여기, 우리가 첫 번째 코딩 exon 유전자의 전사 드라이버 대체 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 방법 제시. CRISPR/Cas9-기반 방법 대체 유전자의 생 규칙에서 transactivator 시퀀스를 장소 따라서 유전자 특정 spatiotemporal 패턴에 독점적으로 transctivator 식을 촉진 한다.
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이 논문에서
요약
초록
이진 전송 시스템은 강력한 유전적 도구를 시각화 하 고 조작 하는 셀의 특정 그룹에서 세포 운명과 유전자 식 또는 조직 모형 유기 체에서 널리 이용 되는. 이러한 시스템 별도 유전자 변형 라인으로 두 개의 구성 요소가 포함 되어 있습니다. 드라이버 라인 조직의 특정 발기인/강화, 제어 및 대상 유전자의 녹음 방송 활성 제 바인딩 사이트에 하류 배치 기자/이펙터 라인 항구 transcriptional 활성 제를 표현 합니다. 두 구성 요소를 품고 동물 대상 유전자 발현의 조직-특정 transactivation 유도. 대상된 조직에 유전자의 정확한 spatiotemporal 식 세포/유전자 활동의 편견된 해석에 대 한 중요 하다. 따라서, 독점 세포/조직 관련 드라이버 라인을 생성 하기 위한 방법 개발이 필수적입니다. 여기에 우리가 매우 조직 특정 대상된 식 시스템을 채용 하 여 생성 하는 방법을 제시는 "정기적으로 클러스터 된 Interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 된" (CRISPR/Ca)-게놈 편집 기법을 기반으로. 이 방법에서는, Cas9 공상 두 대상 이다 endonuclease RNAs (gRNA) 더블-스트랜드 나누기 (DSB) 만들려고 초파리 게놈에서 유전자의 첫 번째 코딩 exon에 특정 사이트 안내. 그 후, transactivator 시퀀스를 포함 하는 외 인 기증자 플라스 미드를 사용 하 여 셀 자치 수리 기계 수 있습니다 homology 감독 수리를 (HDR) 정확한 삭제 하 고는 transactivator와는 엑손의 교체 DSB의 시퀀스입니다. 절에서 transactivator 셀에 독점적으로 표현 된다 어디 cis-대체 유전자의 규제 요소가 기능. 여기에 제시 된 초파리 fgf에 표현 하는 이진 transcriptional 드라이버 생성에 대 한 자세한 단계별 프로토콜 /branchless-상피/신경 세포 생산 유전자 또는 조직의 특정 식에 대 한 채택 될 수 있다.
서론
타겟된 유전자 발현에 대 한 유전 도구 상자 잘 초파리, 다양 한 세포질 프로세스에서에서 포함 된 유전자의 기능을 조사 하기 위해 최고의 모델 시스템 중 하나에서 개발 되었습니다. 이진 식 시스템, 효 Gal4/UAS (상류 활성화 순서), 초파리 유전자 모델1 (그림 1)에서 조직 관련 증강 트랩 및 유전자 misexpression에 처음 채택 되었다. 이 시스템 기법 유전자 overexpression, misexpression, 선택 된 셀 그룹에 또한 셀 절제, 셀 표시, 세포질이 고 분자의 라이브 추적에서 녹아웃 spatiotemporal 규제 등의 많은 수의 개발을 촉진 배아와 조직, 계보 추적 및 모자이크 분석 개발 하는 동안에 처리 합니다. LexA세균성 같은 이진 전사 시스템의 수 /LexAop 시스템 (그림 1)와 Neurospora Q-시스템, 초파리, 이외에에서 널리 사용 지금 되는 강력한 유전자 도구 타겟된 유전자 식1,
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프로토콜
1. 설계 및 건설 gRNA 표정 벡터
- 정확 하 게는 엑손의 긴 정의 된 영역을 대체 하려면 듀얼 gRNA 접근6, 있는 각 gRNA 특별히 선택 된 관심 영역의 두 끝을 타겟팅 할 수 있습니다 사용 합니다. 정확한 유전자 특정 spatiotemporal 표현의 드라이버를 얻으려면 첫 번째 코딩 exon 유전자의 두 gRNA 대상 사이트를 선택 합니다.
-
초파리 melanogaster, flyCRISPR 최적의 대상 찾기 도구 (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/)를 사용 하 여 gRNA 대상 사이트를 선택 합니다. 다른 사용 가능한 CRISPR 디자인 도구 사용할 수 있습니다 뿐만 아니라, 최적화 CRISPR 디자인 도구 (http://crispr.mit.edu), FlyCas9를 포함 하 여 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9), 및 E-선명 (www.e-crisp.org/E-CRISP).
참고: gRNA 디자인 및 복제의 다음과 같은 프로토콜 방법 앞에서 설명한6,7<....
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결과
이 프로토콜은 bnl 셀5표현에 대 한 대상된 이진 식 기자 시스템 특정 생성 하 성공적으로 사용 되었다. Cis-복잡 한 spatiotemporal bnl 식 제어 하는 규제 요소 (CREs) 특징 되지 않습니다. 따라서, spatiotemporal 식 생 bnl 규제 시퀀스의 통제를 달성 하기 위해, bnl 의 첫 번째 코딩 exon만 세균성 LexA transactivator의 순서 교체 하도록 설계 되었습니다. 알려진 초파리 에 최적의 식을 제공 하는 향상 된 nls LexA::p65 카세트 선정 됐다.
대체 전략은 공상을 생성 하기 위한 nls-LexA:p65-bnl 생.......
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토론
전통적으로, 초파리 증강 트랩은 두 가지 방법으로 생성 되었다. 방법 중 하나는 드라이버의 임의 삽입 포함 (예., Gal4) 이항에 의해 게놈 시퀀스 (예., P 요소 이항)1 . 또는, 게놈3,11의 소성 사이트에 통합 될 것 이라고 하는 플라스 미드 구문에 상 상속 증강/발기인 지역의 transcriptional 통제 드라이버 시퀀스를 배치할 수 있습니다. 이러한 방법은 초파리에 Gal4 또는 LexA 증강 트랩의 대형 수영장 생성, 비록 그들은 몇 가지 제한이 있다. 게놈에 있는 P 요소 중재 하는 무작위 삽입 중요 한 cis의 규제 활동 중단 될 수 있습니다-규제 시퀀스. 게놈에 있는 임의의 이항 인 transactivator 식 여러 인접 유전자의 패턴을 보고할.......
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공개 사항
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
우리 박사 F. 포트, 감사 닥터 K. 오 코너-자일 스, 닥터 미 Feng CRISPR 전략;에 대 한 토론에 대 한 박사 결핵 콘 버그, 그리고 시 약; 대 한 블루밍턴 재고 센터 UMD 이미징 핵심 시설; NIH에서 자금: R00HL114867 및 R35GM124878 미스터를
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | 복제 |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | 복제 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | 분자 생물학 |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | 분자 생물학 |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | 분자 생물학 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | 분자 생물학 |
| 10% SDS | 시그마 Aldrich | 71736 | 분자 생물학 |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | 분자 생물학 |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | 분자 생물학 |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep 키트 | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | 제한 효소 |
| 프라이머 | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA 템플릿 및 벡터 gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB NEB | #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA 어셈블리 |
| pBPnlsLexA:p65Uw | LexA 증폭용 | Addgene | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | 분자 생물학 |
| 2x PCR PreMix, 염료 포함(빨간색) | Sydlab | MB067-EQ2R | 분자 생물학 |
| 겔 용출 키트 | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | 분자 생물학 |
| TRI 시약 | Sigma-Aldrich | 분자 생물학 | |
| 직접 졸 RNA 정제 키트 | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | 분자 생물학 |
| OneTaq< / em> 원스텝 RT-PCR 키트 | NEB | E5315S | 분자 생물학 |
| lexO-< / em > CherryCAAX | Kornberg Lab | 플라이 라인 | |
| UAS-CD8 : GFP | Kornberg lab | 플라이 라인 | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | 플라이 푸싱 |
| 스테레오 현미경 | Olympus | SZ-61 | 플라이 푸싱 |
| 유봉 마이크로튜브 균질화 | Fisher-Scientific | 03-421-217 | 게놈 DNA 분리 |
| NanoDrop 분광 광도계 | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA 정량화 |
참고문헌
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophil....
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재인쇄 및 허가
