단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과

John S. Chorba; Adri M. Galvan; Kevan M. Shokat

doi:10.3791/58265

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방법 논문

단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과

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DOI:

10.3791/58265

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2018년 8월 28일

John S. Chorba¹ , Adri M. Galvan² , Kevan M. Shokat²

¹Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, ²Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

이 논문에서

요약

이 프로토콜 셀룰러 맥락에서 본질적으로 낮은 활동, 단일 매출 효소의 분해 활동을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 특히,이 메서드는 PCSK9, 그 분해 활동은 그것의 궁극적인 노인 기능에 필요한 지질 대사의 핵심 드라이버의 분해 활동을 평가에 적용 됩니다.

초록

Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9) 형식이 단일 매출 protease 혈 청 저밀도 지 단백질 (LDL) 수치를 조절 하 고, 따라서, 심장 혈관 질병. PCSK9 베이스에 필요 하지만 전체 콜레스테롤 효과, 분해 기능 평가 도전 이다: PCSK9 자체 쪼개만 알려져, 겪 습만 단일 회전율, 및 베이스, 후에 그것의 기질을 유지 자동-억제제로 그것의 활성 사이트입니다. 여기에 제시 된 방법을 이러한 문제를 극복 하는 분석 결과 설명 합니다. 분석 결과 셀 컨텍스트 및 링크 쉽게 읽을 수 있습니다 밖으로 바른된 매체에 은닉 luciferase 활동에 성공적인 분열 intermolecular 베이스에 집중 한다. 통해 순차적 단계 mutagenesis, 과도 transfection 그리고 luciferase 판독, 분석 결과 높은 처리량 방법에서 유전적 또는 분자 섭 동의 조건 하에서 PCSK9 베이스를 프로브 수 있습니다. 이 시스템은 임상 발견된 missense 단일 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp), 또한 PCSK9 베이스의 작은 분자 억제제의 심사에 관해서는 모두 생 화 학적 평가 대 한 적합 합니다.

서론

LDL 콜레스테롤 (LDL-콜레스테롤)을 제기 하 고 동맥 경 화성 심장 질환¹^,²운전 PCSK9 성능 저하, LDL 수용 체 (LDL-R)를 대상. 치료 대상 PCSK9 튼튼하게 LDL-콜레스테롤을 낮출 하 고 적극적인 지질을 낮추는 치료 스타 틴³^,⁴에 추가 하는 경우에 환자에 대 한 심장 혈관 결과 개선. 그러나 현재 승인 된 치료 항 체 기반 접근에 제한 된다, 그리고 비용 효율성⁵^,⁶의 부족에서 고통. 이 문제를 해결 하려면 비용이 많이 드는 치료 대안, 환자 더 큰 혜택을 얻을 것을 식별 하는 수단 또는 둘 다 필요 합니다.

작은 분자 접근은 세포내 PCSK9 대상, 관리의 향상 된 경로 제공 고 비용, 그들에 게이 지역⁷에 있는 "성배"를 줄일 수 있습니다. 그러나, PCSK9 작은 분자 약물 어려운 입증 했다. 한 효소로 PCSK9의 분해 기능을 대상으로 자체 베이스 PCSK....