마 취 쥐에서 중앙 신경 조작에 대 한 응답에서 신장 교감 신경 활동에 심각한 변화를 측정

심장 혈관 시스템의 자율 제어에 대 한 전 임상 발견 알려 고혈압, 심장 마비, 만성 신장 질환 등 질환을 관리 하기 위한 전략. 교감 신 경계와 감소 vagal 심장 톤의 과잉 활동 혈압 (BP)¹에 기여 한다. 만 성으로 높은 신장 동 정적인 유출 카 테 콜 아민 분 비를 강화 하 고 신장 혈, 심혈 관계/신장 시스템^2,3에 해로운 결과 감소. 자율 신경 부전으로 이어지는 neurobiological 경로 정의 하려면 설치류에 학문은 중앙 신경 시스템 (CNS)의 신경 공감 매개 변수를 조절 하는 방법을 결정 하기 위한 중요 한. 이 프로토콜의 목적은 신장 교감 신경 활동 (방사선학)을 측정 하는 것에 대 한 기술 정보를 제공 하 고 혈압과 마 취 쥐에서 CNS 조작에 대 한 응답에서 급성 교감 변화 측정에 대 한 기술 개요.

급성 (비-생존) 방사선학 측정 (지속적인 분 h)는 약리학, 전기로, 과학자는 CNS 프로브 것입니다 또는 optogenetically에 특정 핵의 기능을 결정 하는 쥐를 마 취 때 유용 합니다. 이러한 메서드, 독방 핵, periaqueductal 회색, 같은 구조를 사용 하 여 pedunculopontine tegmentum 고 rostral ventrolateral 정도 되어 조사 공감 매개 변수^{4, 규제 neurobiological 경로 정의 하 5,,67}. 이 방식은 조사를 CNS 목표를 식별 하는 데 중요 한의 자율 부전^8,9만성 모델에 추가. 이러한 실험을 완료 하려면 실험실 납땜, 외과 현미경, stereotaxic 프레임, microelectrode 증폭기 및 오디오 모니터 필요 합니다. 실험실에 존재 하는 요인 전기 소음을에 따라 수술/기록 영역 패러데이 케이지/접지 스트랩 방사선학 녹음에 전기 소음을 줄이기 위해 필요할 수 있습니다. 뇌 분석 조직 고정 필요 합니다, 관류 펌프 및 연기 후드가 필요 합니다. 데이터 디지털화 될 수 및 다양 한 분석 옵션 및 telemetric 신호를 통합에 대 한 호환성 여러 생리 소프트웨어/데이터 수집 (아날로그-디지털 컨버터) 단위^4,5를 사용 하 여 기록 .

설명 하는 모든 메서드는 시카고에 일리노이의 대학에서 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 바이 폴라 방사선학 전극 만들기

1. 전극을 만들려면 컷 스테인레스 스틸 와이어의 두 가지 길이가 약 18 mm. 약 15 m m 긴 튜브 폴 리 에틸렌 (PE-50)의 한 조각 잘라. 두 조각의 양쪽에서 튀어나와 와이어를 떠나 튜브에 와이어 피드.
2. 전선의 끝에서 절연체를 제거 떠나는 노출된 와이어의 2-3 m m 철사를 잘라 주세요. 한쪽 끝에 통해 노출 남성 핀 주름. 솔더 와이어를 안전 하 게 핀, 핀 커넥터 스트립 내부 보안 및 에폭시와 연결을 커버.
   참고: 빠른 연결/해제 악어 클립을 사용 하 여 납땜을 방지 하는 대체 방식이입니다.
3. 전극의 반대 끝에 노출 된 와이어의 2-3 mm를 떠나 전선의 끝에서 단 열을 제거 합니다. 작은 "브가" 모양의 uninsulated 철사에서 후크를 만들 철사의이 부분을 구 부.
   참고: 이것은 신장 교감 신경에 접촉 될 전극의 부분입니다. 그것은 튜브를 입력에서 액체를 방지 하기 위해이 끝을 밀봉 하는 것이 중요입니다. 실리콘 이나 에폭시 효과적으로 사용할 수 있습니다.

2. 마 취 관리 및 외과 사이트 준비

1. 남성 Sprague Dawley 쥐 (나이 9-11 주, 150-400 g 무게)에 마 취를 관리 합니다. 관리 pentobarbital 나트륨 50 mg/kg 복 (IP) 주사를 통해. 수술 중 마 취의 안정적인 비행기를 평가, 매 15 분 및 필요에 따라 다시 복용량 마 취 발가락-핀치 반사를 확인 합니다.
   참고: Pentobarbital 나트륨 (Nembutal) 방사선학^4,,56의 변조 방해 하지 않고 마 취의 지속적인된 비행기를 달성 하기 위해 이전 연구에서 사용 되었다. 이 프로토콜은 비 생존 수술 이므로 아무 복구/후-operative 모니터링 기간입니다.
2. 제도 동물 보호 지침에 따라 수술 사이트 준비 (즉., 쥐의 복 부, 뒤, 및 머리를 면도; 10 %povidone-요오드 솔루션 클렌징; 눈 윤활제; 적용 및 생리대에 쥐를 놓고). 실험 기간 동안 37 ° C에서 체온을 유지 한다.

3. cannulate 대 퇴 정 맥 (정 맥 액세스)에 대 한

1. 헤 파 린 (달성 20 단위/mL)을 0.9% 멸 균 식 염 수를 추가 합니다. 22 G 바늘을 통해 heparinized 염 분으로 1 mL 주사기를 채우십시오. 바늘을 솔루션 채우기 튜브 PE-50 튜브의 15 cm를 연결 합니다.
2. 부정사 거짓말 쥐와 사 타 구니 지역을 통해 2 cm 가로 절 개를 만듭니다. 면 끝 도포를 사용 하 여, 대 퇴 정 맥과 동맥을 노출 하는 결합 조직 해 부. 절 개를 오픈, 중 단일-후크 탄성 외과 투숙 실크로 수술 필드 확보 테이프 또는 작은 hemostats를 사용 하 여 적용 됩니다.
3. Hemostats를 사용 하 여 카 테 터 중개자¹⁰으로 90 ° 각도로 22 G 바늘의 끝을 구 부.
4. 현미경 아래 혈관을 시각화. 부드럽게 정 맥 및 동맥 곡선된 겸 자 사용 하 여 구분 합니다. 장소 두 12 cm 긴 정 맥 아래 5-0 비단 봉합 (한 원심 인접 한); 동맥 아래 같은 방식으로 봉합을 놓습니다.
   1. 정 맥; 가리고 하 원심 (아래) 봉합 넥타이 실크 테이프 또는 작은 hemostats 사용 하 여 수술 필드에이 봉합의 가장자리를 보호 합니다. 부드럽게 혈관 긴장 된 있지만 하지 너무 많은 힘 선박을 찢 어. 정 맥 외과 의사의 지배적인 손을에 수직 위치.
5. 근 위 봉합에 느슨한 overhand 절반 매듭을 사용 하 여 간단히 정 맥을 막다. 섬세 한 hemostatic 집게와 함께 부드럽게 혈액 흐름을 막다 하이 봉합 클램프. 비 지배적인 손에; 구부러진 팁 22 G 바늘을 잡으십시오 지배적인 손을 사용 하 여 집게와 튜브를 버클.
6. 카 테 터 중개자 (단계 3.3)와 정 맥에 작은 구멍을 찌를 하 고 그릇;에 (미리 heparinized 염 분 가득) PE-50 튜브를 삽입 구부러진된 바늘을 사용 하 여 용기 오픈에서 열기를 계속 배¹⁰에 카 테 터의 끝 위치에.
   1. 근 위 봉합을 놓고 부드럽게 정 맥;으로 heparinized 염 분의 0.2 mL를 플러시 카 테 터를 사전. 적절 한 배치를 위해 정 맥에서 혈액 반환을 확인 하십시오. 인접 매듭을 완료 하 고, 원심 봉합 넥타이, 튜브 안전 정 맥 내.
7. 실험 기간 동안 정 맥 액세스를 사용 하 여 추가 마 취 또는 약물 투여 및 혈액 컬렉션에 대 한. 경우 일반 정 맥 혼합 및 혈액 샘플링을 해야 합니다 3-방법은 커넥터를 통합 합니다. 마 취를 적정 유해 발가락 핀치 반사 15 분 마다 확인 합니다.

4. cannulate 평균 동맥 압력 모니터링에 대 한 대 퇴 동맥

1. 현미경 동맥을 시각화. 방법에 유사한 정 맥 cannulation 사용, 원심 봉합 (단계 3.4) 막다; 동맥을 묶어 실크 테이프로 수술 필드에이 봉합의 가장자리를 보호 하 고 동맥 외과 의사의 지배적인 손을에 수직 위치.
2. 동맥 액세스 압력 변환기/주입 시스템을 사용 하는 경우
   1. 500 mL 0.9% 식 염 수 백을 압력 변환기/튜브를 연결 합니다. 염 분, 모든 거품을 제거와 함께 튜브를 플러시 및 시스템 압력을 압력 유도 가방 안에 가방 장소.
   2. 3.1 단계에에서 설명 된 대로 1 mL 주사기 heparinized 염 분와 22 G 바늘을 통해를 PE-50의 15 cm (heparinized 염 분으로 튜브 플러시) 바늘에 연결.
   3. 근 위 봉합에 느슨한 절반 매듭을 사용 하 여 간단히 동맥을 막다. 카 테 터 중개자 (단계 3.3); 비 지배적인 손에 잡으십시오 지배적인 손에 선박 cannulation 집게와 PE-50의 원심 끝을 잡으십시오. 구부러진 22 G 바늘 동맥에 구멍을 찌를 하 고 선박에는 캐 뉼 러를 삽입.
   4. 동맥과 사전 가능한 카 테 테 르에 인접 봉합을, 부드럽게 플러시 heparinized 염 분의 0.2 mL를 놓습니다. 동맥 혈액 반환 되도록 적절 한 배치를 확인 합니다. 인접 매듭을 완료 하 고, 원심 봉합 넥타이, 안전 튜브는 동맥 내부. 압력 변환기/튜브를 동맥 라인을 연결 합니다.
      참고: 튜브의 원심 부분 동맥 라인을 확보 하 여 쥐의 hindlimb에 녹화 될 수 있습니다. 선박 cannulation 대체 접근 Jespersen 외설명.; ¹¹ 그들의 프로토콜 봉합 하는 관과 접근 확보 보다는 절 개를 접착제 오히려 확산을 견인 기를 사용 하 여 다른 팬 들은 구부러진된 바늘 중개자의 정보를 포함 하지 않습니다.
3. 동맥 액세스 원격을 사용 하는 경우
   1. 동맥 cannulation 전에 고배율에서 압력 감지 카 테 터를 검사 합니다. 테 거품/파편의 무료 하 고는 그대로 초승달 액체가 채워진 사이 (근 위)는 확인 및 젤 가득 (원심) 구성 요소. 각 이식 전에 카 테 터의 원심 끝에 젤 리필. 자석;를 사용 하 여 송신기 설정 완벽 한 배치를 견 뎌 야 하는 수술 중 혈압을 모니터링 합니다.
   2. 근 위 봉합에 느슨한 overhand 절반 매듭을 사용 하 여 간단히 대 퇴 동맥을 막다. 비 지배적인 손에 잡고 테 중개자 (단계 3.3). 팁에서 젤 displacing 피하기 위해 선박 cannulation 집게와 원격 측정법 단위의 정 맥의 끝을 잡으십시오.
   3. 구부러진 22 G 바늘 동맥에 구멍을 찌를 하 고 팁에서 젤 displacing 피하기 위해 선박 cannulation 집게를 사용 하 여 동맥에는 정을 삽입. 정까지 가능한 사전. 인접 하 고 원심 봉합 관계를 사용 하 여 보안 압력 테.
   4. 절 개에 인접 한 측면 내부 원격 임 플 란 트의 시체를 턱 하 고 절단 바늘에 4-0 나일론 봉합 사를 사용 하 여이 절 개를 닫습니다. 배터리 수명을 보존 하는 기록의 결론에 자석에 의해 원격 장치를 해제 합니다.

5. 위치는 쥐 두뇌에 액세스할 Stereotaxic 수술 프레임에

1. 부드럽게 stereotaxic 수술 프레임에서 발생 하기 쉬운 위치에 쥐를 이동합니다.
2. 귀 바 사이 쥐 놓고 람다와 bregma의 높이 맞춰야 하 니 막대를 조정 합니다. 포지셔닝 쥐 긴장, 무게, 및 CNS 대상의 위치에 달려 있습니다.
3. 2 cm rostrocaudal 메스 절 개를 중간 선 통해 두 피를 확인 합니다. 결합 조직 두개골 표면에서 제거 단단히 면 밀고 도포를 사용 하 여. Bregma, 람다, 중간 봉합 시각화에 도움을 두개골에 과산화 수소를 적용 합니다.
4. 쥐 뇌의 아틀라스를 사용 하 여 대상¹²가이드, 드릴 버 구멍 뼈, 두개골을 통해 전극 액세스에 대 한 크기.

6. 신장 교감 신경 차단

1. 10 X 프리 앰프와 microelectrode 앰프 와이어 방사선학 전극 (1.1-1.3 단계)를 연결 합니다.
2. 이전에 후 절 개를 통해 또는 쥐 stereotaxic 프레임에 고정 한 후 신장 신경 분리. 일단 쥐 stereotaxic 프레임에 방사선학 전극 위치. 4-5 cm 꼬리 방향으로, 약간 척추 옆 갈비뼈 아래에서 확장 메스 절 개를 확인 합니다. 무뚝뚝한 시각화 paraspinal 근육을 절 개 해 부.
3. 지방 근육 만나는 매우 피상적 1-2 cm rostrocaudal 절 개를가 위를 사용 합니다. 도포 면 스쳐를 사용 하 여 시각화 신장에 근육에서 지방 확산. 그것은 복 막 공간을 입력 하지 해야 합니다.
4. 견인 기를 사용 하 여 부드럽게 신장 신장 동맥 및 복 부 대동맥을 시각화 paraspinal 근육에서 분리. 신장 신경의 손상을 방지 하려면 지나치게 배 스트레칭 하지 않습니다. 2 "x 2" 코 튼 거 즈 패드를 식 염 수에 담가 사용 하 여 신장 상해에서 보호 하기.
5. 높은 확대, 아래 절 개 포켓에 신장 신경 식별 합니다. 신경 다발 대동맥 및 신장 동맥에 의해 형성 된 오른쪽 각도에서 가장 쉽게 볼 수 있습니다. 신장 신경 밀접 하 게 따라 신장 동맥은 대동맥에서 신장.
6. 기록 전극에 배치 될 것입니다 신경 다발의 세그먼트를 선택 합니다. 마이크로 해 부 핀셋을 사용 하 여 주변 조직/선박에서 신경 섬유를 부드럽게 해 부.
7. 보안에 홀더 와이어 방사선학 전극 (예., 악어 클립 지원 서에 부착). 전극 신경 세그먼트의 수준 낮은. 신경 후크를 사용 하 여 부드럽게 신경 스트레칭 없이 전극에 신장 신경의 세그먼트를 들어올립니다.
   참고: 신경 uninsulated 철사, 신경에 병렬에 갈고리 모양의 두 "V" 안으로 휴식 해야 한다. 전극 와이어는 다른 조직, 혈액, 또는 림프 액을 만지지 해야 합니다.
8. 미네랄 오일 노출된 신장 교감 신경 건조 되기에서 방지 하기 위해 절 개를 입력 합니다. 절 개 되 고 패러데이 케이지에 연결 된 다른 피부에 한쪽 끝을 접지 클립을 사용 합니다.
9. 높은 및 저역 통과 필터 (10 Hz 및 3 kHz)를 사용 하 여 앰프에 신호를 직접. 10 공화국 포함은 방사선학의 붕괴 패턴을 평가 하기 위해 오디오 모니터 최대 이득을 조정 합니다. 2000-10000 Hz^4,5,6,,78사이 배열 하는 샘플링 속도 사용 합니다. CNS 조작 급속/간단한 동정 응답을 가설 하는 경우는 증가 샘플링 속도 사용 합니다.

7. 레코드 데이터

1. 정 맥 염의 1 mL 또는 (에서 0.1 mL) 10 µ g/mL phenylephrine의 bolus 주사로 baroreflex을 evoking 하 여 방사선학 녹음의 품질을 평가 합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 주입 혈압을 증가 하 고 방사선학을 억제 한다. 60-80 mmHg의 평균 동맥 압력 증가 신장 sympathoinhibition^4,,1314에 대 한 충분 하다.
2. 필요한 경우 신호를 개선 하기 위해 전극의 위치를 조정 합니다. 신경 두 후크 전극에 접촉 하지 않습니다 또는 어떤 조직, 혈액, 또는 림프 액체 전선을 접촉 하는 경우 위치를 변경 하는 것이 필요 합니다.
   참고: 위치에 대 한 필요는 신경 방전의 청각 특성에 근거한 다.
   1. 방사선학의 버스트 심장 주기, 주기적 발생 하지 경우 기록에서 어떤 방해는 전극 위치 신중 하 게.
   2. 호흡 운동 또한 방사선학 녹음의 품질에 영향을 미칠 수, 부드럽게 위치 어디 근육의 움직임을 중단 하지 않습니다 전극 호흡 동안에 전극으로 이동 하 여 신호를 향상.
3. 명확한 신호를 얻을 일단 철수 미네랄 오일 절 개 포켓에 신경/전극 연결을 커버 하는 실리 카 젤을 적용 하 여 장소에 방사선학 전극 보안. 젤은 완전 하 게 설정 하기 전에 쥐를 이동 하지 마십시오.
4. 지속적으로 방사선학을 기록 하는 동안 CNS 조작 프로토콜을 수행 하 고 동맥 압력을 의미. Brainstem 조작에 대 한 microinjector/펄스 발생기를 사용 하는 경우이 장치에서 로직 신호 CNS 조작의 타이밍을 문서화 하는 방사선학/혈압 녹음에 도입 수 있습니다.
5. 실험 완료 되 면 실리 카 젤 및 척추 근육 사이 기록 전극에 인접 신경 분쇄 하 여 잡음 레벨을 결정 합니다. 방사선학^4,,56에 대 한 값이 "0"의 기록 이상 30 s. 로 측정 잡음에 대 한 다른 접근 방법, 아트로핀, 늄, chlorisondamine, 또는 pentolinium 주석산^8,,1516, 같은 짧은 연기 절 차단 관리 ¹⁷.
6. 조심 스럽게 방사선학 전극 제거 하 고 와이어 전극에서 실리 카 젤의 모든 흔적을 제거. 재사용에 대 한 전극을 저장 합니다. 원격 트랜스미터를 끄고, 카 테 터의 끝을 손상 하지 않도록 주의 복용 제거.

8입니다. 안락사 (Transcardiac 관류)

1. 염료 나 형광, 전해질 장애, 만드는 주입 또는 c-fos 식의 감지 하 여 CNS 조작의 위치를 식별 합니다.
2. 뇌 분석 고정 필요 합니다, 쥐 transcardiac 관류에 대 한 준비. 쥐 마 취 깊이 남아 있도록 발가락 핀치 반사를 평가 합니다. 필요한 경우 추가 마 취를 제공 합니다. 증기 두건에서 transcardiac paraformaldehyde 정착 액의 관류를 수행 합니다.
   주의: 열렬 한 피부/눈 자극입니다.
3. 관류 펌프 및 0.9% 정상적인 염 분으로 총리에 튜브를 삽입 합니다.
4. 피부와 흉 곽 아래 즉시 복 벽을 통해 5-6 cm 옆 절 개 하 고 흉을 엽니다. 횡 경 막에서 간을 조심 스럽게 분리 합니다. 곡선된 무딘가 위를 사용 하 여 횡 경 막에 작은 절 개를 확인 합니다. 좌 심 실에 직접 헤 파 린 0.1 mL를 주사.
5. 그것은 마음에 puncturing 어느 여 좌 심 실 (스테인리스 gavage 바늘이이 단계에 대 한 잘 작동)로 관류 바늘을 전달 하거나 작은 절 개를 절단 하 여 날카로운가 위를 사용 하 여 고 통과 gavage 바늘을 통해 팁은 통해 볼 수 있는 대동맥의 벽 (하지만 대동맥 아치에 도달 하지 한다). 수술 또는 전기 클립을 사용 하 여 장소에 바늘을 확보.
6. 주입 펌프를 사용 하 여 0.9% 정상적인 염 분 (실내 온도) 관리. 바로 염 분 린스에 대 한 콘센트를 만들려고 오른쪽 아 트리 움 2-3 m m 절 개를 만듭니다. 하강 대동맥을 잘라 하지 않습니다. 염 분 린스까지 간 변경 색상 레드/브라운에서 옅은 노란색, 약 400 mL의 주입을 계속 2-3 분 이상.
7. 펌프를 중지 합니다. 정착 액에는 perfusate를 전환 (예., 10% 포 르 말린 또는 4 %paraformaldehyde); 400 mL 주입 2-3 분 이상 두뇌를 제거 하 고 적어도 3 일 동안 또는 두뇌 싱크 될 때까지 조직 30% 자당 (30 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 100 mL에 용 해 하는 자당의)를 전송 하기 전에 4 ° C에서 하룻밤 통 솔루션에는 견본 저장 단면¹⁸cryogenetic 전에 cryoprotection에 대 한.

9. 데이터 분석

1. 전체 웨이브는 절대 값을 가져올 원시 방사선학 해결할. 전체 웨이브 원시 잡음 신호의 10 s 세그먼트를 해결할. 그것은 낮은 신호 대 잡음 비율에 의해 영향을 받는 모든 연구를 제외 해야 합니다. 연구에서 방사선학을 측정, 조사 요구 신호 잡음 비율을 2:1 6:1 ~^17,,1920초과 같은 선험적 기준 적용.
2. 평균 겹치지 않는 세그먼트 (µ V)에 대 한 방사선학 정류 및 잡음 견적 (µ V) 빼기 계산 합니다. 실험의 목적에 따라 수 사관 10 등 간격을 선택할 수 있습니다 (그림 1) 또는 1 s. 계산에 대 한 평균을 계산 하 생리 소프트웨어에서 파형 분석 옵션을 사용 하 여 스프레드시트에 데이터를 내보낸 의미 선택한 시간 간격입니다.
3. 다른 동물에서 정상화 하는 비율 기준에서 변화 추가 분석에 대 한 값 표현 한다. 파라메트릭 통계를 사용 하 여 그룹 비교를 실시.

그림 1 샘플 방사선학과 혈압 기록을 Nembutal 취 쥐에서 보여 줍니다. 평균 동맥 압력의 증가 유도 하 고 baroreflex 및 과도 sympathoinhibition4,6연상 phenylephrine의 정 맥 주사 사용 되었다. 척도 방사선학, 원시 방사선학 정류 되었고 겹치지 않는 10 s 세그먼트;에 대 한 평균 소음 예측은 각 세그먼트에서 뺍니다.

그림 1: 방사선학과 phenylephrine 주입 IV에 대 한 응답에서 혈압. 원시 방사선학 (A)는 전파 정류 (B); 짓 눌린된 "0"을 정류 방사선학 인세트 C에 표시 됩니다. (잡음) 마이너스 10 s 평균 비 중복 계산 된 (D). 연상은 baroreflex, 0.1 mL phenylephrine (1 µ g/mL)의 정 맥 (화살표)에 주입 했다. Bolus 주입 혈압 및 일시적인 억제 방사선학의 갑작스러운 증가 elicited. 이 수치는 핑크 오전, 딘 C, 피아노 씨, 칼 리 DW에서 적응 시켰다. Pedunculopontine tegmentum 신장 교감 신경 활동 및 Nembutal 취 쥐에서 심폐 활동을 제어합니다. PLoS 하나입니다. 2017. 12 (11): e01879564. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

앤 M. 핑크는 데이터 과학 국제 고객 자문 위원회의 일원 이다.