선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

요약

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

초록

면역 세포의 본질적인 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)의 병 인에 대 한 중요 하다. Integrin 종속 셀 접착 addressins이 과정에서 중요 한 단계 이며 접착을 방해 하는 치료 전략 성공적으로 설립 되었습니다. 궤 양성 대 장 염 (UC) 더 화합물 들을 따라 및 안티 α4β7 integrin 항 체, vedolizumab, Crohn의 질병 (CD)의 임상 치료를 위해 사용 됩니다.

접착 절차의 세부 사항 및 작업 메커니즘 안티 integrin 항 체의이 분야에서 기능 연구에 대 한 제한 된 사용 가능한 기술 때문에 많은 관계에서 여전히 명확 하지 않다.

여기, 우리는 IBD의 맥락에서 흐름 조건 하에서 인간의 세포 접착의 기능 분석 및 안티 integrin 치료의 영향에 대 한 동적 접착 분석 결과 제시. 그것은 실시간 현미경 분석 addressin 코팅 ultrathin 유리 모 세관을 통해 기본 인간 세포의 재 관류를 기반으로 합니다. 분석 결과 다양 한 수정 및 수정에 대 한 기회를 제공 하 고 기계적 발견 및 변환 응용 프로그램에 대 한 잠재력을 보유 하 고.

서론

셀 모션 단단히 규제 프로세스 개발 및 멀티 셀룰러 생물의 기능에 대 한 필수 이지만, 또한 다양 한 질병¹의 병 인에 관련 된. 최근, 주변 조직에 혈 류에서 면역 세포의 유도 과정 주목 하고있다 증가, 때문에 그것은 보충 및 면역학 중재 질병^{2에에서 염증된 조직에 병원 성 세포의 확장에 기여 ,3}. 특히, 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)에 변환 관련성을가지고 표시 되었습니다. 창 추적 방해 치료 안티-α4β7 integrin 항 체 vedolizumab 큰 임상 시험^4,5 에 효능을 보이고 있다 고 실제 임상 실습^6,7 에 성공적으로 사용 되었습니다. ^{, 8}. 추가 화합물^9,10에 따라 가능성이 있습니다. 마찬가지로, 치료 안티-α4 integrin 항 체, natalizumab, 다 발성 경화 증 (MS)¹¹의 치료를 위해 사용 됩니다.

그러나, 우리의 기능 유도 과정의 일반적 이해와 같은 치료 항 체의 행동의 메커니즘에 특히 아직도 제한 된다. 잘 설립 추적 셀 밧줄 등 압 트랜스 내 피 마이그레이션^12,13다음 회사 마비로 이어지는 후속 세포 접착와 여러 단계의 구성 됩니다. 위에서 언급 한 항 체에 혈관 벽의 endothelium에 addressins와의 상호 작용을 방지 하는 세포 표면 integrins 무력화. 이 회사 세포 접착^14,15방해 하 생각 된다. 그러나, 우리는 고유 셀 하위 집합의 셀 추적에 대 한 특정 integrins의 차동 관련성 이해만 시작 합니다. 또한, 다른에 안티 integrin 항 체의 효과 셀 하위 집합 그리고 복용량 응답 협회는 크게 알려진 많은 IBD에 직감 추적 및 방지 접착 치료의 분야에서 관련 질문을 선도.

따라서, 이러한 질문을 해결 하기 위해 편리한 도구 필사적으로 필요 합니다. Integrin addressin 상호 작용에 안티 integrin 항 체의 효과 주로 바인딩 효능/바인딩 금지 cytometry 또는 정적 접착 분석 실험^{16,17 를 평가 하 여 평가 18,,1920}, 명백한 단순화와 생리 적 상황에서 편차에 따라서. 우리는 최근에 integrin 종속 접착 addressins 인간 세포의 전단 응력²안티 integrin 항 체의 효과 공부 하 고 동적 접착 분석 결과 설립. 기술의 원리 이전 마우스 셀^21,22로 입증 되었습니다. 여기, 그것은 적응 되 고 위에서 언급 한 변환 질문을 해결 하기 위해 개발 되었다, 오프닝 소설 길 더 나은 치료와 안티 integrin 항 체에서 생체 내에서의 메커니즘을 이해.

프로토콜

다음 섹션에서 설명 하는 연구 윤리 위원회 프리드리히 알렉산더 대학교 에를랑겐 뉘른베르크의의 승인에 따라 수행 되었습니다.

1입니다. 모세 혈관의 준비

1. 작은 위 한쪽에 튜브를 스트레칭 하 고 신중 하 게 (약 0.5 c m) 모 세관 튜브에 삽입 하 여 사각형 모세 혈관 고무 튜브를 연결 합니다. 모 세관 튜브 플라스틱 파라핀 영화 사이 연결을 봉인.
2. Addressin (재조합 Fc 키메라, addressin, 예를 들면 MAdCAM-1 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES) 코팅 버퍼에서 5 µ g/mL) 또는 p20 피 펫을 사용 하 여 적절 한 isotype 제어 솔루션의 20 µ L와 모 세관 코트 (유체 적 실 것 이다 자체는 모 세관으로). 다음, 플라스틱 파라핀 영화 튜브에 연결 되지 않은 측면을 밀봉 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어 코팅 버퍼 또는 부정적인 제어로 적절 한 isotype 제어만 채워진 모 세관을 사용 합니다.
3. 모 세관의 끝에서 플라스틱 파라핀 필름을 제거, 코팅의 차단 솔루션 (5 %BSA 1 x PBS) 37 ° c.에 20 µ L로 적어도 1 시간에 대 한 종이 타월 및 블록 모세 혈관에 모 세관에서 액체 담가 놓아 빈 플라스틱 파라핀 영화와 모 세관의 열린 측면을 봉인. 현미경을 진행 하기 전에 차단 솔루션을 제거 하지 마십시오.

2. 세포 격리, 치료 및 현미경 검사 법에 대 한 준비

참고:이 단계 수행할 수 있습니다는 인큐베이션 기간 동안 모 세관 준비에 필요한 기간.

1. 지역 규정에 따라 정보 서 면된 동의 후 무 균 혈액 컬렉션 (예: IBD 환자 및 건강 한 컨트롤) 명 자원 봉사 cubital 정 맥에서 설정 anticoagulated 사람의 혈액의 18 mL를 수집 윤리 위원회입니다.
   참고:이 단계만 국가 및 지역 규정에 따라 훈련 하 고 경험이 풍부한 의료진에 의해 수행 되어야 한다.
2. 50 mL 튜브에 피를 1 x PBS와 35 mL의 볼륨을 희석. 다음 언더레이 밀도 그라데이션 매체의 10 mL와 함께 혈액 PBS 혼합물까지.
3. 800 x g 15 분 및 세포를 분리 하는 브레이크 없이 24 ° C에 대 한 밀도 그라데이션 원심 분리를 수행 합니다.
4. 화이트 셀 레이어 오른쪽 상단에 밀도 그라데이션 중간 레이어 (분명 중간 계층)의 발음에 의해 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs)를 수집 합니다. 신선한 50 mL 튜브에 PBMCs 전송, 채우기 최대 50 mL 1 x PBS 그리고 g 와 10 ° C x 300에서 10 분 원심 분리기
5. 삭제는 상쾌한, 1 x PBS의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend 및 이후 셀 숫자, 예를 들어, Neubauer 셀 계산 챔버를 사용 하 여.
6. 선택 사항: 공부 granulocytes의 접착은 다음 절차를 수행 합니다. 그렇지 않으면, 단계 2.7 또는 2.8 진행.
   1. Granulocyte 레이어 (맨 아래 레이어 밀도 그라데이션 원심 분리는 적혈구 또한 포함 된 후)를 수집 합니다. 1 x PBS의 40 mL에 셀 resuspend 8 mL 6%의 추가 1 x PBS에서 Dextran 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 셀 앙금.
      참고:는 적혈구 됩니다 싱크대는 튜브의 하단에는 granulocytes에에서 남아 있을 것입니다 하는 동안.
   2. 30 분 후에 상쾌한 수집, 전송 신선한 50 mL 튜브 및 원심 분리기 g 와 4 ° C x 300에서 6 분으로 삭제는 상쾌한 고 0.2%의 5 mL을 추가 하 여 나머지 적혈구를 lyse NaCl ddH₂오 품 1 분 동안에.
   3. 1.4%의 5 mL을 추가 ddH₂O NaCl 및 다른 분 품 어. 1 x PBS와 300 x g 6 분 및 4 ° c.에 대 한 원심 분리기의 20 mL를 추가 하 여 침투성 세포를 중지
   4. 1 x PBS의 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 다음, Neubauer 셀 계산 챔버를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
7. 옵션: 공부 하 고 PBMC 하위 집합의 접착, 정화 다른 세포 유형 또는 하위 집합 (예를 들어, CD4⁺ 와 CD8⁺ T 세포 또는 CD19⁺ B 세포) 제조 업체의 프로토콜 또는 형광 활성화 하 여 microbeads를 사용 하 여 셀 정렬 (FACS). 그렇지 않으면, 단계 2.8 진행.
8. G 와 10 ° C x 300에서 10 분 동안 세포 현 탁 액을 원심 삭제는 상쾌한 고 셀 제조업체의 지침에 따라 (예를 들어, CFSE) 염료를 추적 셀 얼룩.
9. 그 후, 셀 300 x g에서 10 분 원심 하 고 상쾌한 삭제. 1 x PBS에 resuspend, 휴대폰 번호와 다시 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를 결정 합니다.
10. 삭제는 상쾌한 고 접착 버퍼 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 m m MgCl₂ + 1 m m CaCl₂)의 적절 한 금액에 얼룩진된 셀 펠 릿 10⁶ 셀/mL x 1.5의 정지를 resuspend. 그런 다음, 100 m m 1 m m의 최종 농도를 MnCl₂ 의 적절 한 금액을 추가 합니다.
    참고:이 세포는 현미경 검사 법에 대 한 준비.
11. 선택 사항: cytokines, 중화 항 체 또는 다른 화합물을 세포 치료. 그렇지 않으면 3 단계로 진행 합니다.
    1. 2.10 단계를 생략 하 고 resuspend 단계 2.9 RPMI 매체에서에서 스테인드 셀 펠 릿 (10 %FBS 1% 페니실린/스) 1.5 x 10⁶ 셀/mL의 농도를.
    2. 분석 조건으로 48-잘 접시의 많은 우물으로이 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 플라스틱. 항상 부정적인 컨트롤로 uncoated 모 세관을 통해 끼얹는다 치료 셀 하나 잘와 긍정적인 컨트롤로 addressin 코팅 모 세관을 통해 끼얹는다 치료 셀 하나 잘 준비 합니다.
    3. 안티 integrin 항 체와 치료를 위해 세포 현 탁 액에 항 체 (예, 10 µ g/mL vedolizumab)의 적절 한 금액을 추가 합니다. 1 h 37 ° c.에 품 어 Cytokines와 치료를 위해 세포 현 탁 액을 재조합 사이토카인 (예를 들어, 10 ng/mL CXCL10)의 적절 한 금액을 추가 합니다. 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
    4. 부 화, 이후 resuspending 여러 번 p1000 피 펫을 사용 하 여 셀에 의해 세포를 수확. 2 mL 튜브에 세포를 전송, 1 x PBS의 1 mL와 함께 다시 잘 헹 구 고 2 mL 튜브에 추가. 휴대폰 번호를 확인 합니다.
       참고: 부착 세포 인구 (예를 들어, monocytes)의 외피 추가 조치가 필요할 수 있습니다 (예., 트립 신으로 처리) 접시에서 세포를 분리.
12. 10 ° c.에 300 x g 에서 10 분 원심 분리기 셀 삭제는 상쾌한 고 1.5 x 10⁶ 셀/mL의 정지를 접착 버퍼의 적절 한 금액에 셀 펠 릿 resuspend. 그런 다음, 100 m m 1 m m의 최종 농도를 MnCl₂ 의 적절 한 금액을 추가 합니다. 발산을 pretreating 때 셀 서 스 펜 션에 MnCl₂ 을 추가 하지 마십시오. 이 세포는 현미경 검사 법에 대 한 준비가 지금.
    참고: 최소 볼륨 분석 결과 대 한 사용 하는 펌프와 튜브 사용에 따라 달라 집니다. 연동 펌프와 재료의 테이블에에서 지정 된 튜브를 사용 하 여이 연구에서 400 µ L의 최소 볼륨 필요 했다. 경우 원하는 (셀 유형 및 수익률)에 따라 적용 가능한, 시간의 짧은 기간에 높은 접착 력을 측정 하 현 탁 액에서 세포 농도 늘릴 수 있습니다.
13. 잠재적인 수정: 경쟁 동적 접착 시험
    1. 서로 다른 (예를 들어, 규제 및 효과 기 T 세포 단계 2.7 당 제조업체의 지침에 따라 자석 구슬 격리를 통해 격리) 비교 하기 다른 세포 인구와 위에서 언급 한 단계를 수행 합니다.
    2. 단계 동안 현미경 세포 인구를 차별화 수 2.8-2.9에서에서 설명한 대로 다른 염료 (예를 들어, CFSE와 FarRed)와 각 인구를 얼룩.
    3. 삭제는 상쾌한 고 접착 버퍼 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 m m MgCl₂ + 1 m m CaCl₂)의 적절 한 금액에 얼룩진된 셀 알 약 1.5 x 10⁶ 셀/mL의 정지를 resuspend.
    4. 동등한 양의 세포 정지 (규정 하는 T 세포의예를 들어, 500 µ L) 및 효과 기 T 세포의 500 µ L를 혼합 혼합 셀 1.5 x 10⁶ 셀/mL의 농도를 최종. 그런 다음, 100 m m 1 m m의 최종 농도를 MnCl₂ 의 적절 한 금액을 추가 합니다. 그러한 정지 이후 동일한 모 세관을 통해 다른 세포 인구 perfusing에 의해 접착 과정의 경쟁력 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

3. 라이브 셀 이미징 동적 접착의

1. 현미경 하 고 적절 한 필터 선택 또는 자극 dye(s) (예: 488 nm 레이저 CFSE), 적절 한 목표 (예를 들어, 40 X)는 인수 모드 활성화 시간 경과 영상 추적 셀 레이저.
2. 모 세관의 끝에서 플라스틱 파라핀 필름을 제거 하 고 모 세관 작은 위 한쪽에 튜브를 스트레칭 조심 스럽게 모 세관 (약 0.5 c m)을 삽입 하 여 (약 5cm 길이의) 배관의 짧은 조각으로 연결 에 관. 모 세관 튜브 플라스틱 파라핀 영화 사이 연결을 봉인.
3. 고정 트레이 (예를 들어, 는 사각형 컷-아웃으로 모 세관의 길이 보다 약간 짧은 6 잘 플레이트에서 뚜껑)에 모 세관을 탑재 하 고 초점 및 준비에는 모 세관에는 현미경의 트레이 홀더 고정된 모 세관을 배치 입니다.
4. 고무 튜브 연동 펌프의 해당 노치에 삽입 하 고 배치에 따라 샘플 튜브 세포 현 탁 액을 포함 하는 모 세관에 연결 되지 않은 끝. 흐름을 통해 수집 하는 15 mL 튜브에 모 세관의 반대편에 짧은 튜브를 삽입 합니다.
5. 튜빙 채우기 하자 셀 서 스 펜 션은 거의 모 세관에 도달할 때까지 분당 500 µ L의 유량과. 100 µ L/min의 유량과 모 세관 채우기를 시키십시오.
   참고: 모 세관 내부 세포 현 탁 액의 일반 분배를 보장 한 빠른 오르고 모 세관의.
6. 모 세관 세포 현 탁 액으로 채워질 때 10 µ L/분의 유량을 조정 합니다.
   참고: 이러한 흐름 속도 달라질 수 있습니다, 다른 크기 또는 다른 연동 펌프의 모 세관을 사용 하는 경우. 이 연구에서 10 µ L/분의 유량은 펌프와 모세 혈관 혈 vivo에서 모방 하 최적화 되었다.
7. 모든 2는 addressin 코팅 벽 안쪽을 따라 모 세관을 통해 천천히 이동 하는 셀의 시간 경과 이미지 3 분의 총에 대 한 s.
   참고: 간격 및 총 시간 세포 유형 및 질문 해결에 따라 달라질 수 있습니다.
8. 모 세관을 삭제 하기 전에 화면을 전체 모 세관 비디오에 표시 된 섹션 담당자는 되도록 현미경의 눈 조각을 통해. 필요한 경우 두 번째 녹음을 확인 합니다.
9. 펌프에서 튜브 무료 고 나머지 액 2 mL 관으로 다시 실행 다음 고정 용지함에서 모 세관와 튜브를 분리 하 고 모 세관을 계속 하자.

4. 평가 셀 계산

1. 적절 한 소프트웨어와 함께 시간 경과 시퀀스를 열고 처음 세 개의 이미지 ("시작")와 마지막 3 이미지 ("끝") Tiff 파일로 내보냅니다.
2. 32 비트 오픈 ImageJ, 3 "시작" 이미지 변환 ('이미지 | 유형 | 32 비트 ') 및 사진을 병합 (' 이미지 | 컬러 | 병합 채널; 빨강, 녹색 및 파랑 색상을 할당할 다른 그림). 합성 이미지를 RGB로 변환 (' 이미지 | Type-RGB') 및 Tiff 파일로 저장. "끝" 이미지를 반복 합니다.
   참고: 셀에 서로 다른 색상으로 얼룩진 경쟁 동적 접착 분석 실험, 먼저 다른 세포 인구의 접착을 별도로 분석 하 이미지의 채널 분할.
3. "시작" 및 "끝" 복합에 화이트 셀의 개수와 화이트 셀 "끝"에서 "시작"에 백혈구의 수를 뺍니다.
   참고: 새로 준수의 수는 3 분 시간 간격에서 세포는 차이 나타냅니다. 합성 이미지에서 셀 이동 때문에 그들은 이전 및 다음 프레임에서 다른 자리에 지역화 각각 프레임에 할당 된 특정 색상에 표시 됩니다. 셀에 대 한 부착, 흰색 같은 자리 오버랩에 빨강, 녹색 및 파랑 신호입니다.
4. 더 나은 결과 시각화 하려면 시간 경과 시퀀스에서 비디오를 예를 들어, ImageJ를 사용 하 여 컴파일하십시오.

결과

제시 하는 방법이이 원고에 최대한을 기능적으로 내 피 벽에 인간의 세포 접착의 과정 vivo에서 시뮬레이션 하는 것을 목표로 평가 세포 접착 및 간섭 항 체의 역할. 따라서, ultrathin 모 세관 addressins 코팅 되며 관심 관류 펌프를 사용 하 여 붙일 레이블된 인간의 세포와 끼얹는다. 라이브 셀 이미징는 addressins에 인간 세포의 접착을 사용 하 여 실시간으로 (그림 1)에서 볼 수 있습니다.

이 방법은 특히 IBD 치료 요법 안티-접착의 메커니즘을 명료 하 게 적당 하다. 그림 2A같이 ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 및 인간 PBMCs와 Isotype Fc 키메라로 코팅 하는 모세 혈관의 관류 3 add...

토론

위의 프로토콜 인간의 면역 세포를 내 피 ligands의 동적 접착을 공부 하는 유용한 기법을 설명 합니다. 통해 코팅된 ligands, 끼얹는다 세포 유형 또는 하위 집합, 추가 자극이 나 다른 중화 항 체를 가진 외피의 변화, 그것은 거의 무제한 잠재적인 응용 프로그램. 따라서, 이러한 동적 접착 분석 변환 쿼리를 개발 하 고 접착 과정을 방해 하는 약물으로 임상 치료를 최적화 하는 데 도움이 될 뿐 아니라 기초 연구의 두 기본적인 질문에 대답을 유용할 수 있습니다.

임상 방지 접착 치료의 효과 조사 분석 결과의 유틸리티 최근 증명 되었습니다. 또한, 다른 세포 인구 종류와 양의 integrins²³분석 결과 타당성을 지 원하는 각 addressins에 동적 접착의 일관 된 수준을 표시 합니다.

온, 프로토콜의 완성 작품의 약 6 시간을 필요로 하 고 중간 기술 도전을 선물 한다. 모...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
48웰 플레이트	Sarstedt	833,923
접착 완충액: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2
차단 용액: ddH2O + 5 % BSA
소 혈청 알부민(BSA)	Applichem	A1391,0100
CaCl2	Merck	2382
Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm	길이 CM Scientific	3520-050
CCL-2, human	Immunotools	11343384
CD4-Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101
CellTrace™ CFSE 세포 증식 키트	ThermoFischer Scientific	C34554
원심분리기 (Rotixa 50 RS)	Hettrich
코팅 완충액: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES
컨포칼 현미경 (TCS SP8)	Leica
CXCL-10, 인간	면역도구	11343884
Dextran 500	Roth	9219.3
EDTA KE/9 mL 모노벳	Sarstedt
Falcons (50 mL)	Sarstedt	62,547,004
Fc 키메라 이소타입 컨트롤	R& D Systems	110-HG
유량 연동 펌프(LabV1)	Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPES	VWR	J848-100ML
인간 IgG 이소타입 제어	ThermoFischer Scientific	31154
세포간 접착 분자 1(ICAM-1) Fc 키메라	R& D Systems	720-IC-050
LS-Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MgCl2	Roth
MnCl2	Roth
마우스 IgG isotype control	Miltenyi Biotec	130-106-545
점막 혈관 주소 세포 접착 분자 1 (MAdCAM-1) Fc 키메라	R& D Systems	6056-MC
NaCl	Roth	3957.3
Natalizumab	Biogen
Neubauer 계수 챔버	Roth	T729.1
Pancoll, human	PAN Biotech	P04-601000
인산 완충 식염수 (PBS)	Biochrom	L 182-10	w/o Mg 및 Ca
플라스틱 파라핀 필름: Parafilm (PM-996)	VWR	52858-000
정제된 항인간 CD18	Biolegend	302102
RPMI Medium 1640	Gibco Life Technologies	61870-010
고무 튜브: SC0059T 3-Stop LMT-55 튜빙, 1.02mm ID, 406.4mm 길이	Ismatec	SC0059
Serological Pipetts	Sarstedt	861,254,025
Trypan blue	Roth	CN76.1
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc 키메라	Biolegend	553706
Vedolizumab (Entyvio)	Takeda