방법 논문

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

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DOI:

10.3791/58240

⸱

2018년 9월 27일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

이 논문에서

요약

달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.

초록

단일 셀 수준에서 진동의 실시간 측정 생물 시계의 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 대량 추출 Xenopus laevis 계란에서 준비는 되어 있지만 생화학 네트워크 기본 세포 주기 진행을 해 부에 강력한, 그들의 앙상블 평균 측정 일반적으로 이끌어 각에 불구 하 고 감쇠 진동 지속 되는 개별 발진기 시끄러운 생물 학적 시스템에서 개별 발진기 간의 완벽 한 동기화의 어려움 때문입니다. 검색 하려면 발진기의 단일 셀 역학, 우리 셀 같은 구획 Xenopus laevis 계란의 자전거 세포질 추출 물을 캡슐화에 mitotic 사이클을 다시 구성할 수 있는 물방울 기반 인공 세포 시스템을 개발. 이러한 간단한 세포질 전용 셀 30 사이클에 대 한 지속적인된 진동 전시. 핵을 가진 더 복잡 한 세포를 구축, 우리는 demembranated 정자 염색 질 시스템에서 자기 조립 핵을 방 아 쇠를 추가. 우리 염색체 응축/decondensation의 정기적인 진행을 관찰 하 고 핵 실제 셀에 같은 고장/개혁, 봉투. 이 mitotic 발진기 여러 다운스트림 mitotic 이벤트를 충실 하 게 기능을 나타냅니다. 우리는 동시에 mitotic 발진기 및 다중 채널 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 방울에 다운스트림 프로세스의 역학을 추적 합니다. 양적 조작 및 가능성이 규제 기계와의 기능에 중요 한 통찰력을 제공 하는 단일 셀 해상도, mitotic 진동의 분석을 위한 높은 처리량 프레임 워크를 제공 하는 인공 세포 주기 시스템 시계입니다.

서론

Xenopus laevis 계란에서 준비 하는 세포질 추출 물 중 가장 주된 모델 oocytes, 급속 한 세포 주기 진행 및 재구성 하는 능력의 큰 볼륨을 주어 세포 주기의 생화학 연구에 대 한 대표 mitotic 이벤트 체 외에서1,2. 이 시스템 초기 발견과 필수적인 세포 주기 레 귤 레이 터의 기계적 특성 등 다운스트림 mitotic 프로세스 뿐 아니라 성숙 촉진 인자 (MPF) 스핀 들 어셈블리 및 염색체 분리1 같은 수 있다 ,2,3,,45,6,7,8,9,10, 11. Xenopus 달걀 추출 물 또한 세포 주기 시계8,12,,1314 의 규제 네트워크의 상세한 해 부 및 DNA 손상의 연구에 대 한 사용 되었습니다. /replication 검사점15 그리고 mitotic 스핀 들 어셈블리 검사점16,,1718.

Xenopus 달걀 추출 물을 사용 하 여 셀의 이러한 연구는 주로 되었습니다 기반으로 대량 측정 합니다. 그러나, 기존의 대량 반응 분석 실제 셀 동작, 그들의 크기 및 반응 분자의 subcellular 공간 구획에 큰 차이가 주어 모방 하지 않을 수 있습니다. 또한, mitotic 활동의 대량 측정 전에 신속 하 게 감쇠8사이클의 제한 된 수를 주는 경향이 있다. 대량 반응의 이러한 단점 추가 복잡 한 시계 동적 속성 및 기능에 대 한 이해를 제공 하기 위해 추출 시스템을 방지 했습니다. 최근 연구는 셀 무료 cytostatic 요인 체포 (CSF) Xenopus 추출 물19,20 크기 정의 셀 같은 구획에 의해 스핀 들 크기는 변조 하는 방법을 명료 하 게 도운로 캡슐화는 세포질 볼륨입니다. 그러나,이 생체 외에서 시스템은 cytostatic 요소1의 행동에 의해 감수 제 2 분열의 분열에서 체포 하 고 세포 주기의 추가 조사에 대 한 단일 셀 수준에서 장기 지속적인된 진동 수 있는 시스템 필요 발진기입니다.

공부 하 고 단일 셀 해상도 세포 주기 진동, 우리 셀 규모, 재구성 및 개별 아사카에 여러 자기 지속적인된 mitotic 진동 프로세스의 동시 측정을 위한 높은 처리량의 시스템 개발 작은 물방울. 이 상세한 비디오 프로토콜에 10에서 300 µ m에 배열 하는 크기의 microemulsions에서 자전거 Xenopus laevis 계란 세포질을 캡슐화 하 여 인공 mitotic 진동 시스템의 창조를 설명 합니다. 이 시스템에서는, 염색체 응축과 드 응축, 핵 붕괴와 개혁, 그리고 저하 고 anaphase 기판 (예: securin-mCherry이 프로토콜에서)의 합성 등 mitotic 진동 했다 성공적으로 재구성 된다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 세포 주기 재구성 및 탐지에 대 한 자료의 준비

  1. 플라스 미드 DNA 건설과 securin mCherry의 mRNA 정화에 대 한 복제 깁슨 어셈블리
    1. PMTB2 벡터 백본, securin, 그리고 연쇄 반응 (PCR)을 통해 mCherry를 포함 하 여 3 개의 DNA 조각을 준비 하 고 정화21,22젤.
    2. fluorospectrometer을 사용 하 여 파편의 농도 측정 합니다. 백본 1에서 securin 및 mCherry 삽입과의 결합 100 ng: 1:1 분자 비율 5 µ L에 대 한 반응의 총 볼륨 조절 이온된 수를 추가 하 고.
    3. 1의 3 mL와 함께 등온 어셈블리 반응 버퍼 x 5의 6 mL 준비 M Tris-HCl (pH 7.5), 1 M MgCl2, 600 10 mM dNTP의 µ L, 1 M DTT의 300 µ L, 페그-8000, 1.5 g 및 나드23의 20 밀리 그램의 300 µ L.
    4. 1 x 등온선 어셈블리 반응 버퍼 aliquot의 15 µ L를 결합된 조각을 추가 합니다. 15 분 동안 50 ° C에서 PCR 반응 관에 반응을 품 어.
    5. 0.8 %agarose 젤과 전압 10 V/cm이이 파편의 어 닐 링 효율 확인의 실행을 확인 합니다.
    6. 생성 된 플라스 미드를 정화 하 고 elute RNase 무료 물 15 µ L를 사용 하 여. 50 순화 된 플라스 미드 DNA의 1 µ L 변환 µ L DH5α 유능한 대장균 의 세포24 미래 사용을 위해.
    7. 추출 및 securin mCherry DH5α 유능한 대장균 에서 DNA 플라스 미드 정화 셀.
    8. MRNA에 선형화 securin mCherry 플라스 미드 DNA를 transcribe 고 정화는 mRNA. MRNA의 농도가 100 ng / µ L 이며 260에서 흡 광도의 비율을 확인 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm 및 280 nm은 약 2.0.
  2. Demembranated Xenopus laevis 정자 DNA의 준비
    참고: 머 레이 19911에서 적응.
    1. 성인 남성 Xenopus laevis안락사25 와 4 개의 남성 개구리26,27testes를 해 부.
    2. 4 개구리에서 testes 동일한 100 mL 페 트리 접시에에서 놓습니다. 감기 1 x MMR 솔루션 (0.1 M NaCl, KCl 2mm, MgCl2, 2mm CaCl2, 5 mM HEPES, 0.1 m m EDTA의 1 mM) 50 mL에 세 번 testes를 씻어.
    3. 100 mL 페 트리 접시에 testes에서 과잉 혈액과 지방 제거 하 고 찬 핵 준비 버퍼 (일) (250 m m 자당, 15 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5 m m spermidine trihydrochloride, 0.2 m m spermine tetrahydrochloride)에 두 번 세척.
    4. 핵 준비 버퍼 (일)을 제거 하 고 0.2 cm 100 mL 페 트리 접시에에서 해 날카로운가 위를 사용 하 여 보다 작은 길이 조각으로 testes를 잘라. 추가 분석에 대 한 고환에 찬 일의 8 mL를 추가 합니다.
    5. 사용 나일론 메시 직물 70 µ m의 기 공 크기와 testes를 필터링 하 고 15 mL 원뿔 관으로 정자 샘플을 수집. 4 ° C에서 10 분 동안 1,730 x g에서 수집된 sperms 아래로 회전 시키십시오 고 상쾌한을 제거 합니다.
    6. 일의 1 mL 및 50 µ L 10 mg/mL lysolecithin의 정자 세포를 공급 하 고 demembranate 정자 세포를 5 분 동안 실 온에서 품 어.
    7. Demembranated 정자 DNA 3 %BSA 솔루션 감기 일의 10 mL로 세 번 세척.
    8. DNA는 hemocytometer와 정자의 밀도 측정 합니다.
    9. 액체 질소에 5 µ L aliquots에 정자 DNA를 동결 하 고-80 ° c.에 저장 정자 DNA의 최적 농도 약 105 핵 / µ L.
  3. GFP 핵 지 방화 신호 (NLS GFP)의 단백질 정화
    1. BL21 GST 태그 GFP NLS 플라스 미드를 변환 (DE3) 유능한 대장균 세포5.
    2. 1 시간 동안 37 ° C에서 항생제 없이 셀을 품 어 하 고 있는 파운드 agarose 판 100 µ g/mL 암 피 실린에 확산.
    3. 셀 단일 식민지로 성장 14 ~ 18 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품 어. 선택 하 고 단일 식민지 파운드 미디어 100 µ g/mL 암 피 실린의 4 mL에 접종. 12 시간 동안 37 ° C에서 세포를 흔들어.
    4. 압력가 YT 미디어 (Bacto tryptone의 16 g, Bacto-효 모 추출 물, NaCl의 5 g의 10 g)를 준비 하 고 37 ° c YT 미디어 열
    5. 100 µ g/mL 암 피 실린 preheated YT 미디어의 250 mL에 파운드 미디어에서 하룻밤 incubated 셀의 1 mL를 접종 하 고 셀 밀도 높이기 위해 2 시간 동안 흔들어.
    6. 측정 셀 광학 밀도 (OD) 30 분 마다 600의 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm. 0.1 m m IPTG OD 값에 도달 하면 0.1 GFP NLS 단백질 발현을 유도 하는 셀에 추가 합니다.
    7. 18 ° C 하룻밤 세포 성장 율을 더 나은 단백질 식 및 합성에서 세포를 흔들어.
    8. 5 분 동안 4 ° C에서 34,524 x g에서 셀 아래로 회전 시키십시오 고 상쾌한을 제거 합니다.
    9. 셀 펠 릿 40 ml PBS 버퍼 (50 mg/mL lysozyme의 800 µ L, leupeptin, pepstatin, 및 chymostatin, 10mg/mL 혼합의 13.2 µ L PMSF 0.2 M, 0.5 M EDTA의 8 µ L의 100 µ L 함께 제공 됨)의 resuspend와 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.
    10. 휴식 4 x 30 20 kHz의 주파수는 sonicator를 사용 하 여 셀 아래로 출시 각 쥡니다 사이 30 s 간격으로 s GFP NLS 단백질 표현.
    11. 깨진된 세포를 제거 하는 35 분 20000 x g에서 회전 합니다.
    12. 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 추출 하 여 GFP NLS 단백질 정화.
    13. 1.5 mL 비드 슬러리 PBS 버퍼의 15 mL로 세 번 세척 하 고 반전 4 ° C에서 4 시간 동안 구슬 lysate의 250 mL를 품 어.
    14. 5 분 x g 2000에서 구슬 아래로 회전 시키십시오 고 구슬에 세척 솔루션 (25mm Tris 기본, pH 7.5, 500 mM NaCl, 그리고 5 mM DTT) 10 mL를 추가 합니다. 차입 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 8.8, 20 m m 감소 티, 그리고 5mm DTT) 4 ° c.에 회전의 700 µ L에서 구슬을 품 어 50 µ L의 양으로 차입의 약 수를 수집 합니다.
    15. Coomassie 파란 젤28을 실행 하 여 수집 된 단백질의 농도 측정 합니다.
    16. 버퍼 교환을 통해 스토리지 버퍼 (20 mM HEPES, 150 m m KCl, 10% 글리세롤, pH 7.7) 3 mL와 PD-10 열을 사용 하 여 단백질 elute

2. 준비 Xenopus 사이클링의 추출

참고: 추출 준비의 전반적인 절차 그림 1A에서 보여 줍니다. 머 레이 19911에서 적응.

  1. 10 일 전에 알 66 IU 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)와 3 성숙 여성 Xenopus laevis 을 주사.
  2. 18 시간 추출 물 순환의 준비 전에 누워 계란을 유도 하기 위해 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (HCG)의 500 IU와 이러한 Xenopus 개구리를 주사.
  3. 밤새 누워 계란을 삭제 합니다. 실험 (데이터 표시 되지 않음)에 따라, 갓된 알에서 준비 된 추출 물 같은 여성 개구리에서 누워 계란에서 준비 된 추출 물 보다 더 긴 지속 활동을 생성 합니다. 각 여성 개구리의 알을 쥐 어 짜기 100 mm 페 트리 요리 0.2 x MMR 버퍼의 10 mL로 하 고 스테레오 현미경 검사.
  4. 동물과 식물성 극 사이의 불분명 한 경계 또는 동물 기둥 위에 불규칙 한 흰 반점이 계란의 일괄 처리를 삭제 합니다.
  5. 명확 하 게 차별화 된 동물과 식물성 폴란드와 계란의 균질 인구를 제시 하는 한 여성 개구리에서 계란의 배치를 선택 하 고 600 mL 비 커에 계란을 전송.
  6. 초과 0.2 x MMR 버퍼에 밖으로 부 어 하 고 부드럽게 추가 250 mL 100 mL 당 2g의 시스테인 (pH 7.7) 1 x 추출 버퍼 (100 m m KCl, 0.1 m m CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50mm 자당, pH 7.7) 계란.
  7. 손으로 계란을 적극적으로 악수 하 고 계란 시스테인의 800 mL의 총 볼륨 3 세척 3 분 또는 계란 집계까지 버퍼와 젤리 코트 제거 성공을 나타내는 비 커의 하단에 정착의 젤리 코트를 제거 합니다.
  8. 워시 계란 0.2 x MMR 솔루션의 1 리터와 4 시간 이상.
  9. 선택 하 고 흰색 유리 전송 피 펫을 사용 하 여 설정 하는 계란을 삭제.
  10. MMR 버퍼에 밖으로 부 어와 0.1 µ g/mL 칼슘 ionophore 활성화를 위한 0.2 x MMR 버퍼에 A23187 솔루션의 200 mL와 함께 계란을 공급.
  11. 유리 피 펫의 넓은 개방 면을 사용 하 여 부드럽게 계란 활성화 되 고 칼슘 ionophore 솔루션을 제거할 때까지 계란을 저 어 줍니다.
  12. 계란 비 커의 하단에 정착 후 활성화 효율성을 확인 하십시오. 잘 활성화 된 알 약 25%는 동물 극과 식물성 극의 75%의.
  13. 두 번 추출 버퍼 protease 억제제 (10 µ g/mL 각 leupeptin, pepstatin, 및 chymostatin)와 보충 x 1의 50 mL와 함께 활성화 된 계란 세척.
  14. 계란 0.4 mL 스냅 캡 microtube 신중 하 게 전송 하 고 다음 600 x g 30 초 60 초 동안 200 x g에서 원심 분리를 통해 달걀 팩.
  15. 계란을 추출의 희석을 줄이기 위해 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 위에 여분의 버퍼를 제거 합니다.
  16. 4 ° c.에서 10 분 동안 15000 x g에 계란을 분쇄
  17. 짓 눌린된 달걀의 3 개의 층을 분리 하 고 중간 계층에서 원유 세포질을 유지 하는 면도날으로 튜브를 잘라.
  18. 새로운 ultracentrifuge 튜브, 원유 세포질을 전송 하 고 protease 억제제와 cytochalasin B 10의 µ g/mL 각 보충.
  19. 다시 더 세포질 노른자위 초과 지질을 제거 하 여 정화를 5 분간 4 ° C에서 15000 x g에서 원유 세포질 원심
  20. 계속 갓 준비 얼음에 추출 합니다.

3. 물방울 생성

  1. 2D 유리 챔버 준비
    참고: 사각형 유리 튜브 챔버 쉽게 관찰 및 데이터 수집에 대 한 수 있도록 하나의 2 차원 평면에서 방울을 제한 하는 역할을 합니다.
    1. 잘라 2 m m x 100 µ m의 내부 차원 가진 직사각형 유리 튜브 4mm 긴 조각. 숫 돌의 날카로운 가장자리를 사용 하 여, 빛 조각으로 유리 튜브의 외부 표면에 원하는 경계 표시 다음 부드럽게 유리 튜브의 조각 끊다 에칭의 양쪽에 압력을 적용 합니다.
    2. 95 ° c.에 건조 목욕 인큐베이터가 열 사전 열 블록을 꺼내와 폴 리카 보 네이트 진공 desiccator에 배치.
    3. Trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 난방 블록에서의 30 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 배치 합니다. 열 블록을 약 5 cm에서 진공 desiccator 내부 컷 유리 튜브를 하다.
    4. 진공 펌프는 desiccator를 연결 합니다. 원하는 진공 수준에 도달 하는 1 분 동안 펌프를 켭니다 다음 유리 튜브의 내부 벽 코트 trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 란 증기 하는 desiccator 인감 3 방향 밸브를 닫습니다. 이 방울을 안정화에 대 한 소수 성 환경을 만들 것입니다.
    5. 하룻밤 코팅 desiccator 내부 유리 튜브를 둡니다. 튜브 사용 다음 날을 위해 준비 될 것입니다.
  2. 작은 물방울 생성 및 이미징
    참고: 작은 물방울을 생성 하 고 이미징 절차는 그림 1B 및 1 c.에서 설명
    1. 10 ng / µ L을 2 단계에서 준비 된 추출 물 공급 securin mCherry mRNA 간단한 세포질 전용 세포 주기 실험에 대 한. 또는, demembranated 정자 염색 질 (추출의 µ L 당 250)와 전원 추출, 10 µ M GFP NLS 단백질, 그리고 10 ng / µ L securin mCherry mRNA 정기적인 핵 형태학을 전시 하는 작은 물방울을 만들을 변경 합니다.
    2. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 추출의 믹스 20 µ L 재조합 단백질 이나 mRNA와 함께 제공 2 %perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜의 200 µ L (PFPE-PEG) fluorosurfactant HFE7500 불 기름에.
    3. 와 동 믹서를 사용 하 여 방울을 생성 합니다. 방울 크기의 범위 소용돌이 속도 및 기간에 의해 변조 될 수 있습니다. 만들 방울 반지름 50에서 200 µ m에 이르기까지, 56 x g (4.9 m m의 반경으로 3200 rpm)에서 소용돌이 속도 설정 하 고 부드럽게 눌러 추출 포함 하는 microcentrifuge 튜브 및 계면 활성 제 혼합물 믹서에 3.5 초에 대 한. 시각적으로 작은 물방울은 크기가 균일 경우 검사 합니다.
    4. 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 PCR 관으로 가기 고 PFPE 못 계면의 동일한 볼륨에 떠 있는 물방울을 전송. 유리 튜브 1.5 mL microcentrifuge와 대기 물방울 레이어로 단계에서 준비 하는 방울 튜브의 약 75% 가득 튜브 완전히 채워집니다 때까지 계면 활성 제 층으로 튜브를 밀어 때까지 찍어. 드롭릿 밀도 낮은과 밀로 인 한 중복 또는 모양 왜곡 없이 챔버 내부에 한 층을 형성 방울 허용 됩니다.
    5. 미네랄 오일 40 m m의 직경을 가진 유리 하단 접시를 채우십시오. 부드럽게 좋은 트위터를 사용 하 여 내려 그들을 추진 하 여 오일에서 방울 채워진 튜브를 담가.
    6. 후 모든 샘플, 유리를 사용 하 여 표시 모든 파편을 제거 하는 플라스틱 또는 방울을 유출. 더 많은 미네랄 오일 추가 튜브 또는 이미징 프로세스에 완전히 몰입 될 것입니다.
    7. 자동화 한 x-y 무대를 갖춘 epifluorescence 현미경에 방울의 이미지를 실시 ( 재료의 표참조). 4 X 어 목표를 사용 하 여 모든 이미지에 대 한. 형광 이미징, 형광 조명, 광원 및 GFP 필터 (여기 482/35 nm 및 방출 514/LP nm)를 설정 하 고 mCherry 필터 (여기 562/40 nm 및 방출 641/75 nm) 이미징 130 W 수은 증기 짧은 아크 램프를 사용 GFP NLS 및 securin mCherry 신호입니다.
    8. 밝은 분야 및 여러 형광 채널 방울 그들의 활동을 잃을 때까지 6-9 분 마다 기록 시간 경과 비디오.

4. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석

  1. 세분화와 방울의 추적
    1. 이미지 분석 소프트웨어 ".tif" 또는 ".oif"의 형식으로 기록된 데이터를 가져오기 ( 재료의 표참조).
    2. 밝은 필드 채널을 사용 하 여 단일 방울 세그먼트. 밝은 분야 이미지 어두운 경계와 밝은 원으로 물방울 표시 됩니다. 이미지에 임계 처리를 적용 합니다. 각 표면 해당 물방울의 전체 면적을 어둡고 밝은 픽셀 사이의 임계값을 조정 하 여 추적 표면 각 방울을 추가 합니다.
    3. 자동으로 자동 회귀 모션 알고리즘을 사용 하 여 인접 프레임 사이의 세그먼트를 추적 합니다. 정확 하 게 추적 하는 작은 작은 물방울을 대부분 방울의 반지름 보다 작아야 두 인접 프레임 사이 작은 물방울의 허용 최대 여행 거리를 조정 합니다.
    4. 시각적으로 모든 잘못 된 세그먼트를 검색 하는 전체 비디오 세그먼트 빈 공간 간의 추적 대신 실제 방울 방울을 확인 합니다. 수동으로 잘못 된 트랙을 삭제 합니다.
    5. 배경 형광 강도를 한 방울 없이 세그먼트 및 트랙 배경 영역입니다. 신호 노이즈를 개선 하기 위해, 각 시간 프레임에서 물방울의 형광 강도에서 배경 강도를 뺍니다.
    6. 시간이 지나면서, 평균 및 표준 편차 형광 강도 및 드롭릿 지역을 포함 하 여 ".csv" 파일로 각 트랙에 대 한 측정 된 매개 변수를 내보냅니다.
  2. 방울 크기와 진동의 데이터 분석
    1. 각 작은 물방울에 대 한 시간이 지나면서 형광 강도 플롯 하려면 R로 ".csv" 파일을 로드 합니다. ".Csv" 파일로 기록 방울 ID입니다.
    2. Matlab으로 분석 소프트웨어와 방울 ID의 목록이 ".csv" 파일에서 내보낸 ".csv" 파일을 가져올 하 고 추가 데이터 분석을 위해 ".mat" 파일로 저장 합니다.
    3. 세분화와 유리의 높이 챔버19후 내보낸된 드롭릿 지역 정보에 따라 압축 된 물방울의 볼륨을 계산 합니다. 볼륨을 사용 하 여 구체로 작은 물방울의 반지름을 계산.
    4. 시간 지점의 봉우리와 골짜기 피크/물마루 탐지 알고리즘을 사용 하 여 압축을 풉니다. 봉우리와 골짜기 그들은 정확 하 게 감지 되도록의 위치에 수동 수정 수행 합니다.
    5. 세포 주기 기간을 계산 하기 위해 두 개의 인접 한 봉우리 사이의 간격 시간을 계산 합니다. 그것의 세포 주기 기간으로 각 방울에 대 한 모든 간격의 평균을 가져가 라.

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결과

그림 2, 우리는이 프로토콜 모두 간단 하 고, 핵 없는 세포로 핵, 복잡 한 셀 어디 발진기 핵 형성과 변형의 주기적 교체 드라이브 mitotic 진동 생산 표시 됩니다. 핵 없는 물방울 생성 mitotic 진동 최대 30 undamped 사이클에 92 시간의 기간 동안 정기적인 합성 한 형광 기자 securin-mCherry (그림 2A)의 저하에 의해 표시 된 대로. 복잡 한 APC/c. 홍보 anaphase의 기판은 securin Anaphase 동안 securin mCherry의 저하는 따라서 APC/c.의 활동을 나타냅니다.

다운스트림 mitotic 이벤트를 mitotic 발진기의 능력 검사, 우리 또한 공급 demembranated 정자 염색 질...

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토론

우리는 그 수에 체 외 재구성 및 단일 세포 수준에서 자체 지속적인된 세포 주기 진동의 장기 추적 높은 처리량 인공 세포 시스템을 개발 하기 위한 새로운 방법을 제시 했습니다. 이 메서드를 성공 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 좋은 품질을 가진 첫 번째, 갓 Xenopus 달걀 누워 계란에 비해, 오래 지속 진동 활동 추출 물을 생산 하는 경향이 있다. 둘째, 계면 안정화 microenvironments에서 추출 물 캡슐은 진동 활동을 유지 하기 위해 중요 합니다. 얇은 튜브 굴레 쉽게 이미지 프로세싱 및 장기 추적을 위한 단일 레이어 내에서 물방울에 기름 방울의 세 번째, 보육 넷째, 낮은 표면 에너지를 반대로 접착제로 trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 란과 튜브 내벽을 코팅 추출 활동을 유지 도움이 됩니다. 다섯째, 오일 튜브 씰링 방울 흐름을 방지할 것. 오일 밀봉 방법 또한 증발을 방지 하 고 더 추출 활동을 보존 수 있습니...

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공개 사항

공개 하는 것이 없다.

감사의 글

우리 감사 마들렌 루 securin mCherry 플라스 미드, 무릎 남자 리, 케네스 호 및 물방울 생성에 대 한 토론을 위한 알 렌 P Liu, 제레미 B. 장과 제임스 E. Ferrell Jr GFP NLS 구성 제공 하기 위한 건설. 이 작품은 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다 (이른 경력 그랜트 #1553031), 건강의 국가 학회 (미 라 #GM119688), 및 슬론 연구 장학금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Xenopus laevis 개구리Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kitQIAGEN27104
QIAquick PCR Purification Kit (250)QIAGEN28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription KitAmbionAM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cellSigma-AldrichB2935
칼슘 이오노포어Sigma-AldrichA23187
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261독성
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PD-10 열Sigma-AldrichGE17-0851-01
VitroCom 소형 중공 유리관VitroCom5012
올림푸스 SZ61 스테레오 현미경올림푸스 올림푸
IX83 현미경올림푸스 올림푸
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NanoDrop 분광 광도계ThermofisherND-2000
0.4 mL 스냅 캡 마이크로튜브E& K Scientific485050-B
PureLink RNA 미니 키트ThermoFisher(Ambion)12183018A
Fisherbrand 아날로그 와류 믹서Fisher Scientific2215365
ImarisBitplane버전 7.3이미지 분석 소프트웨어
스 스

참고문헌

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