방법 논문

시각화 Axonal 성장 콘 붕괴 교양된 마우스 신경에 있는 초기 아 밀 로이드 β 효과

DOI:

10.3791/58229

⸱

2018년 10월 30일

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

이 논문에서

요약

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여기 아 밀 로이드 β (Aβ)는 뇌에서의 초기 효과 조사 하기 위해 프로토콜 제공 됩니다. 이것은 clathrin 중재 된 endocytosis 및 axonal 성장 콘의 붕괴 유도 하는 Aβ 보여준다. 프로토콜 axonal 성장 콘에 Aβ의 초기 효과 공부에 유용 하 고 알 츠 하이 머 병의 예방을 촉진 수 있습니다.

초록

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아 밀 로이드 β (Aβ)는 Alzheimer의 질병 (광고)에 메모리 장애를 발생합니다. 치료제 광고 환자의 두뇌에서 Aβ 수준을 줄이기 위해 표시 되었습니다, 비록 이러한 메모리 기능을 향상 되지 않습니다. Aβ 메모리 손상의 모양 전에 뇌에 집계, 이후 Aβ를 대상으로 수 있습니다 이미 메모리 적자 전시 광고 환자 치료에 대 한 효율적. 따라서, Aβ 증 착으로 인해 다운스트림 신호 광고 개발 하기 전에 차단 합니다. Aβ 신경 네트워크 및 메모리 손상의 방해로 이어지는 axonal 변성을 유도 합니다. Aβ 독성의 기계 장치에 많은 연구 들이 있더라도, Aβ 독성의 소스를 알 수 없는 남아 있습니다. 소스를 식별 하려면 우리는 현미경 검사 법, 유전자 transfection, 라이브 셀 이미징 교양된 뉴런의 axonal 성장 콘에 Aβ에 의해 발생 하는 초기 변화를 조사 하기 위해 사용 하는 새로운 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜은 Aβ 억제 endocytosis의 Aβ 독성을 방지 시연 clathrin 중재 된 endocytosis axonal 성장 콘 성장 콘 붕괴 뒤에 유도 밝혔다. 이 프로토콜은 Aβ의 초기 효과 공부에 도움이 될 것입니다 하 고 보다 효율적이 고 예방 광고 치료로 이어질 수 있습니다.

서론

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아 밀 로이드 β (Aβ) 예금 Alzheimer의 질병 (광고) 환자의 뇌에서 발견 되 고 메모리 장애2,,34로 이어지는 광고1 신경 네트워크를 방해 하는의 중요 한 원인으로 간주 됩니다. 많은 임상 약물 후보 아 밀 로이드 β (Aβ) 생산을 효과적으로 방지 또는 Aβ 예금을 제거 표시 되었습니다. 그러나, 아무도 AD 환자5에 메모리 기능을 개선에 성공 했다. Aβ는 메모리 장애6;의 발병 전에 뇌에 이미 입금 됩니다. 따라서, 환자의 두뇌에서 Aβ 수준 감소 전시 메모리 장애 수 있습니다 효과. Aβ 증 착은 전 임상 광고 환자; 그러나, 이러한 환자는 거의 신경 변성 및 메모리 적자6제시. Aβ 증 착 및 메모리 장애 사이의 지연 시간입니다. 따라서, 광고의 예방을 위한 중요 한 전략 광고, 이전에 메모리 적자의 개발의 초기 단계 동안 신호 Aβ 독성을 차단 합니다. Aβ 착 유도 축 삭 변성7,....

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프로토콜

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모든 실험 관심과 도야마 대학 스기타 캠퍼스에서 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 실시 했다 및 동물 관리 및 사용의 실험실 동물의 스기타 캠퍼스에 대 한 위원회에 의해 승인 된 대학교의 도야마 (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. 붕괴 분석 결과

  1. 폴 리-D-리 코팅
    1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 5 μ g/mL 폴 리-D-라이 신 (PDL)의 400 μ와 8 잘 문화 슬라이드 코트 하 고 37 ° C에서 밤새 그들을 품 어.
    2. PDL 솔루션을 제거 하 고 세척 3 번 증류수와 우물.
  2. 신경 문화24
    1. 신경 문화 매체 12% 말 혈 청, 포도 당 0.6%, 그리고 2 mM L-글루타민 (중형 A) microscissors와 배아 하루 14 (E14) ddY 쥐에서 갓 고립된 대뇌 외피가 말하다. 항생제를 추가 하지 마십시오.
      참고:이 프로토콜 ddY 마우스 사용 됩니다. 이것은 일본에서 일반적으로 사용 되는 outbred 긴장 이다. 이 신경 세포 문화 프로토콜 쥐 대뇌 피 질의 뉴런7,

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결과

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이 프로토콜에서 Aβ1-42는 incubated 37 ° C에서 사용 하기 전에 7 일 동안 부 화 Aβ1-42의 독성 형태27,28,,3035생산 필요 했다 때문에. 이 부 화 후 Aβ의 집계 된 형태 (그림 1A)를 관찰 했다. Aβ1-42의 비슷한 인큐베이션 fibril 형태 Aβ36의 생산으로 보고 되었습니다. 치료 후이 집계 Aβ1-42와 함께, immunostaining Aβ,3537 의 유독한 올리고 머에 대 한 항 체와 함께 수행한.......

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토론

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이 연구에서 설명 하는 프로토콜 Aβ1-42 치료 후 axonal 성장 콘에 초기 현상의 관찰을 사용할 수 있습니다. Aβ1-42 유도 axonal 성장 콘 20 분 이내에 endocytosis 그리고 성장 콘 축소 치료의 1 시간 이내에 관찰 되었다. 이 endocytosis clathrin에 의해 아마 중재 했다. 이 프로토콜을 사용 하 여 억제 clathrin 중재 된 endocytosis의 Aβ1-42-유도 된 성장 콘 붕괴와 교양된 신경27axonal 변성을 방지 하기 위해 확인 되었다. 또한, clathrin 중재 된 endocytosis의 저해 감쇠 axonal 변성 Aβ1-42-유도 및 메모리 적자 vivo에서27. 이러한 결과 clathrin 중재 된 endocytosis 광고 방지를 위한 유망 치료 애비뉴 나타냅니다.

이 프로토콜 개발 되었다에서 축소 3A와 e.......

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공개 사항

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저자는 공개 상관이 있다.

감사의 글

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이 작품은 부분적으로 JSP에서 연구 보조금 지원 (KAKENHI 18 K 07389), 일본, 다케다 과학 재단, 일본, 그리고 고바야시 제약, 일본.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ddY 마우스SLC
8웰 배양 슬라이드팔콘354108
폴리 D 라이신Wako168-19041
배양 배지, Neurobasal 배지Gibco21103-049
하우스 세럼Gibco26050-088
포도당Wako049-31165
L-글루타민Wako074-00522
0.05% 트립신Gibco25300-054
DNase IWorthingtonDP
대두 트립신 억제제Gibco17075-029
70 µ 필터; m 메쉬 크기, 셀 스트레이너Falcon352350
B-27 보충제Gibco17504-044
CO2 인큐베이터AstecSCA-165DS
아밀로이드 &베타; 1-42Sigma-AldrichA9810
파라포름알데히드Wako162-16065
자당 Wako196-00015
수성 장착 매체, Aqua-Poly/Mountpolysciences18606-20
반전 현미경 ACarl ZeissAxio Observer Z1 AxioCam MRm, 히팅 유닛 XL S, CO2 모듈 S1 및 TempModule S1과 연결
Objective Plan-Apochromat 20xCarl Zeiss420650-9901
Objective Plan-Apochromat 63xCarl Zeiss440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40XNikon
anti-MAP2 IgGAbcamab32454
anti-tau-1 IgGChemiconMAB3420
anti-amyloid β 항체IBL10379클론 11A1
일반 염소 혈청Wako143-06561
소 혈청 알부민Wako010-25783
t-octylphenoxypolyethoxyethanolWako169-21105
AlexaFluor 594와 접합 염소 anti-mouse IgGInvitrogenA11032
AlexaFluor 488과 접합된 염소 anti-rabbit IgGInvitrogenA11029
핫 플레이트NISSINNHP-M30N
커버 유리피셔 사이언티픽12-545-85
35mm 접시IWAKI1000-035
실리콘 RTVShin-EtsuKE42T
핸드 펀치Roper WhitneyNo.
형광 멤브레인 프로브, FM1-43FXInvitrogenF35355
Ca2+- 및 Mg2+-free Hanks' Balanced Salt solutionGibco14175-095
Transfection solution, Nucleofector solutionLonzaVPG-1001
Electroporator, Nucleofector IAmaxa
도립 현미경 BKeyenceBZ-X710
이미지 소프트웨어, ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
XX

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic ....

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Tau 1MAP 2

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