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방법 논문

합성 및 Placental 콘의 황산 (plCSA)-지질 타겟팅-고분자 나노 입자

7.8K 조회수

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DOI:

10.3791/58209

⸱

2018년 9월 18일

 ,  ,  , 
1Laboratory for Reproductive Health, Institute of Biomedicine and Biotechnology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (CAS), 2Guangdong Key Laboratory of Nanomedicine, CAS Key Lab for Health Informatics, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (CAS), 3Department of Chemistry, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 선물이 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (plCSA-BP)의 합성에 대 한 프로토콜-지질 고분자 나노 입자를 통해 단일 단계 쥡니다 bioconjugate 기법을 활용. 이 입자는 가장 인간의 종양 및 암 및 태 반 장애 치료에 태 반 trophoblasts 치료제의 대상된 배달에 대 한 새로운 도구를 구성 합니다.

초록

효과적인 암 치료 방법 감소 하 고 최소한의 조직 독성으로 종양을 제거 합니다. 적극적으로 대상 나노 암 치료 하는 유망한 접근 방식을 제공합니다. glycosaminoglycan placental chondroitin 황산 염 (plCSA)에 다양 한 암 세포와 태 반 trophoblasts 및 말라리아 단백질 VAR2CSA plCSA 바인딩할 수 있는 구체적으로 표현 된다. 암 세포와 태 반 trophoblasts plCSA 보고 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (BP plCSA), 말라리아 단백질 VAR2CSA에서 파생 또한 구체적으로 바인딩할 수 있습니다. 따라서, plCSA BP 활용 된 나노 입자는 인간의 암 및 placental trophoblasts 대상된 약물 전달에 대 한 도구로 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 독 소 루비 (plCSA-DNPs); 로드 plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 방법 단일 쥡니다 단계 및 bioconjugate 기술 방법에 의하여 이루어져 있다. 또한, plCSA-DNPs, 그들의 물리 화학적 특성 및 태 반 choriocarcinoma (JEG3) 셀에 의해 세포질 통풍 관을 결정 하는 포함 한 특성화를 위한 여러 가지 방법은 설명 합니다.

서론

효과적인 암 치료 방법 감소 하 고 최소한의 조직 독성으로 종양을 제거 합니다. 따라서, 선택적 종양을 대상으로 성공적인 치료 방법을 탐구 하는 열쇠입니다. 암 치료를 위한 유망한 기회를 제공 하는 나노 입자 그리고 다른 기능적인 그룹 분자 어셈블리 약물 효능을 강화 하 고 관련된 부작용1,2감소. 또한, 나노 시스템은 주로 수동 및 활성 대상 종양3연결할 대상 사용 합니다.

수동 타겟팅 나노 입자와 향상 된 침투성 및 종양 세포에 도달 하는 보존 (EPR) 효과의 타고 난 특성을 이용 한다. 양이온 리 종양 임상 응용4,,56에 다양 한 항 암 제 약물 전달에 성공적으로 사용 되었습니다. 잠재적인 효과적인 암 치료 효과도 불구 하 고 종양과 정상 조직에서 종양 세포를 구별 하는 무 능력에서 낮은 약물 농도 수동 타겟팅 나노7의 두 가지 주요 제한.

활성 타겟팅 전략 활용 항 원-항 체, 리간드-수용 체와 특히 종양8약물을 전달 하기 위해 다른 분자 인식 상호 작용. glycosaminoglycan placental chondroitin 황산 염 (plCSA)은 대부분 암 세포에 placental trophoblasts 광범위 하 게 표현 된다. 또한, 말라리아 단백질 VAR2CSA 바인딩할 수 있습니다 특히 plCSA9,10. 따라서, VAR2CSA는 인간의 암 세포를 대상으로 하는 도구 수 있습니다. 그러나, VAR2CSA은 나노 입자를 활용 때 전체 단백질 종양 세포에 나노 입자의 침투를 제한할 수 있습니다. 최근에, 우리는 plCSA 바인딩 펩 티 드 (BP plCSA), 말라리아 단백질 VAR2CSA에서에서 파생 된 발견. plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자는 급속 하 게 choriocarcinoma 세포와 크게 증가 독 소 루비 (DOX) 항 암 제 활동 vivo 에서11;에 보 세 이 입자는 또한 특별히 placental trophoblasts에 접착 하 고 태12약물의 타겟된 납품을 위한 도구가 될 수 있을.

지질 고분자 나노 입자는 지질 단층 셸 및 소수 성 고분자 코어의 구성 고 약물 전달에 대 한 새로운 캐리어를 대표 한다. 이러한 나노 리 및 제어할 수 있는 나노 입자 크기, 높은 생체 적합성, 지속적인된 약물 방출, 높은 마약 로드 (르), 효율과 우수한 안정성13등 고분자 nanocarriers의 장점을 결합합니다. 이 작품에서는, 우리는 지질 고분자 나노 입자를 합성 하 단일 단계 쥡니다 메서드를 사용. 이 방법은 빠르고, 편리 하 고 확장에 적합 및 널리 이용 되는 지질 고분자 나노 입자를 준비 우리의 그룹11,14 다른 사람에 의해15,,1617,18 .

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC) 아민 및 carboxylates19를 포함 하는 생체 변화에 대 한 교차 결합 시키는 대리인으로 사용 하는 인기 있는 carbodiimide 이다. EDC, 뿐만 아니라 N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)은 표면 및 나노 활용 반응20,21에서 가장 일반적인 활용 시 약 이다. 보 건국 측 반응의 수를 줄일 수 및 안정성을 향상 하 고 에스터의 수율 중개자22,23.

여기, 우리는 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, DOX 로드 지질 고분자 나노 입자 (DNPs)의 단일 단계 쥡니다 합성 설명 되어 있습니다. 그런 다음, plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 생성 하기 위한 EDC/NHS bioconjugate 기술 도입. 이 bioconjugate 기술은 또한 다른 항 체와 펩 티 드 나노 입자를 켤레를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자의 특성을 사용 하는 물리 화학적 속성 및 생체 외에서 분석 결과 설명 합니다. 우리는 이러한 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자 가장 인간의 암과 태 반 장애 치료에 태 반에 페이로드의 대상된 배달 하는 약물의 타겟된 배달에 대 한 효과적인 시스템을 구성 수 있습니다 믿습니다.

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프로토콜

1입니다. 재고 솔루션의 준비

  1. 초순의 100 mL와 절대 에탄올의 4 mL를 희석 하 여 4% 에탄올 용액을 준비 합니다. 4 ° c.에 솔루션 저장
    참고: 초순 박테리아, 입자, 이온, 또는 nucleases 등 오염 물질 없이 물으로 정의 됩니다. 초순 까지의 18.2 ㏁, 낮은 음이온 오염 즉 대상 저항력과 물 정화 시스템에서 얻은 했다.
  2. 20 mg의 콩 레 시 틴 4% 에탄올 용액 20 mL에 용 해 하 여 1 mg/mL 콩 레 시 틴 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에는 콩 레 시 틴 재고 솔루션 저장
  3. 100mg DSPE-말뚝-COOH의 4% 에탄올의 수성 해결책의 4 mL에 용 해 하 여 25 mg/mL DSPE 말뚝 (2000)-COOH 재고 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 재고 솔루션 저장
  4. 초순의 5 mL에 DOX의 50 밀리 그램을 용 해 하 여 10 mg/mL DOX 재고 솔루션을 준비 합니다. 어둠 속에서 4 ° C에 DOX 재고 솔루션을 저장 합니다.
  5. 20mg PLGA의 이기의 10 mL에 용 해 하 여 2 mg/mL PLGA 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에서 PLGA 재고 솔루션 저장
    주의: 이기는 가연성 및 독성. 증기 두건에 주의 하며 적절 한 개인 장비, 실험실 코트, 안전 유리, 라텍스 장갑 등을 착용 한다.
  6. 2.17 g MES의 초순 물 100 mL에 용 해 하 여 0.1 m M 2-(morpholino) ethanesulfonic 산 (MES, pH 6.0) 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에 재고 솔루션 저장

2입니다. DNPs의 합성

참고: DOX 광화학 저하를 방지 하려면 모든 작업 어둠 속에서 수행 했다.
나노 입자는 이전에 보고 된 단일 단계 쥡니다 방법11,13,14에 의해 합성 되었다.

  1. 살 균 10 mL 원심 관에 4% 에탄올 용액 3 mL를 추가 합니다. 다음, 콩 레 시 틴 재고 솔루션의 90 µ g, DSPE-말뚝-COOH 재고 솔루션의 210 µ g와 DOX 재고 솔루션의 750 µ g의 4% 에탄올 용액 3 mL를 추가 합니다.
  2. 얼음 목욕으로 원심 분리기 튜브를 놓고 초음파 프로세서에 얼음 목욕을 배치 합니다.
  3. 1 mL 주사기 원심 분리기 튜브에 dropwise PLGA 재고 솔루션의 2 mg (1 드롭/4-6 s) 플라스틱. 한편,는 DNPs 합성 20 kHz의 주파수 및 5 분에 대 한 30%의 출력 진폭에 초음파 프로세서를 사용 하 여 튜브 sonicate.
    참고: 작은 크기와 균일 한 입자를 합성 하는 PLGA 솔루션은 틈에 다 떨어뜨린 튜브에 속도 느려질 수 필요가 및 거품 발생을 피해 야 한다.
  4. DNPs 0.1 M MES 버퍼 (pH 6.0)에 위의 솔루션을 세척 하 여 정화 3 번 사용 하 여 원심 분리기 필터 (MWCO, 10 kDa). 4 ° C에서 원심 분리기와 3 분 때마다 1000 × g 마지막으로, 약 1 mL MES 해결 나노 입자의 있어야 합니다.
    참고:이 절차에서 허용 중지 지점입니다. 그렇지 않다면 켤레 펩 티 드에 사용 되는 나노 입자 수 정화 PBS 버퍼 (pH 7.4)에 의해 고 정화 DNPs 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 될 수 있다.

3입니다. DNPs에 펩 티 드의 활용

  1. 에스테 르 활성화
    1. EDC의 0.4 mg을 추가 (최종 농도 2 m m) DNPs의 1 ml.
    2. 반응에 NHS의 0.24 mg을 추가 (최종 농도 2 m m).
      참고: 쉽게 추가 EDC와 보 건국의 정확한 수량, 재고 솔루션 수 있습니다 준비는 시 약은 녹이 고 즉시 사용 하는 경우.
    3. 잘, 반응 구성 요소를 혼합 하 고 통;에 반응 장소 어둠 속에서 실 온에서 반응에 대 일 분-1 시간을 허용 합니다.
  2. 아민 반응
    1. 증가 버퍼 pH 7.2-7.5를 사용 하 여를 PBS (20 ×, pH 7.4).
    2. 반응 솔루션에는 plCSA을 대상으로 펩 티 드 (plCSA-혈압, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC)의 0.5 mg을 추가.
      참고: 또한, 전에 20% 이기에 펩 티 드를 용 해. 펩 티 드를 분해할 수 없는 경우, 목욕 sonicator에 쥡니다 도움이 있습니다.
    3. 혼합 솔루션을 잘, 그리고 통;에 장소 밤새 어둠 속에서에서 4 ° C에서 진행 하는 반응을 수 있습니다.
    4. 투 석 가방 (MWCO, 3500 다) dialyze plCSA DNPs 정화 하 켤레 솔루션 장소 어둠 속에서 24 시간 실 온에서 PBS (pH 7.4) 버퍼를 사용 하 여.
      참고: 또는, 정화 수 수행 단계 plCSA DNPs를 2.4에서.
    5. 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 침전 제거 하 0.22 μ m 무 균 주사기 필터를 통해 재구성된 솔루션을 필터링 합니다.

4. plCSA-타겟 지질 특성-고분자 나노 입자

  1. 동적 산란 (DL)을 사용 하 여 유체 나노 크기의 측정
    1. 초순 수 (50-fold 희석)와 나노 입자를 희석. DL 또는 제타 잠재적인 악기의 지시에 따라 멧에 500 µ L의 샘플을 로드 합니다.
      참고: Zeta 잠재력과 DL 큐 벳 다 수 있습니다 악기의 사양에 따라.
    2. 측정 완료 후 입자 직경, 증가할수록 인덱스 (PDI)와 제타 잠재적인 기록 합니다. 평균 4에서 얻은 결과 판독, 반복 하 고 표준 편차를 계산.
  2. 전송 전자 현미경 (TEM)
    참고:는 나노 입자의 형태 부정적인 얼룩 방법으로 TEM으로 관찰 되었다. 24
    1. 초순 수 (400-fold 희석)와 나노 입자를 희석. TEM grid에 샘플의 20 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 앉아 있게.
    2. 2% (w/v) phosphotungstic 산의 100 µ L을 추가 하 고 2 분 윅 거리는 물방울 앉아 허용.
    3. 실 온에서 가장 표를 건조.
    4. 80 편 가속 전압 설정 kV, 100000 ×는 나노 입자를 시각화 하는 이미지를 확대.
  3. 캡슐화 효율 (EE)의 결정 및 르
    1. 표준 곡선 생성입니다. 5 다른 농도의 DOX 솔루션 준비 하 초순에 DOX 분해: 1 µ g/mL, 5 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL, 및 100 µ g/mL. 480에 DOX 솔루션의 흡수 측정 nm UV 마주 분석기. DOX 농도에 따라 표준 곡선을 생성 합니다.
    2. 초순의 500 µ L와 나노 입자의 25 µ L를 희석. 480에 흡수 측정 nm UV 마주 분석기. 표준 곡선에 의해 약물 농도 계산 합니다.
    3. 다음 수식을 사용 하 여 르 계산:
      르 = ((나노 입자에 약물의 양) / (총 재료의 무게)) × 100%.
    4. 다음 수식을 사용 하 여 전자 계산:
      EE = ((나노 입자에 약물의 양) / (금액 추가 약)) × 100%.
  4. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 사용 하 여 활용 효율의 측정 25 , 26 , 27
    1. 중복에 미 판 우물에 표준 펩타이드 솔루션 (표 1) 또는 plCSA DNPs의 25 µ L 플라스틱. 각 잘 200 µ L 작업 시 약의 추가 하 고 혼합 30 판 통에 잘 접시 s.
    2. 커버 플레이트, 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    3. 562에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에 nm. PlCSA-DNPs의 plCSA 농도 계산 하는 생성 된 표준 곡선을 사용 합니다.
    4. 다음 수식을 사용 하 여 활용 효율을 계산:
      활용 효율 = ((펩 티 드에 나노 입자의 양) / (금액 추가 펩 티 드)) × 100%.
유리병희석제 (μ)의 볼륨볼륨 및 펩 티 드 (μ)의 소스마지막 펩 티 드 농도 (μ g/mL)
A0재고의 3001000
B250유리병 희석 250500
C250유리병 B 희석의 250250
D250유리병 C 희석의 250125
E300유리병 D 희석의 20050
F250유리병 E 희석의 25025
G400유리병 F 희석의 1005
H50000

표 1입니다. 표준 펩 티 드의 준비

5. 형광 현미경 검사 법 평가 Choriocarcinoma (JEG3) 세포에 나노 통풍 관 plCSA 대상

  1. 씨앗에서 1.0 × 10 살 균 12-잘 접시에 셀4 셀/잘 완전 한 DMEM/F12 (cDMEM/F12, 1% 페니실린/스와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함). 습 한 조건 하에서 37 ° C, 5% CO2 60% 합류에 성장 셀 수 있습니다.
  2. 미디어를 제거 하 고 차가운 신선한 미디어 콘텐츠를 낮은 혈 청 1 mL을 추가 (5 %FBS) 및 DNPs 또는 plCSA-DNPs (DOX 상응의 5 µ g).
  3. 셀과 1 시간에 4 ° C에서 나노 입자의 혼합물을 품 어.
  4. 부 화, 이후 미디어를 제거 하 고 3 회 PBS로 세포 세척. 그런 다음, 신선한 cDMEM/F12의 1 개 mL를 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
  5. CDMEM/F12, 제거 하 고 3 회 PBS로 세포 세척.
  6. 찬 4 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 해결 하기 위해 15 분 동안 실 온에서 품 어.
  7. PFA는 제거 합니다. 2 mL PBS의 셀을 한 번 세척. DAPI를 포함 하는 PBS의 1 mL를 추가 (1 µ g/mL) 얼룩, 핵에 대 일 분 동안 실내 온도에 품 어 고.
  8. PBS, 발음 하 고 세 번 PBS 가진 세포를 씻어.
  9. 설치 매체를 추가 하 고 시각화 DOX와 핵, 각각 녹색 및 파랑 채널을 사용 하 여 형광 현미경으로 형광 이미지.

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결과

이 프로토콜에서 PLGA, DSPE-말뚝-COOH와 콩 레 시 틴은 대표적인 폴리머, 지질-말뚝-COOH 공액 및 지질, 각각. EDC/NHS 기술과 쥡니다 메서드 를 통해 단일 단계 plCSA 대상 지질-폴리머 나노 입자의 합성은 그림 1에 나와 있습니다. 첫째, 조건 하에서 쥡니다, 콩 레 시 틴, PLGA와 DSPE-말뚝-COOH 자기 조립 형태의 코어-쉘 구조 DNPs. 핵심 PLGA와 캡슐화 된 DOX 이루어져, 셸 구성 DSPE-말뚝-COOH, 그리고 껍질과 코어의 인터페이스에는 콩 레 시 틴 단층. 다음,-COOH 그룹 DNP 표면에 노출 되는 펩 티 드 를 통해 EDC/NHS 기술을 합성 plCSA DNPs의-NH2 그룹으로 활용 했다.

이 프로...

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토론

이 프로토콜에는 plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 합성 한 효율적이 고 재현 가능한 방법을 제공 한다. 지질 고분자 나노 입자를 준비 하는 단일 단계 쥡니다 메서드는 재현할 수 빠르고 난방, vortexing, 또는 증발을 포함 하는 일반적인 nanoprecipitation 방법에서 다른. 따라서, 개발된 방법은 크게 합성 시간을 줄일 수 있습니다. 또한,이 프로토콜에 사용 된 EDC/NHS bioconjugate 켤레 펩 티 드 및 나노 입자에 항 체를 일반적으로 사용 하 고 편리한 기술입니다. 따라서, 조합 plCSA을 대상으로 지질-폴리머 합성 EDC/NHS bioconjugate 기술로 단일 단계 쥡니다 메서드의 나노 확장할 수 있습니다 임상 응용 프로그램에 대 한.

특정 절차는 성공적으로 합성 및 plCSA DNPs에 대 한 중요 합니다. 첫째, 레 시 틴, PLGA와 DSPE-말뚝-COOH의 상대 농도 지질 고분자 나노 입자 크기와 증가할수록 결정합니다...

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공개 사항

X.F.와 B.Z.는 특허 PCT/CN2017/108646와 201710906587.6 님 민 plCSA 대상 나노 입자 합성 방법 및 응용 프로그램에 발명가. 잠재적인 충돌의 관심은 다른 작가 의해 공개 됐다.

감사의 글

이 작품에는 자연 과학 재단의 광둥 성 (2016A030313178), 국가 자연과학 기초 (81571445 및 81771617)와 중국의 개발 프로그램 (2016YFC1000402), 국가 핵심 연구에서 교부 금에 의해 지원 되었다 X.F. 및 X.F.에 심천 기본 연구 기금 (JCYJ20170413165233512)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
plCSA 펩타이드상하이 GL Biochem펩타이드 합성을위한573518
에탄올 절대Sinopharm 나노 입자 합성을위한10009218
대두 레시틴Avanti Polar Lipids나노 입자 합성을위한441601
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids나노 입자 합성
을위한 880125독소루비신나노 입자 합성을 위한체미컬113424
아세토니트릴상하이 링펑나노 입자 합성을 위한
1008621 PLGA시그마-알드리치719897나노 입자 합성을 위한
초음파 프로세서SonicsVCX130나노 입자 합성을 위한
원심분리기 필터 (MWCO 10 kDa)밀리포어나노 입자 정제
원심분리기노 입자 정제시그마3-18KS
-[모르폴리노]에탄술폰산(MES)펩타이드 접합용시그마-알드리치M3671
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC)펩타이드 접합용시그마-알드리치3450
N-하이드록시숙신이미드(NHS)펩타이드 접합용Sigma-Aldrich56480
투석 백나노 입자 정제용Spectrum132592T
세포 배양용PBSHycloneSH30028.01
10mL 원심분리 튜브, 폴리프로필렌나노 입자 합성용AladdinS-025
15mL 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌Corning430791다양한 응용 분야용
0.22 &무; m 멸균 주사기 필터나노 입자 정제 용MilliporeSLGV033RB
1ml 주사기, 폴리 프로필렌BD328421나노 입자 합성용
Malvern ZetasizerMalvernNano ZS입자 크기 분석기
포스 포 텅스텐 산TEM
그리드EMCNBZ10024aTEM
TEM용 UV-VIS 분광계LeageneDZ0035
투과
전자 현미경		JEOLJEM-100CXII입자 크기 분석기
BCA 시약 AThermo Fisher Scientific23228BCA 분석용
BCA 시약 BThermo Fisher Scientific23224BCA 분석용
96-Well PlateCorning3599 어세이
플레이트 리더Thermo Fisher ScientificMultiskan ™ 위한 BCA 분석
12웰 플레이트배양을 위한Corning3513
JEG3 세포TCHu195인간 태반
DMEM/F12HycloneSH30272.01페놀 레드-프리
소 태아 혈청(FBS)GIBCO10100세포 배양을 위한
페니실린/스트렙토마이신GIBCO세포 배양을 위한15070063
세포 흡수형광 현미경OLYMPUSCKK53
파라포름알데히드상하이 링펑1372021세포 흡수를 위한
DAPISangon BiotechA606584세포 흡수를 위한
장착 매체 생명P36961셀룰라 흡수를 위한
화학 JK UFC801024 나용 2, , , , , 용 세포 배양을 를 위한 GO 세포 를 위한

참고문헌

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