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방법 논문

감기 응답 MicroRNAs의 연구에 대 한 호모-그리고 수 박 및 호리병박 사이 Heterografts를 생성

7.2K 조회수

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DOI:

10.3791/58242

⸱

2018년 11월 20일

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1Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 2State Key Lab Breeding Base for Sustainable Control of Plant Pest and Disease, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 4Shanghai Biozeron Biotechnology Co., Ltd

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기 우리는 효율적으로 만들기 위한 호모-수 박, 병 조롱 박, 감기 응답 microRNAs의 조사에 대 한 조직 샘플링, 데이터 생성 및 데이터 분석의 방법 이외에 사이 heterografts 상세한 프로토콜을 제시.

초록

MicroRNAs (miRNAs)는 작은 비 코딩 RNAs의 약 20-24 생 nt, 알려진 식물 개발 및 적응에 중요 한 역할을. 보여주는 특정 miRNAs의 식을 접목 때 변경 되는 축적 증거는 biotic 및 abiotic 스트레스에 작물 허용 오차를 개선 하기 위해 농부에 의해 일반적으로 사용 하는 농업 연습. 호리병박은 많은 다른 주요 cucurbits, 수 박 등, 하나는 후자에 대 한 가장 널리 사용 되 감지의 렌더링에 비해 본질적으로 기후 탄력 자르기. 높은 처리량 시퀀싱 기술의 최근 발전 감기 응답 miRNAs와 heterograft 장점;에 그들의 기여를 조사 하기 위해 좋은 기회를 제공 하고있다 그러나, 적절 한 실험 절차는이 목적에 대 한 필수. 여기, 우리는 효율적으로 호모-및 감기 취약 수 박과 조직 샘플링, 데이터 생성 및 데이터 분석의 방법 이외에 감기 허용 호리병박 사이 heterografts를 생성 하기 위한 상세한 프로토콜을 제시. 제시 메서드는 또한 다른 식물 이식 시스템가 열, 가뭄, 염 분 등 다양 한 환경 스트레스에 따른 miRNA 규정에 대 한 유용 합니다.

서론

접목은 오래 고용 농업 기술로 개선 작물 생산 그리고 공차 biotic 및 abiotic 스트레스1,2,3. Heterografting 시스템에서 엘리트 감지 수 있습니다 식물의 물과 양분 통풍 관을 강화, 강화 토양 병원 균에 저항 하 고 금속 독성4,5,이 이식 된 향상 된 부여 수 있습니다 부정적인 영향을 제한 성장 활력 그리고 환경 스트레스를 증가 허용입니다. 대부분의 경우에서 heterografting 수 있습니다 또한 과일 자질 향상 된 과일 맛과 건강 관련 화합물6,7의 증가 콘텐츠를 선도 하는 원 예 식물에 영향을. Scion는 rootstock 사이 phytohormones, RNAs, 펩 티 드, 단백질의 장거리 전송 성장과 개발 프로그래밍 scion 식물8,9의 변조 하는 근본적인 메커니즘입니다 발견 되었습니다. ,10. 접목 장거리 신호 및 교통 환경 적응11관련의 연구에 널리 사용 되어 있다. 이식 실험은 조직 또는 혈관 수액, 그리고 활성화 또는 억제 신호 전송12인 분자 대상에 전송 된 분자의 명백한 탐지를 위해 특히 강력 합니다.

비 코딩 RNAs, 셀에 규정 하는 중요 한 기능을 발휘 하는 RNA의 큰 클래스 abiotic 스트레스13식물 적응을 촉진 역할을 보고 되었습니다. miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs의 약 20-24 생 nt. 연구 miRNAs 식물 활동의 다양 한 측면에서의 규제 역할을 계시 했다, 같은 성장, 쏠로 루트 형성14,,1516, 측면 양분 통풍 관, 황산 물질 대사 그리고 항상성17및 응답 biotic 및 abiotic 스트레스18. 최근, miRNAs와 그들의 타겟 유전자의 표현은 heterografted 오이 모 종19허용 오차 스트레스를 소금에 관련 되었다. 포도의 intervariety 이식에서 miRNA 식 가뭄 스트레스의 응답 유전자 형 종속20을 발견 했다.

신속한 개발 및 높은 처리량 시퀀싱 기술의 비용 감소 농경 식물에서 miRNA 규정의 연구에 대 한 좋은 기회를 제공. 수 박 (Citrullus lanatus [Thunb] Mansf.), 세계에 걸쳐, 재배 하는 중요 한 cucurbit 작물 저온 쉽습니다. 호리병박 (Lagenaria의 siceraria [몰리 나] Standl.) 기후 탄력 cucurbit 수 박으로 이식 하 농부에 의해 일반적으로 사용 되는. 현재 연구의 기본 목표는 표준, 효율적인, 그리고 수 박 (Citrullus lanatus [Thunb] 사이 heterografts를 만들기 위한 편리한 방법 설정 Mansf입니다.) 그리고 병 조롱 박 (Lagenaria의 siceraria [몰리 나] Standl). 이 프로토콜 또한 제공 한다 상세한 실험 계획 및 분석 절차 미르 식 접목, 다음의 규칙의 연구는 heterografting 장점 기본 메커니즘을 공개 하는 데 유용.

이 연구에 사용 된 식물 재료 수 박 품종 및 호리병박 landrace 포함 됩니다. 수 박 품종은 낮은 온도에 취약 하지만 높은 수확량을 가진 상업 품종이 이다. 호리병박 landrace 접목 수 박, 오이와 병 조롱 박, 낮은 온도21의 우수한 관용 때문에 인기 있는 rootstock입니다.

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프로토콜

1. 살 균 및 발 아 씨앗

  1. 표면 살 균, 병 조롱 박 씨앗 가끔 교 반, 물 온도 40 ° c.에 떨어질 때까지 58 ° C에 물으로 채워진 500 mL 비 커에 담가
  2. 한편, 나일론 가방 그리고, 소독, 토 탄 토양의 3 kg을 넣어 압력솥 120에서 ° C/0.5 MPa 20 분.
  3. 4-5 시간 더 없는 감동 병 조롱 박 씨앗을 몸을 담글 유지.
    1. 물에는 실내 온도 도달 하면, x-증류수와 함께 3 x 2 씨앗을 씻어.
    2. 과잉의 물을 배수 하 고 어둠 속에서 성장 챔버에 28 ° C에서 거 즈 가방에 새싹 씨앗을 허용.
    3. 발 아, 후 소독된이 탄 토양으로 채워진 플라스틱 냄비 (지름에서 6cm)에 씨앗을 뿌린.
  4. 때 병 조롱 박 묘 두 병합된 cotyledons 개발, 단계 1.1-1.3 수 박 씨앗을 반복 합니다.
    참고:이 시간 관리 접 순과 rootstock의 크기 잘 성공적인 접목에 대 한 일치를 보장 합니다.

2. 묘 종 성장과 접목

  1. 온도 28 ° C (빛) 낮에 밤 동안 22 ° C에서 (어두운)로 유지 16 h 라이트 /8-h 어두운 주기와 성장 챔버에 묘 목 성장. 늦은 오후에 하루 x 물 1을 추가 하 여 묘를 관개.
  2. 사용 컷 접목 방법22 heterografts 때 병 조롱 박 (rootstock)의 모 종 한 진정한 잎 단계에서 수 박 (scion)의 cotyledons (아직 평평) 등장.
    1. Cotyledons, 아래 2-3 cm에서 수 박 모 종 hypocotyls 고 바로 진정한 위에 사이트에서 병 조롱 박 묘 위에 나뭇잎.
    2. 이쑤시개를 사용 하 여 트림된 병 조롱 박 묘 상단에 구멍을 만들기 위하여. 트림된 수 박 모 종 heterografts 수 있도록 병 조롱 박 묘 목 구멍에 삽입 합니다.
  3. 사용 유사한 방법 단계 2.2에서에서 제시 하는으로 homografts.
    참고: 호모-및 heterografting 조합 항상 여야 한다 동시에 (그림 1),이 경우에, 다음에서 결과: (WB, heterograft) 수 박/병 조롱 박, 수 박/수 박 (WW, homograft) 및 호리병박 /bottle 조롱 박 (BB, homograft)

figure-protocol-1
그림 1: 이식 조합 및 융합 하였습니다 공장 구조 그림. WB = 수 박/병 조롱 박 heterografting; WW = 수 박/수 박 homografting; Bb 탄 = 병 조롱 박/병 조롱 박 호모-접목; WB-S = 수 박/병 조롱 박 heterografts 샘플링 된;의 접 순 잎 WB-R = 샘플링 된 수 박/병 조롱 박 heterografts의 rootstock 나뭇잎. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 관리, 감기 치료, postgrafting 및 샘플링

  1. 상대적으로 높은 습도 유지 하 고 7 d 16 h 빛/8-h 어두운 주기, 낮 (빛) 28 ° C에 온도 유지 하 동안 22 ° C에서의 환경 조건 하에서 그들을 유지 하는 것을 투명 한 폴 리 에틸렌 가방 이식할된 묘 enwrap는 밤 (어둠)입니다.
  2. 7 일에 투명 한 폴 리 에틸렌 봉투를 발견. 식물 성장 추가 7-10 일 같은 조건에 대 한 하자.
  3. 두 그룹 (스트레스) 감기 치료를 위해, 하나 컨트롤 (비-스트레스)으로 건강 한 균일 한 묘를 나눕니다. 컨트롤 그룹에 대 한 냉 스트레스 그룹에는 추가 48 h에 대 한 (28 ° C)에서 동일한 성장 챔버에 묘를 두고, 단계에서 설명한 대로 명암 조건 6 ° C에서 일정 한 온도와 성장 챔버에 묘를 전송 2.1입니다.
  4. 이식 (그림 1)에서 scion는 rootstock의 잎을 샘플. 액체 질소에는 샘플을 즉시 고정 하 고 사용까지-70 ° C에서 그들을 저장 합니다.

4. 라이브러리 준비 및 높 처리량 연속

  1. 액체 질소에서 2 mL microcentrifuge 튜브를 냉동된 샘플을 전송 합니다.
  2. 조직을 포함 하는 각 관에 스테인리스 스틸 비드 (지름 5 m m)를 추가 합니다.
  3. 30 대 한 비드 밀 균질 화기를 사용 하 여 정밀한 분말을 조직 균질 s.
  4. 각 이식 조합에 대 한 동일 금액 (0.1 g) 10 묘에서 지상 샘플의 고 10 mL 원심 분리기 튜브에서 그들을 믹스. Guanidium 염 산 염 시 약 (자료 테이블) 조직 무게에 해당 하는 제조 업체의 제안에 따라의 적절 한 금액을 추가 합니다.
    1. RNA-무료 DNase를 추가 하 여 게놈 DNA 오염 제거 나 1 시간 동안 37 ° C에서 150 U/mL.
  5. 결정 총 RNA 무결성을 보장 하기 위해 microcapillary 전기 시스템에 RNA 양 번호 > 7.0.
    참고: 린 > 7.0 RNA 샘플의 높은 무결성 보장.
  6. 제조업체의 지침에 따라 상업 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 작은 RNA 라이브러리를 준비 합니다. 샘플 당 총 RNA의 1 µ g를 사용 하 여 시작 하.
    1. 해 동 라이브러리 정규화 시 약 그리고 어댑터 제조업체의 지침에 따라. 5 '과 3 ' 어댑터와 작은 RNAs를 위하여 elute 하 고 그들을 정화. 리버스는 5 '를 녹음 하는 다음, 3' 제조업체의 지침에 따라 작은 RNAs 출혈 및.
    2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 PCR 증폭을 수행 합니다. Microcapillary 전기 시스템을 사용 하 여 cDNA 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다.
    3. 여 린 수 있도록 microcapillary 전기 시스템에는 RNA 라이브러리의 1 µ L 로드 > 7.0.
  7. 23설명 되어 있는 대로 높은 처리량 시퀀싱 악기에 작은 RNA 라이브러리 순서.

5. miRNA와 표적 유전자 예측

  1. 각 이식 조합에 대 한 가난한 품질 시퀀스를 제거 하 고 원시 읽기에서 어댑터 시퀀스 트림 UEA 요 스르나. 워크 벤치 2.4 공장 버전24 오픈 소스를 사용 합니다. 18 보다 작은 시퀀스를 삭제 nt 32 보다 크거나 nt.
  2. 오픈 소스 Rfam 11.0 데이터베이스 인식 하 고 읽기 rRNA, tRNA, snoRNA, 및 다른 snRNAs의 제거에 높은-품질 "깨끗 한" 시퀀스를 비교 합니다.
  3. 나머지 읽기25짧은 읽기 시퀀스 정렬 도구 사용 하 여 참조 게놈을 맞춥니다. 이 단계에서 아무 불일치 허용 됩니다.
    참고: 수 박 "97103" 게놈 어셈블리 V126 , 접 순에서 읽기 정렬에 사용 된 및 호리병박 "HZ" 게놈 어셈블리 V127 는 rootstock에서 읽기 위해 사용 되었다.
  4. 오픈 소스 miRBase 22.028에 알려진된 성숙한 miRNAs에 대 한 나머지 읽기를 비교 합니다. 알려진된 miRNAs에 동종 읽기 보존된 miRNAs로 분류 됩니다.
  5. 알려진된 miRNA 선구자 게놈 시퀀스와 일치 하도록 실패 하는 시퀀스를 비교 합니다. MIREAP29 알고리즘을 사용 하 여 기본 설정에서 잠재적인 소설 miRNAs 감지.

6. 차동 식 및 유전자 온톨로지 분석

  1. 그들의 읽기 카운트에 따라 miRNAs의 식 수준을 비교 합니다. miRNAs는 P-값 (피셔의 정확한 시험) < 0.05와는 절대 로그2 값 > 2 차동 표현 될 것으로 간주 됩니다.
  2. 기본 매개 변수에서 차동 표현된 miRNAs에 잠재적인 상호 보완적인 mRNAs (미르 대상 유전자)를 예측 하는 센스 oligonucleotide 대상 사이트 선택 도구 (TargetFinder)30 을 사용 합니다.
  3. 유전자 존재론을 사용 하 여 (가) 미르 대상 유전자 존재론 (이동)을 농축 분석 도구31 P아래 패턴-통계적 의미에 대 한 0.05의 값을 임계값.

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결과

figure-results-1
그림 2: 실내 온도 및 감기 스트레스 조건에서 다양 한 이식의 고기. (한)이이 패널이 보여줍니다 호모-및 heterografted 묘 실 온에서 제어. (b)이이 패널 호모-및 heterografted 묘 목 감기 치료의 48 h 후에 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

설명한 방법을 사용 하 여, 우리가 획득 접목에 대 한 98...

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토론

이 프로토콜에서 우리 자세히 호모-고 수 박 및 호리병박 사이 heterografts 고 재현 방법 설명. 필요한 특정 장비,이 방법은 매우 운영 하 게 쉬운 이며 일반적으로 접목의 매우 높은 생존 율을가지고. 메서드 또한 수 박, 오이, 호박 사이 다른 cucurbits에 대 한 이식을 만들기 위해 사용할 수 있습니다.

그것은 rootstock 및 접 순의 상대적 크기 (나이)은 성공적인 이식 ( 프로토콜의 단계 2.2)를 만들기 위해 중요 한 지적 가치가 있다. 우리는, 사용 rootstock scion에 비해 너무 큰 했다, 이식 연합 있었다면 양식에 더 어려운 scion의 줄기는 다소 빈 때문에 관찰. 우리의 이전 proteomic 데이터31에 따라, 컨트롤로 자동 이식할된 접 순 및 자체 이식할된 rootstock의 포함이 좋습니다 ( 프로토콜의 단계 2.3)에 게, ...

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공개 사항

저자는 공개 없다. 작은 RNA 시퀀싱 데이터 취득 번호 SRP136842에서 은행에 입금 됩니다.

감사의 글

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (31772191), 강성 (2017 C 32027) 공익에 대 한 연구 프로젝트, 키 과학 프로젝트의 식물 Breeding 절 (2016 C 02051)에서 및을 위한 국가 프로그램에 의해 지원 되었다 최고 수준의 젊은 전문가 (P.X.)의 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
TRIzol 시약Invitrogen15596026
RNA-free DNase ITakaraD2270A
Truseq Small RNA sample prep KitIlluminaRS-200-0012
2100 BionalyserAgilent5067
DNA PolymeraseThermo Fisher ScientificF530S
UEA sRNA 워크벤치 2.4-plant 버전  (소프트웨어)NANAhttp://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/
Rfam 11.0 데이터베이스 ( 웹사이트)NANA http://rfam.janelia.org
miRBase 22.0 ( 웹사이트)NANA http://www.mirbase.org/
MIREAP(소프트웨어)NANA https://sourceforge.net/projects/mireap/
TargetFinder ( 소프트웨어)NANAhttp://targetfinder.org/

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