선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

요약

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

초록

면역 세포의 본질적인 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)의 병 인에 대 한 중요 하다. Integrin 종속 셀 접착 addressins이 과정에서 중요 한 단계 이며 접착을 방해 하는 치료 전략 성공적으로 설립 되었습니다. 궤 양성 대 장 염 (UC) 더 화합물 들을 따라 및 안티 α4β7 integrin 항 체, vedolizumab, Crohn의 질병 (CD)의 임상 치료를 위해 사용 됩니다.

접착 절차의 세부 사항 및 작업 메커니즘 안티 integrin 항 체의이 분야에서 기능 연구에 대 한 제한 된 사용 가능한 기술 때문에 많은 관계에서 여전히 명확 하지 않다.

여기, 우리는 IBD의 맥락에서 흐름 조건 하에서 인간의 세포 접착의 기능 분석 및 안티 integrin 치료의 영향에 대 한 동적 접착 분석 결과 제시. 그것은 실시간 현미경 분석 addressin 코팅 ultrathin 유리 모 세관을 통해 기본 인간 세포의 재 관류를 기반으로 합니다. 분석 결과 다양 한 수정 및 수정에 대 한 기회를 제공 하 고 기계적 발견 및 변환 응용 프로그램에 대 한 잠재력을 보유 하 고.

서론

셀 모션 단단히 규제 프로세스 개발 및 멀티 셀룰러 생물의 기능에 대 한 필수 이지만, 또한 다양 한 질병¹의 병 인에 관련 된. 최근, 주변 조직에 혈 류에서 면역 세포의 유도 과정 주목 하고있다 증가, 때문에 그것은 보충 및 면역학 중재 질병^{2에에서 염증된 조직에 병원 성 세포의 확장에 기여 ,3}. 특히, 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)에 변환 관련성을가지고 표시 되었습니다. 창 추적 방해 치료 안티-α4β7 integrin 항 체 vedolizumab 큰 임상 시험^4,5 에 효능을 보이고 있다 고 실제 임상 실습^6,7 에 성공적으로 사용 되었습니다. ^{, 8}. 추가 화합물^9,10에 따라 가능성이 있습니다. 마찬가지로, 치료 안티-α4 integrin 항 체, nat....

프로토콜

다음 섹션에서 설명 하는 연구 윤리 위원회 프리드리히 알렉산더 대학교 에를랑겐 뉘른베르크의의 승인에 따라 수행 되었습니다.

1입니다. 모세 혈관의 준비

1. 작은 위 한쪽에 튜브를 스트레칭 하 고 신중 하 게 (약 0.5 c m) 모 세관 튜브에 삽입 하 여 사각형 모세 혈관 고무 튜브를 연결 합니다. 모 세관 튜브 플라스틱 파라핀 영화 사이 연결을 봉인.
2. Addressin (재조합 Fc 키메라, addressin, 예를 들면 MAdCAM-1 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES) 코팅 버퍼에서 5 µ g/mL) 또는 p20 피 펫을 사용 하 여 적절 한 isotype 제어 솔루션의 20 µ L와 모 세관 코트 (유체 적 실 것 이다 자체는 모 세관으로). 다음, 플라스틱 파라핀 영화 튜브에 연결 되지 않은 측면을 밀봉 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어 코팅 버퍼 또는 부정적인 제어로 적절 한 isotype 제어만 채워진 모 세관을 사용 합니다.
3. 모 세관의 끝에서 플라스틱 파라핀 필름을 제거, 코팅의 차단 솔루션 (5 %BSA 1 x PBS) 37 ° c.에 20 µ L로 적어도 1 시간에 대 한 종이 타월 및 블록 모세 혈관에 모 세관에서 액체 담....

결과

제시 하는 방법이이 원고에 최대한을 기능적으로 내 피 벽에 인간의 세포 접착의 과정 vivo에서 시뮬레이션 하는 것을 목표로 평가 세포 접착 및 간섭 항 체의 역할. 따라서, ultrathin 모 세관 addressins 코팅 되며 관심 관류 펌프를 사용 하 여 붙일 레이블된 인간의 세포와 끼얹는다. 라이브 셀 이미징는 addressins에 인간 세포의 접착을 사용 하 여 실시간으로 (그림 1)에서 볼 수 있습니다.

이 방법은 특히 IBD 치료 요법 안티-접착의 메커니즘을 명료 하 게 적당 하다. 그림 2A같이 ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 및 인간 PBMCs와 Isotype Fc 키메라로 코팅 하는 모세 혈관의 관류 3 add.......

토론

위의 프로토콜 인간의 면역 세포를 내 피 ligands의 동적 접착을 공부 하는 유용한 기법을 설명 합니다. 통해 코팅된 ligands, 끼얹는다 세포 유형 또는 하위 집합, 추가 자극이 나 다른 중화 항 체를 가진 외피의 변화, 그것은 거의 무제한 잠재적인 응용 프로그램. 따라서, 이러한 동적 접착 분석 변환 쿼리를 개발 하 고 접착 과정을 방해 하는 약물으로 임상 치료를 최적화 하는 데 도움이 될 뿐 아니라 기초 연구의 두 기본적인 질문에 대답을 유용할 수 있습니다.

임상 방지 접착 치료의 효과 조사 분석 결과의 유틸리티 최근 증명 되었습니다. 또한, 다른 세포 인구 종류와 양의 integrins²³분석 결과 타당성을 지 원하는 각 addressins에 동적 접착의 일관 된 수준을 표시 합니다.

온, 프로토콜의 완성 작품의 약 6 시간을 필요로 하 고 중간 기술 도전을 선물 한다. 모.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
48웰 플레이트	Sarstedt	833,923
접착 완충액: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2
차단 용액: ddH2O + 5 % BSA
소 혈청 알부민(BSA)	Applichem	A1391,0100
CaCl2	Merck	2382
Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm	길이 CM Scientific	3520-050
CCL-2, human	Immunotools	11343384
CD4-Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101
CellTrace™ CFSE 세포 증식 키트	ThermoFischer Scientific	C34554
원심분리기 (Rotixa 50 RS)	Hettrich
코팅 완충액: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES
컨포칼 현미경 (TCS SP8)	Leica
CXCL-10, 인간	면역도구	11343884
Dextran 500	Roth	9219.3
EDTA KE/9 mL 모노벳	Sarstedt
Falcons (50 mL)	Sarstedt	62,547,004
Fc 키메라 이소타입 컨트롤	R& D Systems	110-HG
유량 연동 펌프(LabV1)	Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPES	VWR	J848-100ML
인간 IgG 이소타입 제어	ThermoFischer Scientific	31154
세포간 접착 분자 1(ICAM-1) Fc 키메라	R& D Systems	720-IC-050
LS-Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MgCl2	Roth
MnCl2	Roth
마우스 IgG isotype control	Miltenyi Biotec	130-106-545
점막 혈관 주소 세포 접착 분자 1 (MAdCAM-1) Fc 키메라	R& D Systems	6056-MC
NaCl	Roth	3957.3
Natalizumab	Biogen
Neubauer 계수 챔버	Roth	T729.1
Pancoll, human	PAN Biotech	P04-601000
인산 완충 식염수 (PBS)	Biochrom	L 182-10	w/o Mg 및 Ca
플라스틱 파라핀 필름: Parafilm (PM-996)	VWR	52858-000
정제된 항인간 CD18	Biolegend	302102
RPMI Medium 1640	Gibco Life Technologies	61870-010
고무 튜브: SC0059T 3-Stop LMT-55 튜빙, 1.02mm ID, 406.4mm 길이	Ismatec	SC0059
Serological Pipetts	Sarstedt	861,254,025
Trypan blue	Roth	CN76.1
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc 키메라	Biolegend	553706
Vedolizumab (Entyvio)	Takeda