Method Article

단일 금속 나노 입자의 고분해능 물리적 특성화

DOI:

10.3791/58257

⸱

June 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Physical Measurement Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemical Engineering, Columbia University, 3Department of Applied Physics and Applied Math, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 생물학적 나노기공 기반 전자 플랫폼을 사용하여 단일 분자 한계에서 이산 금속 산소 클러스터, 폴리옥소메탈레이트(POMs)를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 이러한 분자의 연구에 사용되는 전통적인 분석 화학 도구에 대한 보완적인 접근법을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

개별 분자는 단일 나노미터 규모의 기공을 통해 흐르는 이온 전류를 감소시키는 정도를 측정하여 검출및 특징화될 수 있다. 신호는 분자의 물리 화학적 특성과 기공과의 상호 작용의 특징입니다. 우리는 세균성 단백질 외독신 황색포도상 황색포도상 혈우병 알파 헤몰리신(αHL)에 의해 형성된 나노기공이 단일 분자 한계에서 폴리옥소금속류(POMs, 음이온 금속 산소 클러스터)를 검출할 수 있음을 입증한다. 또한, 용액내 12-인산화산 POM(PTA, H3 PW12O40)의다중 분해 제품을 동시에 측정한다. 나노 기공 방법의 단일 분자 감도는 POMs가 핵 자기 공명 (NMR) 분광학에 필요한 것보다 훨씬 낮은 농도로 특징 지어질 수 있게 합니다. 이 기술은 화학자가 polyoxometalates 또는 다른 금속 클러스터의 분자 특성을 연구하고 POM 합성 공정을 더 잘 이해하고 수율을 향상시키는 새로운 도구역할을 할 수 있습니다. 가설적으로, 주어진 원자의 위치, 또는 분자 내의 단편의 회전, 및 금속 산화 상태는 이 방법으로 조사될 수 있었다. 또한, 이 새로운 기술은 용액내의 분자의 실시간 모니터링을 허용하는 장점이 있다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단일 분자 수준에서 생체 분자 분석을 검출하는 것은 나노 기공을 사용하고 이온 전류 변조를 측정하여 수행 할 수 있습니다. 전형적으로, 나노 기공은 그들의 제조에 따라 2개의 종류로 나뉩니다:생물학 (단백질 또는 DNA 종이접기에서 각자 조립된) 1,2,3,또는 고체 상태 (예를들어,제조된 반도체 처리도구) 4,5. 고체 나노 기공은 잠재적으로 물리적으로 더 견고하고 다양한 솔루션 조건에서 사용될 수 있지만, 지금까지 단백질 나노 기공은 더 큰 감도, 더 큰 대역폭, 더 나은 화학 물질을 제공합니다. 선택성, 그리고 더 큰 신호 대 잡음 비.

황색포도상구균α-헤몰리신(αHL)에 의해 형성된 것과 같은 다양한 단백질 이온 채널은 이온(예를들어,H+및 D+)을 포함한단일 분자를 검출하는데 사용될 수 있으며,2,3,폴리뉴클레오티드(DNA) 및 RNA)6,7,8,손상된 DNA9,폴리펩타이드10,단백질 (접혀 전개)11,폴리머 (폴리에틸렌 글리콜 등)12,13 , 14,금 나노 입자15,16,17,18,19,및 기타 합성 분자20.

우리는 최근에 αHL 나노 기공또한 쉽게 검출하고 단일 분자 수준에서 금속 클러스터, 폴리 옥소 금속 (POMs)을 특성화 할 수 있음을 입증했다. POMs는 182621에서발견된 이산 나노 스케일 이온 금속 산소 클러스터이며, 그 이후로 더 많은 유형이 합성되었습니다. 현재 이용 가능한 폴리옥소금속의 다양한 크기, 구조 및 원소 조성물은 화학22,23,촉매24,재료 과학 25를 포함한 다양한 특성 및 응용 분야로 이어졌습니다. ,26, 및 생물 의학 연구27,28,29.

POM 합성은 일반적으로 단모금속 염의 증식iometric에 필요한 양을 혼합하여 물에서 수행되는 자가 조립 공정이다. 일단 형성되면, POM은 크기와 모양의 큰 다양성을 전시한다. 예를 들어, 케긴 폴리아니온 구조, XM12O40q-는 4개의 산소로 둘러싸인 하나의 이종(X)으로 구성되어 사각체를 형성한다(q는 전하). 이종은 12 개의 팔수hedral MO6 단위 (M = 높은 산화 상태에서 전이 금속)에 의해 형성 된 케이지 내에 중앙에 위치하며, 이는 인접한 공유 산소 원자에 의해 서로 연결되어 있습니다. 텅스텐 폴리 옥소 금속 구조는 산성 조건에서 안정되어 있지만, 수산화 이온은 금속 산소 (M-O) 결합(30)의가수 분해 절단으로 이어진다. 이 복잡한 과정은 하나 이상의 MO6 옥타트드럴 하위 단위의 손실을 초래하여, 모노 빈 및 삼각 종의 형성으로 이어지고 결국 POMs의 완전한 분해로 이어집니다. 여기서 논의하는 것은 pH 5.5 및 7.5에서 12-포스포텅스틱산의 부분 분해 산물로 제한될 것이다.

이 프로토콜의 목표는 생물학적 나노기공 기반 전자 플랫폼을 사용하여 단일 분자 한계에서 이산 금속 산소 클러스터를 검출하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 용액에서 금속 클러스터를 감지할 수 있습니다. 용액내의 다종은 종래의 분석방법(33)보다 더 높은 감도로 구별될 수 있다. 그것으로, POM 구조에 있는 미묘한 다름은 해명될 수 있고, NMR 분광학을 위해 요구된 그들 보다는 현저하게 더 낮은 농도에서. 중요한 것은, 이 접근법은 Na8HPW9O341의이소성 형태의 차별을 허용한다.

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Protocol

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참고: 아래 프로토콜은 전자 생명 과학 (EBS) 나노 패치 DC 시스템에 특정합니다. 그러나, 평면 지질 이중층 멤브레인(표준 지질 이중층 막 챔버, U-튜브 기하학, 당겨진 미세 모세소 등)을 통해 전류를 측정하는 데 사용되는 다른 전기생리학 장치에 쉽게 적응할 수 있다. 상업적 물질및 그 출처의 식별은 실험 결과를 설명하기 위해 주어진다. 이 식별은 국립 표준 기술 연구소의 권고를 의미하지 않으며, 재료가 가장 이용 가능한 것이라는 것을 의미하지도 않습니다.

1. 솔루션 및 뉴스란슈트 준비

  1. Type-1 정수 시스템에서 18MΩ-cm 의 물로 모든 전해질 용액을 준비하여 미량 유기 종을 제거한 다음 이온 채널 녹화 직전에 0.22 μm 진공 필터를 통해 모든 전해질 용액을 필터링합니다.
    참고: 수질은 멤브레인 나노기공 시스템의 안정성과 수명을 위한 중요한 요소입니다.
  2. 와일드 타입 αHL.
    1. αHL 독소 단백질을 취급할 때 MSDS 예방 조치를 따르십시오.
    2. 1 mg/mL에서 18 MΩ-cm 물과 18 MΩ-cm 물과 동포화된 야생형 단조체 S. 아우레우스α-헤몰리신(α HL) 분말을 섞습니다. 시료의 10~30μL aliquots를 냉동 안전 원심분리기 튜브에 분배하고 액체 질소에서 빠르게 동결한 다음 -80°C에 보관하십시오. 대안적으로, 정제된 미리 형성된 heptameric αHL31을사용한다.
  3. 지질 1,2-디피타노일-스니-글리세로-3-포스포콜린(DPhyPC)을 0.2 mg/mL에 n-decane에 용해하여 4 mL 유리 섬광 바이알에 폴리테트라플루오로에틸렌플론 코팅 캡을 씌우다. 용액을 4°C에 보관하여 최대 1개월 동안 반복 사용하십시오.
  4. 인산화산 솔루션을 준비합니다.
    1. 인산성 분말을 취급할 때 MSDS 주의사항을 따르고 H3PW12O40을 10 mL로 10mL로 용해시켜 2 mM 인산성 스톡 용액을 1MNaCl 및 10 mM NaH2PO44를 준비합니다. 재고 솔루션을 구성하는 솔루션입니다.
    2. 이 용액의 5 mL을 가지고 3 M NaOH로 pH를 5.5로 조정하십시오. 스톡 용액의 다른 5 mL의 pH를 3 M NaOH로 7.5로 조정합니다.
      참고: pH 5.5에서, 12-포스포텅스산(PTA,H3PW12O40)은주로 모노빈빈 음이온[PW11O39]7-로분해된다.

2. 테스트 셀 어셈블리

  1. 제조업체의 지침에 따라 테스트 셀을 조립합니다.
  2. 600 그릿 사포로 아브라이드 한 후 표백제 (하이포아염소산 나트륨)에 Ag / AgCl 와이어 1 개를 10 분 동안 담그십시오. 쿼츠 나노기공 막(QNM) 내부에 전극을 배치합니다.
  3. QNM 외부에 은와이어에 내장된 원통형 AgCl 펠릿 전극을 놓습니다.
  4. 테스트 셀이 설정되면 전원 공급 장치 및 데이터 수집 프로그램을 켭니다. 테스트 셀에 용액이 없는 경우 DC 전류 판독값이 0 pA인지 확인합니다.
  5. 유체 라인을 통해 테스트 셀에 연결된 주사기를 사용하여 QNM 면 위에 버퍼링된 전해질 용액을 추가하고 이온 전류가 증폭기를 포화시키는지 확인합니다. 그렇지 않으면 QNM이 막힐 수 있습니다. 팝 전압(±1 V) 및/또는 300mm Hg보다 큰 압력을 가하여 지웁니다. 그래도 작동하면 전압과 압력을 줄이십시오.

3. 지질 이중층 형성

  1. 솔루션 수준이 QNM의 면보다 훨씬 위에 있도록 테스트 셀에 용액을 채웁니다. 그런 다음 주사기를 통해 용액 레벨을 얼굴 아래로 낮추어 전류가 0으로 감소합니다.
  2. 지질 바이알에 10 μL 파이펫 팁을 담급강. 파이펫 팁의 뒷면 끝을 누르고 바이알의 측면을 탭하여 눈에 보이는 모든 지질을 제거합니다.
  3. 용액 수준이 QNM의 얼굴 위에 있을 때 테스트 셀의 용액의 공기-물 인터페이스에 파이펫 팁을 터치하고 지질이 균일하게 퍼질 때까지 2~5분 정도 기다립니다.
  4. 현재 포화 상태가 될 때까지 QNM의 얼굴 아래용액 레벨을 천천히 낮추고, QNM의 면을 지나 서서히 용액 레벨을 올려 지질 이중층 막을 형성한다.
    1. 이중 레이어가 형성되면(즉, 전류가 0으로 이동하면) 압력을 증가시켜 여러 번 터뜨려 QNM이 막히지 않도록 합니다. 지질 이중층 막을 개혁하려면 QNM의 얼굴 아래 용액 수준을 낮추고 천천히 올립니다.
  5. 지질 이중층 막이 처음 형성되지 않은 경우, 얼굴 아래 용액을 낮추고 다시 올립니다. 3 번의 시험 후에 형성되지 않으면 3.2 및 3.3에 설명 된 대로 더 많은 지질을 추가하십시오.
  6. 멤브레인을 형성한 후 적용된 전위가 0일 때 전류 오프셋을 0으로 설정합니다.

4. αHL 기공 형성

  1. 정제된 미리 형성된 αHL 히포머 단백질 샘플 2.5 ng(또는 단조체 αHL 250 ng)를 시험 세포(부피 200 μL)에 첨가하여 채널 형성을 가능하게 합니다.
  2. 이중층이 형성된 후 가스팽액주사기로 이중층상의 압력을 증가시키고,QNM으로부터 멤브레인을 확장하고, 나노기공 삽입을 용이하게 한다. 각 QNM에 따라 일반적으로 40~200mmHg 사이의 적용된 역압을 올립니다.
    참고: EBS 소프트웨어에는 더 높은 바이어스(일반적으로 200~400mV)를 적용하여 모공 형성을 유도한 다음 단일 채널 형태가 되면 측정 바이어스로 원하는 전압을 자동으로 줄이는 자동 삽입 기능이 있습니다.
  3. 나노기공 형성 후, 배압을 삽입 압력의 약 1⁄2로 줄입니다. 여러 채널이 관찰되면 압력을 크게 줄여 제거하십시오.

5. 나노 기공에서 금속 클러스터 분할

  1. 전극 불균형을 고려하여 DC 오프셋 전압을 설정하여 적용된 전위가 0으로 설정될 때 측정된 전류가 없는지 설정합니다.
  2. POM 샘플을 추가하기 전에 제어 실험을 수행하여 저장소에 오염물질(예:이전 실험에서 추적 POM)이 없는지 확인합니다. 특히, POM이 없는 경우 +120 mV ~ -120 mV의 적용 전위 하에서 이온 전류 추적을 획득하여 자발적인 전류 봉쇄가 존재하지 않는지 확인합니다.
    참고: αHL 채널의 비대칭 구조로인해(그림 1), 이온 전류의 확대체는 적용 전위 및 음수에 대해 다를 것이다. 이 인가 전압 위에 측정된 전류의 비율은 멤브레인내의 αHL 나노기공의 배향을 나타낸다.
  3. 1 ~5mM 농도에서 금속 클러스터 용액으로 저장소를 플러시하여 POM 샘플을 추가합니다. 양자 택일로, αHL 채널의 다른 쪽 끝으로 POMs의 분할을 공부하기 위하여 세포 집합의 앞에 모세관으로 견본을 로드합니다.
  4. 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 이온 전류를 기록하여 개별 POM을 나노 기공으로 분할하여 발생하는 일시적인 전류 차단을 감지합니다. 이온 전류 봉쇄 깊이, 이벤트 빈도 및 봉쇄의 체류 시간 분포로부터 분자의 물리적 및 화학적 특성을 추정합니다.

6. 이온 채널 녹화 및 데이터 분석

  1. 고임피던스, 저잡음 증폭기 및 데이터 수집 시스템을 사용하여 이온 전류 타임계 측정을 획득합니다. 각 pH에 대해 -120 mV(채널 시스 측에 상대적)의 적용 전압에서 측정을 수행합니다.
  2. 신호에 로우 패스 100 kHz 8 극 베셀 필터를 적용하여 500 kHz(즉, 2 ms / 포인트)에서 디지털화됩니다. MOSAIC 소프트웨어 패키지32,33에서ADEPT 알고리즘을 사용하여 타임계에서 이벤트를 추출하고 이벤트를 분석합니다.

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Results

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지난 2년 동안 멤브레인 결합 단백질 나노미터 규모의 기공은 다재다능한 단일 분자 센서로 입증되었습니다. 나노기공 기반 측정은 실행하기가 비교적 간단합니다.  전해질 용액으로 채워진 2개의 챔버는 전기적으로 절연된 지질 막에 내장된 나노기공에 의해 분리됩니다. 패치 클램프 증폭기 또는 외부 전원 공급 장치는 전해질 저장소에 침지된 Ag/AgCl 전극을 통해 나노 기공 전체에 정전전위를 제공합니다. 전기장은 개별 하전된 입자를 기공안으로 유도하여 입자의 크기, 모양 및 전하에 따라 이온 전류가 일시적으로 감소합니다. 컴퓨터 프로그램은 적용된 전압을 제어하고 실시간으로 분자가 모공으로 가역적으로 분할하여 발생하는 이온 전류 봉쇄를 모니터링합니다. 저잡음, 고임피던스 전계 효과 트랜지스터를 사용하여 전류를 증폭및 전압으로 변환하고 데이터 수집 카드를 사용하여 디지털화됩니다.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

음이온 전하로 인해 POM은 정전기 상호 작용을 통해 유기 카운터 양이온과 관련이 있습니다. 따라서 POM을 사용하여 복잡한 형성을 피하기 위해 적절한 용액 조건과 올바른 전해질 환경(특히 용액의 양이온)을 식별하는 것이 중요합니다. 버퍼 선택에서 특별한 주의가 필요합니다. 예를 들어, 트리스(hydroxymethyl)아미노메탄 및 구연산 완충액을 함유한 POM의 포획률은 인산 완충액의 경우보다 현저히 낮으며, 이는 처음 두 버퍼 중 하나가 POM을 사용하여 복합체를 형성하기 때문일 수 있습니다. 나노 기공과 강하게 상호 작용합니다. 더욱이, NaCl 전해질은 KCl(다른 알칼리 금속뿐만 아니라) 대신에 의도적으로 [PW11O39]7-by K+의 강수량을 피하기 위해 사용되었다.

체류 시간 분포의 정확한 측정에 중요한 것은 충분히 높은 대역폭에서 전류를 측정하는 능력입니다. 예를 들어, 기하급수적으로 ...

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Acknowledgements

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우리는 박사 후 펠로우십 (J.E.)에 대한 유럽 분자 생물학 기구의 재정 적 지원과 NIH NHGRI (J.J.K.)의 보조금에 감사드립니다. 우리는 교수 진규 주와 세르게이 칼라치코프 (컬럼비아 대학) heptameric αHL을 제공하고, 교수 조셉 레이너 (버지니아 커먼 웰스 대학)와 영감을 토론에 대한 도움을 주셔서 감사합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
나노패치 DC 시스템Electronic Biosciences, Inc., EBS
밀리포어 LC-PAK밀리포어 진공 필터
1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPhPC)Avanti 극성 지질, 알라바스터, AL850356P
Decane, ReagentPlus, ≥ 99%,시그마-알드리치D901
&알파; HL목록 생물학 연구소, 캠벨, 캘리포니아
Ag 와이어Alfa Aesar
2mm Ag/AgCl 디스크 전극생체 내 메트릭E202
고임피던스 증폭기 시스템Electronic Biosciences, 샌디에이고, 캘리포니아
석영 모세관
맞춤형 폴리카보네이트 테스트 셀
데이터 처리 및 분석 MOSAIChttps://pages.nist.gov/mosaic/
포스포텅스텐 산 수화물Sigma-Aldrich455970
염화나트륨Sigma-AldrichS3014
인산나트륨 일염기성 일수화물Sigma-Aldrich71507

References

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