단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과

요약

이 프로토콜 셀룰러 맥락에서 본질적으로 낮은 활동, 단일 매출 효소의 분해 활동을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 특히,이 메서드는 PCSK9, 그 분해 활동은 그것의 궁극적인 노인 기능에 필요한 지질 대사의 핵심 드라이버의 분해 활동을 평가에 적용 됩니다.

초록

Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9) 형식이 단일 매출 protease 혈 청 저밀도 지 단백질 (LDL) 수치를 조절 하 고, 따라서, 심장 혈관 질병. PCSK9 베이스에 필요 하지만 전체 콜레스테롤 효과, 분해 기능 평가 도전 이다: PCSK9 자체 쪼개만 알려져, 겪 습만 단일 회전율, 및 베이스, 후에 그것의 기질을 유지 자동-억제제로 그것의 활성 사이트입니다. 여기에 제시 된 방법을 이러한 문제를 극복 하는 분석 결과 설명 합니다. 분석 결과 셀 컨텍스트 및 링크 쉽게 읽을 수 있습니다 밖으로 바른된 매체에 은닉 luciferase 활동에 성공적인 분열 intermolecular 베이스에 집중 한다. 통해 순차적 단계 mutagenesis, 과도 transfection 그리고 luciferase 판독, 분석 결과 높은 처리량 방법에서 유전적 또는 분자 섭 동의 조건 하에서 PCSK9 베이스를 프로브 수 있습니다. 이 시스템은 임상 발견된 missense 단일 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp), 또한 PCSK9 베이스의 작은 분자 억제제의 심사에 관해서는 모두 생 화 학적 평가 대 한 적합 합니다.

서론

LDL 콜레스테롤 (LDL-콜레스테롤)을 제기 하 고 동맥 경 화성 심장 질환^1,2운전 PCSK9 성능 저하, LDL 수용 체 (LDL-R)를 대상. 치료 대상 PCSK9 튼튼하게 LDL-콜레스테롤을 낮출 하 고 적극적인 지질을 낮추는 치료 스타 틴^3,4에 추가 하는 경우에 환자에 대 한 심장 혈관 결과 개선. 그러나 현재 승인 된 치료 항 체 기반 접근에 제한 된다, 그리고 비용 효율성^5,6의 부족에서 고통. 이 문제를 해결 하려면 비용이 많이 드는 치료 대안, 환자 더 큰 혜택을 얻을 것을 식별 하는 수단 또는 둘 다 필요 합니다.

작은 분자 접근은 세포내 PCSK9 대상, 관리의 향상 된 경로 제공 고 비용, 그들에 게이 지역⁷에 있는 "성배"를 줄일 수 있습니다. 그러나, PCSK9 작은 분자 약물 어려운 입증 했다. 한 효소로 PCSK9의 분해 기능을 대상으로 자체 베이스 PCSK9 성숙⁸ 의 속도 제한 단계가 고 LDL-R⁹에 그것의 최대 효과 위해 필요한 매력적인 전략 이다. 그러나 현재까지,,이 전략 하지 않은 성공 가능성이 PCSK9의 고유한 생화학 때문: PCSK9 앞만 자체¹⁰, 수행 하는 단일-매출 반응, 그리고 자기 분열 후 PCSK9 prodomain와 활성 사이트에 바인딩된는 자동-억제제¹¹, 어떤 더 프로 테아 제 활동의 판독을 방지.

이 문서는 높은 처리량 패션⁸PCSK9 분해 기능을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 사이트 지시 된 mutagenesis, 통해 조사자는 베이스, PCSK9 성숙의 속도 제한 단계에 효과 대 한 그들을 평가 하기 위해 병원에서 발견 하는 Snp 코딩의 효과 조사 하이 분석 결과 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 궁극적으로 LDL-r PCSK9의 프레 젠 테이 션을 방해 (및 변조 PCSK9의 콜레스테롤 효과) 것으로 예상 되는 PCSK9 베이스의 변조기를 식별 하기 위해 높은 처리량 스크린의 설계에 도움이 될 것입니다. . 마지막으로,이 프로토콜은 i) 특정 기질-효소 쌍을 찾을 수 있습니다, 고 기판에 대 한 ii)는 적당 한 세포내 앵커를 설정할 수 있습니다 본질적으로 낮은 활동, 다른 프로 테아 제를 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 사이트 감독 Mutagenesis Protease 벡터의

1. 디자인과 표준 사이트 감독 mutagenesis 프로토콜¹²의 수정을 사용 하 여 관심사의 돌연변이 설치 하려면 사용자 정의 합성 oligonucleotides 주문. 표준 desalted 뇌관 (추가 정화) 없이 완벽 하 게 사용할 수 있습니다.
   참고: 뇌관 디자인에 대 한 일반적인 접근 표 1의 중 합 효소에 녹는 온도 (T_m) 계산기를 사용 하 여 표시 된 대로 부분적으로 겹치는 뇌관을 만드는 작업이 포함 됩니다.
2. 설정 중 합 효소 연쇄 반응 (PCRs) 사이트 감독 mutagenesis 얼음, 표 2에 표시 된 대로.
3. 표 3에 표시 된 대로 PCRs를 주기.
4. 1 %agarose 젤에 각 PCR의 2-5 µ L을 실행 하 고 성공적인 증폭을 확인 하는 제품을 시각화.
   참고: 성공적인 PCR (~7.8 kB) 서식 파일의 대략적인 크기 표시에서 단일, 저명한 DNA 밴드를 표시 합니다.
5. DpnI의 (25 µ L 반응) 당 0.5 µ L을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
6. 화학적으로 유능한 병원 성 대장균으로 반응의 2 µ L를 변환.
   참고: 급성장 E. 콜라이 긴장 부 화 시간을 줄일 것입니다 하지만 어떤 복제 긴장 든 지 받아들일 수 있을 것입니다.
7. 포함 하는 50-100 µ g/mL carbenicillin Luria Bertani (파운드) agar에 변형 판 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어
8. 2-4 식민지는 소규모 문화 (50-100 µ g/mL carbenicillin와 파운드 매체의 2-5 mL)에서 성장 하는 것을 선택 합니다. 혼 탁 한 때까지 220 rpm에서 37 ° C에서 문화를 품 어.
9. 제조업체의 지침에 따라 플라스 미드 DNA (i.e, "miniprep") 정화 키트를 사용 하 여 셀에서 DNA 플라스 미드를 분리. Microvolume 분 광 광도 계를 사용 하 여 eluted DNA의 농도 계량.
10. 플라스 미드는 생어 시퀀싱 서비스 (코어 또는 상업 시설)를 사용 하 여 광범위 하 게 DNA 순서. 서비스의 사양에 따라 DNA 샘플을 준비 합니다. 사전 연속 반응에서 성공적으로 사용 하는 뇌관은 표 4에 설명 되어 있습니다.
    참고: 전체 플라스 미드 PCR 증폭으로 인해 전체 PCSK9 코딩 영역의 시퀀싱이 좋습니다 각 돌연변이 대 한.

2. 높은 처리량 Luciferase 기반 베이스 분석 결과

1. 셀 도금 (0 일)
   1. 실험에 대 한 낮은 통로 HEK293T 셀을 사용 하 고 Dulbecco의에 문화 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 독수리 매체 (DMEM) 수정. 수행 모든 luciferase 활동 시험 준비까지 조직 문화 후드에서 무 균 조건 하에서 작업 셀. 우물과 transfections를 테스트 하는 각 조건에 대 한 3 중에 수행 하 게 될 예상 실험에 필요한 접시의 수를 견적 한다.
   3. 
      
2. 1. 
      
      4. 
         
   2. 
      
   3. 
      
3. 1. 
      
   2. 
      

3. 
   
4. 
   
   
6. 
   
   

결과

높은 처리량 베이스 분석 결과 세 가지 주요 과제를 극복에 의존 합니다. 첫째, 단일-매출 PCSK9 효소는 억제 부족 PCSK9 효소의 본질적으로 낮은 출력을 극복 하기 위해 prodomain 사용 됩니다, 분열 순서는 prodomain의 꼬리에서 분 비¹⁴수 luciferase에 연결. 둘째, 접으면 protease에 대 한 필요를 만족 시키기 위해 복잡 한 그것의 억제와 함께 prodomain, 2 개의 polypeptides는 coexpressed 트랜스에서 셀룰러 컨텍스트^15,16를 통해 bicistronic 벡터에. 셋째,에서 차별화 하는 쪼개진 uncleaved 기판, PCSK9 효소가 잘립니다 C678 바인딩과 그물 (응급실)에서 복잡 한 PCSK9 출구를 방지 하지만 분해 기능...

토론

위에서 설명한 실험 절차 단일 매출 protease PCSK9의 본질적으로 저조를 극복 하 고 강력한 방식으로 분해 기능을 평가 하는 방법을 제시. 분석 결과의 주요 개념 효소 증폭된 판독 단일 매출 이벤트 변환에 의존 합니다. 분석 결과의 강점 등는 상대적으로 짧은 시간 프레임 luciferase 기자는 확장성 높은 처리량 접근의 사용의 용이성. 또한, 분석 결과 네이티브, 셀룰러 맥락에서 베이스를 평가합니다. 또한,이 분석 결과와 임상적으로 확인 된 Snp 평가할 수 있다 어떤 인간이 나 환자 조직;에 대 한 필요 없이 PCSK9 베이스에 그들의 효과 대 한 관심사의 유전자 형의 기술만 필요 하다.

분석 결과의 몇 가지 기술적인 제한이 존재 한다. 분석 결과 평가 셀 내에 베이스, 비록 벡터의 overexpression을 또한 필요 합니다. 분석 결과 HEK293T 셀 라인의 과도 transfection를 해야 하므로 transfection 효율 내장 잘-투-잘 다양성을 추가...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PCR Tubes	USA Scientific	1402-2900	For PCR
Q5 Hot Start	New England Biolabs	M0493L	고충실도 DNA 중합효소
데옥시뉴클레오티드 용액 믹스	New England Biolabs	N0447L	dNTPs (for PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT	Authors	n/a
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A에서 입수 가능	저자	해당 없음	:
Agarose LE	Gold Biotechnology	A-201-100	For DNA gels
E-Gel Imager System with Blue Light Base ThermoFisher	Scientific	4466612	For imaging DNA gel SYBR
Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102	For DNA gel
Tris Base	ThermoFisher Scientific	BP152-1	DNA 젤 실행 버퍼
빙하	ThermoFisher Scientific	A38-500	DNA 젤 실행 버퍼
에틸렌디아민 테트라아세트산 용액	Millipore Sigma	3690	EDTA, DNA 젤 실행 버퍼
1kb DNA 사다리	Gold Biotechnology	D010	DNA 사다리
DpnI	New England Biolabs	R0176S	제한 효소
100 µ를 가진 LB 한천 판; g/mL 카르베니실린	Teknova	L1010	LB-Carb 플레이트
One Shot Mach1 T 파지 저항성 화학적 역량 E. coli	ThermoFisher Scientific	C862003	화학적 역량 세포
LB Broth, Miller	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	LB
카르베니실린	골드 생명공학	C-103-5	선택적 항생제
E.Z.N.A. 플라스미드 미니 키트 I	Omega BioTek	D6942-02	DNA 정제 Miniprep 키트
NanoDrop 2000 분광광도머	ThermoFisher Scientific	ND-2000C	분광광도계
293T 세포	American Tissue Culture Collection (ATCC)	CRL-3216	HEK 293T 세포
DMEM, 고포도당, 피루브산	ThermoFisher Scientific		11995065 DMEM, 포유류 세포 배지
Fetal Bovine Sera	Axenia Biologix	F001	FBS
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드	ThermoFisher Scientific	25300062	Trypsin, 세포 해리용
인산염 완충 식염수(PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	PBS
Countess 자동 세포 계수기	ThermoFisher Scientific	C10227	자동 세포 계수
백작 세포 계수 챔버 슬라이드	ThermoFisher Scientific	C10228	세포 계수용 슬라이드
CELLSTAR 조직 배양 플레이트, 흰색, 흰색 바닥, 뚜껑 포함	Grenier Bio-One	655083	흰색, 흰색 바닥 96웰 플레이트
TempPlate 논스커트 96웰 PCR 플레이트, 천연	USA Scientific	1402-9596	마스터 플라스미드 플레이트용 96웰 플레이트
Nunc 2.0mL DeepWell 플레이트	ThermoFisher Scientific	278743	96 웰 딥 웰 플레이트
Lipofectamine 3000	ThermoFisher Scientific	L3000008	지질 형질주입 시약, Lf3K
P3000 시약	ThermoFisher Scientific	L3000008	DNA 사전 복합화 시약, Lf3K
OptiMEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062	Reduced serum medium 제공 트랜스펙션
(+)-나트륨 L-아스코르브산염	밀리포어 시그마	A4034	소듐 아스코르브산
나트륨 밀리	포어 시그마	S9888	NaCl
알부민, 소 혈청, 분획 V, 저중금속	밀리포어 시그마	12659	BSA
메탄올 (HPLC)	ThermoFisher Scientific	A4524	MeOH
염산	VWR	JT9535-2	농축 HCl
Coelenterazine	Gold Biotechnology	CZ2.5	Luciferase 기판
주사기 필터, 멸균	ThermoFisher Scientific	09-720-3	멸균 필터, PVDF, 0.22 &마이크로; m pore
Pipet-Lite 멀티채널 피펫 L12-200XLS+	Rainin	17013810	멀티채널 피
Pipet-Lite 멀티채널 피펫 L12-20XLS+	Rainin	17013808	멀티채널 피펫
Pipet-Lite 멀티피펫 L12-10XLS+	Rainin	17013807	멀티채널 피펫
시약 reservoir	Corning	4870	시약
용 Trough원심분리기 튜브, 15 mL	ThermoFisher Scientific	05-539-12	15 mL 튜브
원심분리기 튜브, 50 mL	Corning	430829	50 mL 튜브
Spark Microplate Reader	Tecan	N/a	Plate Reader
Excel	Microsoft	2016 for Mac	스프레드시트 소프트웨어
Prism	GraphPad 소프트웨어	v7	Scientific 데이터 분석 소프트웨어

저자 작성자 아세트산 기염 펫