진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

Post-transcriptional 유전자 규칙 구동 RNA 의무적인 단백질 (RBPs), 비 코딩 RNAs (ncRNAs) 및 mRNAs 사이 상호 작용을 통해이 직접 처리, 현지화, 번역 및 셀¹ 에 내에서 모든 대 본의 ^{, 2}. RBPs 고 ribonucleoprotein 단지/입자 (RNPs)로 알려져 설정 특정 mRNAs와 상호 작용 하는 ncRNA mRNAs와 유전자 식 컨트롤의 운명을 이해 하는 열쇠 이므로. RNP 단지^3,4의 생 화 확 적인 특성에 대 한 보완 방법을 착수: "RNA 중심" 접근을 포함 한다 "단백질 중심" 접근은 특정 RBPs의 정화를 바탕으로, 하는 동안은 모집단 또는 개별 RNAs 및 상호 작용 단백질 또는 RNAs의 후속 분석의 격리. 최근, polyadenylated와 상호 작용 하는 RBP 레 퍼 토리의 식별을 위한 RNA 중심 접근 (poly(A)) RNAs⁵ 인기 끌고있다 점점 단백질-RNA 안정화 하는 자외선 (UV) 빛 가교 단계를 통합 하 여 상호 작용 이전 극적으로 인간 세포^{6,7,,89,10,11}RBPs의 카탈로그를 확장, mRNAs의 격리 꼬마 선 충 ¹²,¹⁴, saccharomyces cerevisiae의^12,13,및 다른 유기 체^{15,,1617,18, 19,20}. 그러나, 단백질의 특정 사본에 ncRNAs 매핑 여전히 좋은 도전입니다. 이 위해, 두 가지 주요 방법을 현재 사용: 한편으로, RNA aptamer 태그 친 화력 정화 수 있도록 관심의 RNA를 융합 하는. 따라서, RNA aptamers aminoglycoside 항생제를 포함 한 tobramycin 및 스^21,22,,2324또는 단백질 외 투 단백질 같은 높은 선호도와 바인딩 R17/MS2 살 균 소 또는 세균성 streptavidin S1^{25,,2627,,2829}. 비록이 방법은 상대적으로 강력 하 고 다재 다능 한 수를 표시 했다, 조사, 설계는 RNA 복제 요구 하 고 따라서 자연 mRNAs를 캡처하는 데 사용할 수 없습니다. 다른 한편으로, 센스 oligonucleotides (ASOs)는 복구에 대 한 초기에 사용 되었다 하 고의 높은 네이티브 RNPs^30,31 및 바이러스 성 RNAs³²표현. 더 최근에, ASOs 캡처 오래 비 코딩 RNAs^33,,3435 에 적용 된 고 생체 외에서 mRNPs³⁶형성. 모든 RNA 중심 접근 한 주요 제한 요인이 더 문제가 낮은 표현 mRNAs의 복구를 만들기 관심, RNA의 복사본입니다. 이 제한 반응; upscaling에 의해 극복 될 수 있다 그러나,이 잠재적으로 배경 증가 발생할 수 있습니다.

여기, 우리가 우리의 최근에 개발한 아소 기반 협동 RNA 격리 절차 (여행) 높은 선택도³⁷ (그림 1). 와 네이티브 mRNA 단백질 복합물을 설명 두 개의 순차적 아소 기반 정화 단계를 포함 하는 프로토콜, 상용 oligo(dT)와 많은 mRNAs의 특별히 설계 된 짧은 biotinylated 2'-methoxy를 사용 하 여 특정 mRNAs의 캡처 다음 비즈를 결합 하는 즉 ASOs RNA입니다. 이 2 단계 절차는 오염 단백질을 제거 하는 데 도움이 하 고 조정 및 최적화에 대 한 기회를 추가 합니다. 이 경우에, 여행에서 효 모, 선 충, 선택 된 mRNAs에 적용 된 그리고 mRNA 단백질 복합물을 형성 하는 인간 세포 vivo에서 확인 하.

1. 디자인 센스 Oligonucleotides (ASOs)

1. mRNA 또는 단편³⁸사용 가능한 온라인 도구 사용 하 여 그의 이차 구조를 분석 합니다. 따라서, 빈 상자에 뉴클레오티드 (nt) 시퀀스를 입력 합니다. 기본 옵션 상자에서 격리 된 기본적인 쌍을 방지및 최소 자유 에너지 (MFE) 및 파티션 함수를 선택 합니다. 출력 옵션 상자에서 대화형 RNA 이차 구조 플롯 을 선택 하 고 마지막 진행 버튼을 클릭 합니다. 새 창 관심의 mRNA의 이차 구조를 표시 하는 팝업이 됩니다.
2. 적어도 3 개의 다른 탐지 보조 구조 부족 한 지역에 우선적으로 관심의 mRNA 내 21-24 국세청 긴 시퀀스를 선택 (예., 구조화 되지 않은 루프에서) 및에서 3' 되지 않은 지역 (UTR).
   참고: 그것은 ASOs 3' 되지 않은 지역 (UTR) 시퀀스에 어 닐 링 최고의 수행 관찰 되었습니다. 1 개의 가능성은 리보솜 코딩 시퀀스 (CD)에 바인딩된 ASOs의 어 닐 링 방해 때때로 수 있습니다. 5 ' Utr는 어 닐 링 ASOs 테스트 하지 했다.
   1. 50 %guanidine / 시 토 신 비율 영역을 선택 하 고 헤어핀 또는 어 닐 링 자체의 잠재적인 형성을 피하기 위해 반복 뉴클레오티드 협동 부족.
3. 디자인 2'-methoxy RNA oligonucleotides biotin moiety는 3', 선택된 영역 (1.2 단계) 원하는 내에 완벽 하 게 보완에 베어링을 수정 하는 수동으로 mRNA를 대상.
   참고: 2'-methoxy 수정 RNA 저항 세포 RNases를 렌더링 하 고 녹는 온도에 엄격한 수 있는 이중을 증가 한다. Biotin moiety는 streptavidin과 ASOs를 캡처 필요 합니다.
   1. ~ 60-65에 RNA 하이브리드의 용융 온도 조정 ° C 높은 언어 시퀀스 복잡 다는 것을 확인 하 고 (> 60%)으로 적합 한 온라인 도구³⁹결정.
   2. ⁴⁰ 기본 로컬 정렬 검색 도구 사용 하 여 잠재적인 아소 크로스-교 잡에는 transcriptome 다른 mRNAs와에 대 한 검색. 뉴클레오티드 폭발, 빈 상자에 시퀀스를 삽입 선택 하 고 관심의 유기 체. 기본으로 나머지 매개 변수를 유지 하 고 폭발을 클릭 합니다.
      참고: 8-10 국세청의도 부분 연속 맞춤 간 교 잡 및이 mRNA의 복구를 발생할 수 있습니다.

2. 문화, UV 방사선 및 세포 세포 세포의 용 해

참고: 다음 절차는 설명 신진 효 모 S. cerevisiae, C. 선 충, 선 충 및 인간 미 발달 신장 세포 (HEK293). 그것은 명시적으로 아직 테스트 하지 않지만 그럼에도 불구 하 고, 뿐만 아니라, 다른 유기 체에 적용할 수 있습니다.

1. S. cerevisiae
   1. 효 모 세포를 성장 (예., BY4743 미분; 변형 MATa/α his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 LYS2/lys2Δ0 met15Δ0/MET15 ura3Δ0/ura3Δ0 PFK2:TAP / PFK2) YPD 미디어의 500 ml에서 (1% 효 모 추출 물, 2% 펩, 2 %D-포도 당) 220 rpm에서 일정 한 동요와 30 ° C에서.
   2. 중간 로그 단계에서 세포를 수집 (600 nm (OD)₆₀₀ 에서 광학 밀도 ~ 0.6) 0.45 μ m 나일론 필터를 사용 하 여 여과 또는 실 온 (RT)에서 2 분 동안 3000 × g에서 원심 분리. 삭제 흐름 통해 또는 상쾌한, 각각.
   3. 셀 세 번 25 mL의 인산 염-버퍼링-염 분 (PBS) 0.45 μ m 나일론 필터를 사용 하 여 세척 또는 RT에서 2 분 동안 3000 × g에서 원심 분리 하 여 수집 하 고는 상쾌한 삭제. 최대한 빨리 부과 스트레스 RNA-단백질 상호 작용에 영향을 미칠 수로 세포를 수집 합니다.
   4. 25 ml PBS의 셀 resuspend 하 고 정지는 15 cm 배양 접시에에서 붓는 다. 얼음에 접시를 놓고, 뚜껑을 제거 하 고 셀 세 번 400 mJ cm^-2 부드러운 혼합과 각 노출 주기 사이 얼음에 2 분 휴식 UV crosslinker에서 254 nm 자외선의 노출.
   5. 50 mL 튜브에 세포를 전송 및 4 ° c.에 3 분 동안 3000 × g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 삭제는 상쾌한 고 펠 릿을 유지.
      참고: 셀 스냅 액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장 된 수 합니다.
   6. 냉장된 세포의 용 해 버퍼 A의 4 mL에 셀 resuspend (파운드-A; 100 mM Tris HCl, pH 7.5, 500mm LiCl, 10 mM EDTA, 1% 트라이 톤 X-100, 5mm DTT, 20 U ml^-1 DNase I, 100 U ml^-1 RNasin, EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일을 완료).
   7. 2 2 mL 튜브에 세포를 전송 합니다. 최대 추가 합니다. ⅔의 유리 구슬 냉장 볼륨과 4 ° c.에서 10 분 동안 30 Hz에서 조직 lyser의 세포를 중단
   8. 뜨거운 바늘으로 튜브의 하단에 구멍을 펀치와 30에 대 한 600 × g에서 원심 분리 하 여 신선한 1.5 mL 튜브에는 lysate 전송 s.
   9. 3 분 동안 3000 × g에서 4 ° C에서 3 개의 순차 centrifugations에 의해 lysate 5000 × g 그리고 10000 × g 5 분에 대 한 선택을 취소 합니다.
      참고: 추출 스냅인-액체 질소에서 냉동 고 수-80 ° c.에 저장
2. C. 선 충
   1. 선 충 류 성장 매체 (NGM) 접시 (0.3 %NaCl, 1.7 %agar, 0.25% 펩, 1mm CaCl₂, 5 µ g/mL 콜레스테롤, 1mm MgSO₄, 25 mM KPO₄ 버퍼, pH 6.0) OP50 대장균 긴장 시드에 20 ° C에서 문화 브리스톨 N2 웜 ⁴¹ .
   2. 각 접시에 M9 버퍼⁴¹ (0.3% KH₂포₄, 0.6% 나₂HPO₄, 0.5 %NaCl, 1 mM MgSO₄)의 5 mL을 추가, resuspend 벌레를 15 mL 튜브에 벌레를 전송 접시를 동요 한다. 슬라이드에는 서 스 펜 션의 2 µ L를 놓고 정지에서 벌레는 현미경으로 계산 합니다. 다음 접시 당 벌레의 수를 계산 하려면 요소를 적용 합니다.
   3. 수집 ~ 120000 웜 (400 × g, 2 분, RT) 상 온에서 원심 분리 하 여 폐기는 상쾌한.
   4. 벌레 세 번 씻어. 따라서, M9 버퍼의 10 mL을 추가, 반전에 의해 혼합 및 실시간에 2 분 동안 400 × g에서 원심 분리 하 여 벌레를 수집
   5. 벌레를 M9 버퍼의 15 mL를 추가 하 고 실시간에 15 분 동안 회전 바퀴에
   6. NGM 접시 (접시 당 4000 ~ 웜)에 벌레를 전송 및 UV 빛에 노출 (254 nm) UV-crosslinker에서 300 엠 제이 cm^-2 에서.
   7. 접시에 직접 M9 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 버퍼에 벌레를 resuspend에 접시를 흔들어. 15 mL 튜브에는 피 펫과 서 스 펜 션을 전송 하 고 실시간에 2 분 동안 400 × g에서 원심 분리 하 여 벌레를 수집
   8. 세포의 용 해 버퍼 B의 2 mL에 벌레를 resuspend (파운드-B; 100 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 m m NaCl, 1 mM EDTA, 0.75 %IGEPAL, 1mm DTT, 20 U mL^-1 DNase I, 100 U mL^-1 RNasin, EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일을 완료).
   9. 액체 질소로 채워진 박격포에 벌레 갈아. 실시간에 녹여 50 mL 튜브에 분말을 수집
      참고: 액체 질소 안전 절차 (예: 연기 후드와 안전 장갑)에 따라 처리 합니다.
   10. Lysate 10 분 14000 × g에서 원심 분리 하 여 지방 층 포함 한 하 고 이후에 명확히 전달 0.45 μ m 필터 주사기를 통해 lysate.
3. 사람 배양된 세포
   참고: 다음 설명 기반 과도 transfection HEK293 세포 pGL3-CDKN1B-3 ' UTR 기자 플라스 미드 CDKN1B/27의 하류 반딧불 luciferase 유전자⁴²의 3′UTR 표현 하.
   1. 문화 HEK293 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 포도 당 25 m m 및 1 m m 나트륨 pyruvate, 포함 된 100 mL^-1 페니실린, 100 µ g mL^-1 스과 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 보충 하 고 37 ° c에서 품 어는 습도 챔버 (인큐베이터) 포함 된 5% CO₂.
   2. 표준 10cm 조직 문화에 씨 ~ 3 × 10⁶ HEK293 세포 transfection는 전날 접시. hemocytometer 셀을 계산 합니다.
   3. 취재 원 유전자의 믹스 2 µ g (예., pGL3-p27-3'UTR) transfection 시 약의 20 µ L와 70 %confluency (~ 7 × 10⁶ 셀)에 셀 transfect 고.
   4. 수확 하기 전에 셀 추가 48 h에 대 한 37 ° C에는 인큐베이터에 배치 합니다.
   5. 혈 청 학적인 피 펫과 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 PBS의 10 mL로 두 번 셀을 신속 하 게 세척 혈 청 학적인 피 펫으로 PBS를 제거 합니다.
   6. 접시에 6 mL PBS의 추가 얼음에 놓고 다음 셀 UV 빛에 노출 (254 nm) UV crosslinker에 100 mJ cm^-2 에서.
      참고: 접시 유지 되어야 한다 얼음에-자외선 노출 시.
   7. 셀 (총 10 ~⁷ 셀) PBS에 15 mL 튜브에 떨어져 다쳤어요.
   8. 4 ° C에서 10 분 동안 250 × g에서 셀 아래로 회전 시키십시오 하 고는 피 펫과 상쾌한 제거.
      참고: 셀 펠 릿 스냅-액체 질소에서 냉동 고 사용까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
   9. 미리 냉장된 세포의 용 해 버퍼의 2 mL에 셀 resuspend (파운드-A)에 대 한 아래로 pipetting으로 5-6 번, 얼음에 튜브를 유지 하면서.
   10. 얼음에 5 mL 튜브에는 피 펫과 lysate 전송.
   11. 제목 lysate 쥡니다 30와 10 μ m 진폭에서 20 s 파열의 구성의 3 라운드를 얼음에 기간 냉각의 s.
       참고: 쥡니다 세포와 파편 DNA의 세포의 용 해 완료로 좋습니다.
   12. 2 mL 튜브 및 4 ° c.에서 10 분 동안 15000 × g에서 원심 분리기는 lysate 전송 (= 추출) 상쾌한 수집 및 새로운 튜브에 전송. 추가 단백질 및 RNA 분석을 위한 분석 샘플 (5-10%)를 제거 합니다.
       참고:이 단계는 모든 나머지 세포 파편을 제거 하는 중요 하 고 반복 될 수 있습니다.

3. 첫 번째 단계: 많은 RNA 격리

1. Oligo(dT)₂₅의 1 mg equilibrate-결합 각 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L에 자석 구슬.
2. 결합 5 mg, 10 mg 또는 4 mg (단백질) S. cerevisiae, C. 선 충 또는 HEK293 추출, 각각, oligo(dT)₂₅ 의 1 밀리 그램-자석 구슬 결합. 믹서에 25 ° C에서 10 분 동안 적극적으로 샘플을 믹스.
   참고: 추출의 단백질 농도 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 참조 표준으로 Bradford 분석 실험으로 확인할 수 있습니다. 샘플의 활기찬 동요 구슬의 침전을 방지 합니다. MRNA 격리의 특이성을 평가 하기 위해 제어 실험 polyadenylic 산 (pA)의 초과 (20 µ g)를 추가 하 여 병렬로 수행할 수 있습니다.
3. 10 s를 제거 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한. 복구 (단계 3.7)의 다음 라운드에 대 한 얼음에 상쾌한을 유지.
4. 세척의 500 µ L A 버퍼 추가 (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 600mm LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% 트라이 톤 X-100) 구슬과 5 소용돌이에 s.
   참고: 워시 버퍼에 LiCl의 농도가 달라질 수 있습니다. 600 mM LiCl 좋지만 낮은 농도 (500 m m C. 선 충, HEK293 300 m m) 테스트도 했다.
5. 자석으로 비즈를 수집 하 고 구슬 (WB, 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 600mm LiCl, 1 mM EDTA)는 워시 버퍼 B의 500 µ L로 두 번 세척.
6. 믹서에 10 mm Tris HCl, pH 7.5 연속 떨고 (1000 rpm)으로 2 분 동안 80 ° C에서 30 µ L에서 RNA을 elute. 즉시 튜브 마그네틱 스탠드에 놓고 10 후는 eluate 수집 미 저장 정화의 추가 라운드 구슬.
   참고: 낮은 온도에서 구슬에 mRNAs의 잠재적인 다시 바인딩 방지 하기 위해 가능한 한 빨리는 eluate를 수집 합니다.
7. 3.3 단계에서 수집 된 상쾌한에 구슬 이전 단계에서 추가 하 고 반복 캡처, 세척 및 차입 mRNAs의 두 번 (단계 3.3-3.6). 반복된 라운드에서 있다 다음 결합 하 고-80 ° c.에 저장 될 수 있다

4. 두 번째 단계: 3'-Biotinylated' 2-Methoxy 수정 센스 RNA Oligonucleotides와 특정의 캡처 mRNAs

참고: ASOs의 적합성을 테스트 하기 위해 다음 절차는 총 RNAs 셀에서 격리를 수행할 수 있습니다.

1. 30 µ L 바인딩의 1 mL에 자석 구슬 streptavidin 결합의 equilibrate와 버퍼 (B & W 버퍼, 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 m EDTA, pH 8.0)을 씻어 1 시간에 대 한 회전에 0.1 mg mL^-1대장균 이동 RNA (tRNA)을 포함 하 실시간
   1. 구슬 B & W 버퍼의 750 µ L로 세 번 세척.
   2. B & W 버퍼의 30 µ L에 구슬 resuspend 그리고 사용까지 얼음에 계속.
2. 이전 많은 격리에서 총 단백질의 ~ 35 µ g을 희석 (참조 3) 1.5 mL 튜브에 B & W 버퍼의 100 µ L에서.
   참고: 총 RNA와 ASOs의 특이성을 테스트 하려면 추가 600 B & W 버퍼의 100 µ L 정제 총 RNA의 ng.
3. 각각 아소의 200 pmol 추가 하 고 5 분 동안 70 ° C에서 품 어.
   참고: 높은 온도 아소의 어 닐 링을 촉진 하는 RNA 이차 구조를 해결 합니다.
4. 장치에서 전체 열-블록을 제거 하 고 천천히 진정 10 분에 대 한 실시간에 그것을 배치.
5. 4.1 단계에서 샘플 equilibrated streptavidin 결합 자석 구슬의 30 µ L를 추가 합니다.
6. 믹서에 950 rpm에서 일정 한 동요와 25 ° C에서 30 분 동안 혼합물을 품 어.
   참고:이 좋습니다 구슬의 침전을 방지 하기 위해 튜브 마다 10 분 영화를.
7. 튜브에 마그네틱 스탠드, 제거는 상쾌한 놓고 55 ° c.에 세 번으로 미리 데워 B & W 버퍼의 750 µ L 구슬 세척
   참고: 최적의 세척 온도 달라질 수 있습니다 약간 다르다/다른 ASOs 사이. 비 가교 된 총 RNA 사전 셀 추출 물으로 실험을 수행으로이 상태를 조정 하는 것이 좋습니다.
8. 10 mm Tris HCl, pH 7.5 믹서. 에 950 rpm에서 일정 한 동요와 10 분 동안 90 ° C에서 20 µ L에서 RNA elute 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 eluate 즉시 수집 합니다.
   참고: 단백질 분석용 구슬에 1 × Laemmli 버퍼의 20 µ L을 추가 하 고 5 분 단백질은 immunoblot 분석 표준 실험실 프로토콜을 다음에서 모니터링에 대 한 95 ° C에서 품 어.

우리는 여행, 3 다른 유기 체37에서 바인딩된 단백질 그들의 특정 한 mRNAs를 잡으려고 불리는 아소 기반 RNA 격리 전략 개발. 본질적으로, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서 했다 254 nm, 및 많은 세포의 UV 방사선에 의해 RNAs는 상용 올리고 (dT) 결합 하는 자석 구슬, 복구 된 다음의 mRNA와 격리 했다 3'-biotinylated 2-0'-methoxy 수정 센스 RNA oligonucleotides (그림 1). 우리 따라서 전체 complementarity 여러 21-24 국세청 수정 ASOs 영역 선택 된 mRNAs에 효 모, 선 충 C. 및 인간, 디자인과 (뇌관 및 ASOs의 목록이 테이블에서에서 주어진 다 관심의 mRNA를 복구할의 적합성 테스트 1). 효율성과 개별 ASOs의 특이성 각 유기 체에서 분리 된 비 가교 된 총 RNA와 먼저 평가 했다. 이 실험에서 RNA ASOs streptavidin 활용 된 상자성 구슬에 결합 되었고 해당 유기 체에서 준비 하는 비 가교 된 총 RNA와 인 큐베이 팅. 구슬에서 캡처된 mRNAs의 출시 후 mRNA의 존재 뿐만 아니라 없는 제어 mRNAs는 반전 녹음 방송 (RT)에 의해 모니터링 대상-중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)37. 우리는 두 개의 변수, 소금 농도 및 온도 워시 버퍼, 3 개의 다른 ASOs (그림 2A)와 함께 테스트 되었습니다 누 룩에서 PFK2 mRNA의 캡처의 효율에 중요 한 역할을 했다 것으로 나타났습니다. 복구 감소 25 m m 소금 (NaCl) 농도 낮추는 부정적인 모든 ASOs, 감지할 수 없는 수준 mRNA (PFK1)를 제어 하지만 그것은 또한 원하는 복구 감소 표적 mRNA PFK2 (입력의 10-15%). 반대로, 생리 적인 수준 (150 m m NaCl) 염 농도의 증가 PFK2 mRNAs의 복구와 아소 PFK2-2, PFK1 컨트롤의 초과 75%까지 증가 하 여 mRNA 적어도 5 (그림 2A). 추가 메모의 다른 ASOs mRNA의 중대 한 변이 대상 캡처 신진대사에서 보였다 생리 소금 농도, ASOs. 의 경험적 검증에 대 한 필요성을 강조 워시 버퍼의 온도 의존 mRNA 복구의 cep-1 C. 선 충과 효 RPS20 mRNAs 각각 ASOs (표 1)를 사용 하 여 exemplified입니다. 우리는 최적의 세척 온도 50 ° C와 분명 관련이 없는 mRNAs와 mRNAs 대상 (그림 2B)의 효율적인 복구 낮은 배경에서 55 ° C 사이 했다 관찰 했다. 이 시점에서, 우리는 십자가-교 잡의 ASOs의 다른 mRNAs와 가능성을 강조 하고자 합니다. 예를 들어 DNM1 아소 DNM1 코딩 시퀀스 내에서 시퀀스를 완벽 하 게 보완 이지만 그것은 또한 부분적으로 ACT1 mRNA와 anneals. DNM1 ASOs 간 교 잡 (그림 2C)에 대 한 강한 성향을 보여주는 세척 온도 관계 없이 모두 mRNAs 복구. 마지막으로, 우리는 위의 설명된 테스트 사용 하 고 최적화 선택에서 각각 대상 mRNAs의 복구에 적합 했던 3 ASOs를 총 RNA S. cerevisiae, C. 선 충 및 인간의 세포 (그림 2D에서 격리 ).

적당 한 ASOs 생체 외에서 의 초기 선택 후 우리 셀 추출 물 자외선 가교 된 생물/셀 (그림 1)에서 얻은 여행을 수행. 특히, 우리는 3 개의 다른 유기 체에서 3 개의 다른 mRNAs의 복구 테스트: 효 모 S. cerevisiae, cep 1 C. 선 충, 선 충 및 기자에서에서 PFK2 mRNA mRNA (pGL3-CDKN1B-3'UTR) 3' UTR 베어링 인간 CDKN1B/p27 mRNA 순서 인간 HEK293 세포에서 과도 식 luciferase (루크) 기자에 게 융합. RNA 격리의 특이성을 제어 하려면 모니터링 하는 여러 관련 없는 mRNAs의 복구 하 고 우리는 펜 실바 니 아 셀 추출 물에 oligo(dT)25에 세포 mRNAs의 바인딩으로 경쟁의 과잉의 추가 의해 경쟁 실험 수행 는 첫 번째 단계 정화 단계 동안 구슬. 이전 비 가교 된 총 RNA 샘플 (그림 2), RT-PCR 확인 본 각 mRNAs의 농축 대상 mRNA 여행 동안, 여러 비 관련 제어 mRNAs 농축 되지 했다 반면 (그림 3A). 또한, 어느 mRNAs ASOs, 불특정 바인딩 방지 하는 적절 한 차단 절차를 나타내는 없이 구슬에 감지 했다. 이 줄에 무관/발진 ASOs 또한 사용할 수 있습니다 제어, 특정 mRNAs와 바운드 단백질의 유추 캡처 간 교 잡에 대 한 잠재적인 다음 고려 되어야 하는. 이후 최종 eluate에 단백질은 스테인드 polyacrylamide 젤 (데이터 표시 되지 않음)에 거의 구상 될 수, 이전에 알려진된 mRNA 상호 작용 단백질의 존재는 더 immunoblot 분석에 의해 평가 됩니다. S. cerevisiae, 리보솜 독립적인 방식으로12; PFK2 mRNA를 선택적으로 묶는에서 Pfk2p 포함 C. 선 충 GLD-1, 3 ' UTR cep 1 의 시퀀스는 정식 RBP mRNA 변환 규칙43; 그리고 허는 RBP mRNA 안정성 및 p27/CDKN1B mRNA44의 번역. 예상 대로,이 단백질의 모든 서쪽 오 점 분석 (그림 3B)에 의해 각각 mRNAs의 여행 있다에서 확인 되었다.

그림 1입니다. 여행의 도식 대표. 단백질은 RNA에 vivo에서 UV 방사선에 의해 가교 된. (밝은 녹색 상자) 첫 번째 단계에서 많은 RNA-단백질 복합물 oligo(dT)25 구슬 언바운드 단백질 제거 하려면 엄격한 세척 조건 적용 복구 됩니다. 두 번째 단계 (핑크 상자)에서 대상 mRNP는 뽑아-아웃 biotinylated 센스 RNA oligonucleotides와 streptavidin 구슬. 순화 mRNPs 다음 RT-PCR 및 immunoblot/질량 분석 (MS) RNAs 단백질 각각의 관심, mRNA와 상호 작용을 식별 하 여 분석 된다. 그림은 권한이 있는 이전 게시37 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 비 가교 화 셀/유기 체를 사용 하 여 전체 RNA에서 선택 된 mRNAs의 절연 antisense RNA 캡처 프로브 수정. (A) 효 모 PFK2 mRNA ASOs와의 캡처 효율성에 소금 농도의 영향. 효 모 세포에서 총 RNA 표시 ASOs와 결합 되었고 55 ° c.에 지정 된 소금 (NaCl) 농도 포함 하는 버퍼와 세척 그린, 블루와 오렌지 라인 대표37RT-PCR 의해 결정으로 다른 ASOs PFK2 mRNA 복구: PFK2 1 , PFK2-2에는 3' UTR, CD에서 PFK2 4 anneal. PFK1 는 부정적인 mRNA를 제어. PCR 32 증폭 사이클 수행 하 고 앞에서 설명한37로 계량 했다. C. eleganscep-1 및 효 모 RPS20 아소의 (B) 일부 다른 세척 온도, 검정과 빨강 라인에 각각 표현에서 mRNAs 바인딩됩니다. C. eleganspgk-1 및 효 모 ACT1 비 대상 (제어) mRNAs는. 30과 32 PCR 주기는 각각 효 모와 선 충 C. mRNAs의 검출에 대 한 적용 했다. (C) DNM1 ACT1 mRNA와 (빨간) 시퀀스는 DNM1 mRNA로 잠재적인 간 교 잡에 아소의 교 잡의 도식 대표는 왼쪽에 표시 됩니다. 효 모 DNM1 및 ACT1 mRNAs 구슬에서 eluted의 검출을 위한 RT-PCR 반응 (30 주기)에서 제품을 보여주는 agarose 젤 오른쪽에 표시 됩니다. 입력, 총 RNA; Sn, ASOs;를 가진 외피 후 상쾌한 E, 구슬에서 세척에서 있다 표시 온도 이전 차입 (40 ° C, 50 ° C와 60 ° C). 제어 실험 (Ctrl) 아소를 추가 하지 않고 동시에 수행 되었다. (D) Agarose 젤 (오른쪽) 효 모 S. cerevisiae, C. 선 충, 그리고 인간의 HEK293 세포 (H. sapiens)의 총 RNA에서 캡처한 mRNAs의 검출을 위한 RT-PCR 제품을 보여주는. 입력, 총 RNA; Sn, 표면에 뜨는; E, 구슬에서 있다입니다. PCR 효 모 mRNAs에 대 한 30 확대 주기, C. 선 충 mRNAs 32 사이클에 의해 수행 됐다 고 28 및 30 각각 인간의 tubulin p27 mRNAs를 주기. 그림은 권한이 있는 이전 게시37 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3입니다. 여행과 자외선 가교 된 셀에서 파생 된 추출 물에서 특정 mRNA 단백질 복합물의 캡처. (A) Agarose 젤 oligo(dT)와 S. cerevisiae, C. 선 충 그리고 인간 (H. sapiens) 셀 추출 물에서 나타난된 ASOs 캡처 시 RT-PCR와 (오른쪽) mRNAs의 검출에 대 한. 입력, 가교 화 셀/유기 체;에서 총 RNA Ctrl 키, 아소 없이 제어입니다. 많은, 많은 경쟁 RT-PCR은 35 증폭 사이클 설명된37 로 뤽에 대 한 p27, 32 주기 그리고 수행 29 tubulin위해 사이클. (B) 표시 된 항 체 (오른쪽)와 mRNA-바인딩 단백질의 Immunoblot 분석. 로드 된 분수는 다음과 같습니다: 0.1%, 2.5% 1% 효 모, 선 충 및 인간의 입력; 10%, 10%, 5% 효 모, 선 충 및 인간 oligo(dT) 차선; 그리고 모든 ASOs 차선 66%입니다. 분자 무게 (MW) kilodaltons (kDa)에 표시 됩니다. 그림 허가37와 게시입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1입니다. Oligonucleotide 시퀀스. PCR 뇌관 및 ASOs 확대 후이 일, 뇌관 순서, 유전자 대상 및 예상된 조각 크기에 사용의 목록입니다.

저자는 공개 없다.