유용 해야 한다. - 다 잘 접시 200 rpm에서 48 h. 측정 600에서 광학 밀도 (OD)에 대 한 지속적인 동요와 30 ° C에서 microplate 리더에 품 어 nm 매 30 또는 60 분.
참고: microplate 리더에는 미 판 품 어 하는 옵션이 없는 경우 그것은 수 있습니다 알을 품는 OD의 모든 측정 사이 동일한 조건에서 궤도 통에.
3. 성장 곡선 소동된 원뿔 플라스 크에
- 20 mL 원뿔 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 4.8 mL를 추가 합니다. OD600nm ~ 2 쿨, 무 균 2 %YPD 국물에서에서 사전 inoculum 문화 200 μ와 각 플라스 크 예방 24 h에 대 한 250 rpm에서 일정 한 동요와 30 ° C에서 그들을 품 어.
참고: 잠복기 24 h 보다 높은 경우에, 50 mL 원뿔형 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 12 mL를 추가 합니다. 그들의 사전 inoculum 500 μ와 예방. 그것은 또한 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당) 및 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올)을 고려 하는 것이 중요. - 흔들린된 원뿔 플라스 크 문화 100 μ 걸릴 하 고 900 μ 1 mL 분 광 광도 계 베트에 증류수에 희석 pipetting으로 부드럽게 혼합. 600에서 OD를 측정 nm 마다 2 h 분 광 광도 계를 사용 하 여. 진짜 세를, 10에 의해 결과 곱하면 됩니다.
4. 데이터 처리 및 운동 매개 변수 계산
-
통계 패키지 소프트웨어에서 새 프로젝트 파일을 만듭니다. "새 테이블및 그래프" 섹션에서 "XY" 옵션을 선택 합니다.
- 옵션 선택: "예제 데이터" 섹션에서 "빈 데이터 테이블로 시작" .
- "포인트 및 연결선" 그래프 유형을 선택 합니다. "X" 섹션 "복제 또는 오류 값에 대 한 Subcolumns"의 세그먼트에서 선택 하지 않은 상태로 두고 "Y" 섹션 옵션을 선택: "나란히 subcolumns에서 (10) 복제 값을 입력 하 고 작의 의미 및 오류 SD". 만들기를 클릭 합니다.
참고: 테이블 형식 X 열 및 여러 Y 열, 각각 이전 선택 10 subcolumns 있다.
- 쓰기는 OD에 측정 X 열에서 찍은 시간 (예를 들어, 0, 30, 60, 90 분 또는 0, 1, 1.5, 2 h). Y 열에서 문화에서 가져온 OD 값을 작성 합니다.
- 로그 Y 열 데이터를 변환 하는 지 수 성장 단계를 식별 합니다. "분석" 버튼을 클릭, 선택 "변환" 분석, Y를 사용 하 여 Y 값 선택 = Log(Y). "결과의 갤러리", 선택 "변환" 데이터 테이블 "분석" 버튼을 클릭 하 고 "선형 회귀" 분석을 선택 이동 합니다. 선형 동작을 따르지 않는 OD 값을 제외 합니다. 값을 제외 하려면 데이터 테이블에 그들을 선택 하 고 "Ctrl + E"를입력 합니다.
참고: 그것은 이후 지 수 성장 방정식 잘 지 수 단계에 맞는 지 수 단계를 수행 하지 값을 제외 하는 것이 중요. - "데이터 테이블 갤러리"데이터 테이블 선택 "데이터 1". "분석" 버튼을 클릭 하 고 "XY 분석" 가운데 "비선형 회귀 (곡선 적합도)" 분석을 선택 합니다.
- 분석 하 고 "확인" 버튼을 클릭 하 여 데이터 집합을 선택 합니다. "맞춤" 탭에서 "지 수 방정식" 섹션을 선택 하 고 선택 "지 수 성장 방정식" ( X 는 세포 농도, X0 는 0에, μ 셀 농도 특정 성장 속도 이며 t 는 시간). 피팅 방법으로 "최소 제곱 적합" 사용 하 고 보간 섹션 선택 되지 않은 둡니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다.
참고: 비선형 맞는 결과 탭 "결과의 갤러리"입니다. 소프트웨어 두 배로 시간 (Dt)와 특정 계산 성장 율 (μ). 소프트웨어는 결과 탭에 K 로 μ 를 표시합니다. - 새 프로젝트 파일을 열고 "새 테이블 및 그래프" 섹션에서 열 선택을 선택 합니다. "빈 데이터 테이블로 시작" 옵션을 선택 하 고 원하는 그래프를 선택 합니다. Sd. "만들기" 버튼을 선택와 의미를 선택 합니다.
- "결과의 갤러리" 에 있는 비선형 맞는 결과 탭에서 μ 또는 Dt 값을 복사 하는 열에 붙여 넣을. 마지막으로, "분석" 버튼을 선택 하 고 다른 nutrimental 조건의 운동 매개 변수를 비교 하는 "열 분석" 섹션에 원하는 분석을 선택 합니다.
참고: 운동 매개 변수 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당)에서 얻은 고 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올) 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡의 임계값을 설정 하는 데 도움이 각각. 비교는 운동 영양 상태와 물질/화합물 호흡과 발효 성장 분석에서 매개 변수는 호흡 또는 발효 대사에 가능한 영향을 식별할.
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결과
성장 곡선 예비 호흡과 발효 효 모 S. cerevisiae 에서 고기를 구분을 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리 일 성장을 유도에 보고 된 다른 포도 당 농도 배치 문화 S. cerevisiae (BY4742)의 수행: 1%, 2% 및 10% (w/v)9. 문화 일 형을 보여주는 작은 지연 위상 있고 높은 성장 율 (그림 1)와 지 수 단계. 에탄올, 글리세롤, 및 젖 산 염은 호흡; 통해서만 metabolized 수 탄소 소스 따라서, 우리는 그 탄소 소스를 사용 하 여 효 문화를 수행. 주로 산화 인 산화에 의해 에너지를 얻는 문화 더 긴 래그 단계 및 성장 단계에서 지 수 (그림 2)의 느린 속도 보였다.
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토론
오랜 시간 이후 J. Monod10 표현 세균성 문화의 성장 연구 미생물학의 기본 메서드는 통과 했다. 분자의 출현 지연 사용 및 연구 기법으로 성장 합니다. 수많은 상호 프로세스를 포함 하는 성장의 복잡성에도 불구 하 고 그것의 근본적인 메커니즘 수학적 모델11을 사용 하 여 설명할 수 있습니다. 이것은 가장 복잡 한 분자 메커니즘12명료 하 상호 보완적인 도구로 사용할 수 있는 강력한 접근입니다.
이 방법에서 신뢰할 수 있는 결과 얻으려면, 그것은 다음 중요 한 단계를 고려 하는 것이 중요입니다. 250 rpm 동요 호흡기 성장, 교 반 속도 (150-180 rpm) 우리가 관찰 호흡기 조건에서 성장 감소 낮은 사용 하는 경우 때문에 발휘 하는 낮은 탄소 소스에서 좋은 성장을 달성 하는 데 매우 중요 하다. 신선한 소재를 사용 하는 프로토콜을 시작 ...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 프로젝트를 지원 하 여 부여 Consejo 나시오날 드 많은 y 과학 (보조금 번호 293940)와 Fundación TELMEX TELCEL (보조금 번호 162005585)의 IKOM를 둘 다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 오비탈 쉐이커 | Thermo Scientific | 4353 | 접종 배양 또는 원뿔형 파스크 배양용 |
| Bioscreen | 성장 곡선 | C MBR | 마이크로플레이트의 배치 배양용 |
| 포도당 | 시그마 | G7021 | YPD 육수 준비용 |
| 카제인에서 추출한 펩톤, 효소 분해 | Sigma | 82303 | YPD 육수 제제 |
| 효모 추출물 | Sigma | 09182-1KG-F | YPD 국물 준비 |
| 세균학 한천 | 시그마 | A5306 | YPD 한천 준비용 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | SC 육수 준비 |
| 용(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | SC 육수 준비용 |
| 아미노산과 황산암모늄이 없는 효모 질소 기반 | 시그마 | Y1251 | SC 육수 준비용 |
| 효모 합성 드롭아웃 매체 보충제 | Sigma | Y1501 | SC 육수 제제용 |
| 황산 암모늄 과립 | J.T. Baker | 0792-R | 중간 보충제 예 |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | 중간 보충제 예: |
| 갈락토오스 | 시그마 | G8270 | 중간 영양 보충 예: |
| 설탕 | 시그마 | S7903 | 배지 보충제의 경우 |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | 배지 보충제의 경우 |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | 배지 보충제의 경우 |
| GraphPad Prism | GraphPad 소프트웨어 | 데이터 분석용 | |
| Honeycomb 마이크로플레이트 | Thermo Scientific | 9502550 | 마이크로플레이트 배양용 |
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