혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
면역 세포의 본질적인 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)의 병 인에 대 한 중요 하다. Integrin 종속 셀 접착 addressins이 과정에서 중요 한 단계 이며 접착을 방해 하는 치료 전략 성공적으로 설립 되었습니다. 궤 양성 대 장 염 (UC) 더 화합물 들을 따라 및 안티 α4β7 integrin 항 체, vedolizumab, Crohn의 질병 (CD)의 임상 치료를 위해 사용 됩니다.
접착 절차의 세부 사항 및 작업 메커니즘 안티 integrin 항 체의이 분야에서 기능 연구에 대 한 제한 된 사용 가능한 기술 때문에 많은 관계에서 여전히 명확 하지 않다.
여기, 우리는 IBD의 맥락에서 흐름 조건 하에서 인간의 세포 접착의 기능 분석 및 안티 integrin 치료의 영향에 대 한 동적 접착 분석 결과 제시. 그것은 실시간 현미경 분석 addressin 코팅 ultrathin 유리 모 세관을 통해 기본 인간 세포의 재 관류를 기반으로 합니다. 분석 결과 다양 한 수정 및 수정에 대 한 기회를 제공 하 고 기계적 발견 및 변환 응용 프로그램에 대 한 잠재력을 보유 하 고.
서론
셀 모션 단단히 규제 프로세스 개발 및 멀티 셀룰러 생물의 기능에 대 한 필수 이지만, 또한 다양 한 질병1의 병 인에 관련 된. 최근, 주변 조직에 혈 류에서 면역 세포의 유도 과정 주목 하고있다 증가, 때문에 그것은 보충 및 면역학 중재 질병2에에서 염증된 조직에 병원 성 세포의 확장에 기여 ,3. 특히, 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)에 변환 관련성을가지고 표시 되었습니다. 창 추적 방해 치료 안티-α4β7 integrin 항 체 vedolizumab 큰 임상 시험4,5 에 효능을 보이고 있다 고 실제 임상 실습6,7 에 성공적으로 사용 되었습니다. , 8. 추가 화합물9,10에 따라 가능성이 있습니다. 마찬가지로, 치료 안티-α4 integrin 항 체, nat....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
다음 섹션에서 설명 하는 연구 윤리 위원회 프리드리히 알렉산더 대학교 에를랑겐 뉘른베르크의의 승인에 따라 수행 되었습니다.
1입니다. 모세 혈관의 준비
- 작은 위 한쪽에 튜브를 스트레칭 하 고 신중 하 게 (약 0.5 c m) 모 세관 튜브에 삽입 하 여 사각형 모세 혈관 고무 튜브를 연결 합니다. 모 세관 튜브 플라스틱 파라핀 영화 사이 연결을 봉인.
- Addressin (재조합 Fc 키메라, addressin, 예를 들면 MAdCAM-1 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES) 코팅 버퍼에서 5 µ g/mL) 또는 p20 피 펫을 사용 하 여 적절 한 isotype 제어 솔루션의 20 µ L와 모 세관 코트 (유체 적 실 것 이다 자체는 모 세관으로). 다음, 플라스틱 파라핀 영화 튜브에 연결 되지 않은 측면을 밀봉 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어 코팅 버퍼 또는 부정적인 제어로 적절 한 isotype 제어만 채워진 모 세관을 사용 합니다.
- 모 세관의 끝에서 플라스틱 파라핀 필름을 제거, 코팅의 차단 솔루션 (5 %BSA 1 x PBS) 37 ° c.에 20 µ L로 적어도 1 시간에 대 한 종이 타월 및 블록 모세 혈관에 모 세관에서 액체 담....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
제시 하는 방법이이 원고에 최대한을 기능적으로 내 피 벽에 인간의 세포 접착의 과정 vivo에서 시뮬레이션 하는 것을 목표로 평가 세포 접착 및 간섭 항 체의 역할. 따라서, ultrathin 모 세관 addressins 코팅 되며 관심 관류 펌프를 사용 하 여 붙일 레이블된 인간의 세포와 끼얹는다. 라이브 셀 이미징는 addressins에 인간 세포의 접착을 사용 하 여 실시간으로 (그림 1)에서 볼 수 있습니다.
이 방법은 특히 IBD 치료 요법 안티-접착의 메커니즘을 명료 하 게 적당 하다. 그림 2A같이 ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 및 인간 PBMCs와 Isotype Fc 키메라로 코팅 하는 모세 혈관의 관류 3 add.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
위의 프로토콜 인간의 면역 세포를 내 피 ligands의 동적 접착을 공부 하는 유용한 기법을 설명 합니다. 통해 코팅된 ligands, 끼얹는다 세포 유형 또는 하위 집합, 추가 자극이 나 다른 중화 항 체를 가진 외피의 변화, 그것은 거의 무제한 잠재적인 응용 프로그램. 따라서, 이러한 동적 접착 분석 변환 쿼리를 개발 하 고 접착 과정을 방해 하는 약물으로 임상 치료를 최적화 하는 데 도움이 될 뿐 아니라 기초 연구의 두 기본적인 질문에 대답을 유용할 수 있습니다.
임상 방지 접착 치료의 효과 조사 분석 결과의 유틸리티 최근 증명 되었습니다. 또한, 다른 세포 인구 종류와 양의 integrins23분석 결과 타당성을 지 원하는 각 addressins에 동적 접착의 일관 된 수준을 표시 합니다.
온, 프로토콜의 완성 작품의 약 6 시간을 필요로 하 고 중간 기술 도전을 선물 한다. 모.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
M.F.N.는 펜탁스, 줄리아니, MSD, Abbvie, 얀 센, 다케다와 Boehringer 고문 역임 했다. M.F.N. 및 S.Z. 다케다와 로슈 연구 지원을 받았다.
감사의 글
CN, 아이오와, MFN, SZ의 연구 지원 협 센터 임상 연구 (IZKF)와 대학 에를랑겐 뉘른베르크, 독일 크 론 다른 Kröner-Fresenius-재단, 프리츠-벤더-재단의 앨런 프로그램 및 Colitis 재단 (DCCV), 임상 연구 그룹 CEDER의 독일 연구 위원회 (DFG), Microbiota, 신흥 분야 이니셔티브는 DFG 공동 연구 센터 643, 796와 1181에 DFG 주제 프로그램.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 48웰 플레이트 | Sarstedt | 833,923 | |
| 접착 완충액: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| 차단 용액: ddH2O + 5 % BSA | |||
| 소 혈청 알부민(BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm | 길이 CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE 세포 증식 키트 | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| 원심분리기 (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| 코팅 완충액: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| 컨포칼 현미경 (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, 인간 | 면역도구 | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL 모노벳 | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc 키메라 이소타입 컨트롤 | R& D Systems | 110-HG | |
| 유량 연동 펌프(LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| 인간 IgG 이소타입 제어 | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| 세포간 접착 분자 1(ICAM-1) Fc 키메라 | R& D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| 마우스 IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| 점막 혈관 주소 세포 접착 분자 1 (MAdCAM-1) Fc 키메라 | R& D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer 계수 챔버 | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| 인산 완충 식염수 (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg 및 Ca |
| 플라스틱 파라핀 필름: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| 정제된 항인간 CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| 고무 튜브: SC0059T 3-Stop LMT-55 튜빙, 1.02mm ID, 406.4mm 길이 | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc 키메라 | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
참고문헌
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essen....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
