Method Article

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

DOI:

10.3791/58268

⸱

September 19th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리가 첫 번째 코딩 exon 유전자의 전사 드라이버 대체 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 방법 제시. CRISPR/Cas9-기반 방법 대체 유전자의 생 규칙에서 transactivator 시퀀스를 장소 따라서 유전자 특정 spatiotemporal 패턴에 독점적으로 transctivator 식을 촉진 한다.

Abstract

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이진 전송 시스템은 강력한 유전적 도구를 시각화 하 고 조작 하는 셀의 특정 그룹에서 세포 운명과 유전자 식 또는 조직 모형 유기 체에서 널리 이용 되는. 이러한 시스템 별도 유전자 변형 라인으로 두 개의 구성 요소가 포함 되어 있습니다. 드라이버 라인 조직의 특정 발기인/강화, 제어 및 대상 유전자의 녹음 방송 활성 제 바인딩 사이트에 하류 배치 기자/이펙터 라인 항구 transcriptional 활성 제를 표현 합니다. 두 구성 요소를 품고 동물 대상 유전자 발현의 조직-특정 transactivation 유도. 대상된 조직에 유전자의 정확한 spatiotemporal 식 세포/유전자 활동의 편견된 해석에 대 한 중요 하다. 따라서, 독점 세포/조직 관련 드라이버 라인을 생성 하기 위한 방법 개발이 필수적입니다. 여기에 우리가 매우 조직 특정 대상된 식 시스템을 채용 하 여 생성 하는 방법을 제시는 "정기적으로 클러스터 된 Interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 된" (CRISPR/Ca)-게놈 편집 기법을 기반으로. 이 방법에서는, Cas9 공상 두 대상 이다 endonuclease RNAs (gRNA) 더블-스트랜드 나누기 (DSB) 만들려고 초파리 게놈에서 유전자의 첫 번째 코딩 exon에 특정 사이트 안내. 그 후, transactivator 시퀀스를 포함 하는 외 인 기증자 플라스 미드를 사용 하 여 셀 자치 수리 기계 수 있습니다 homology 감독 수리를 (HDR) 정확한 삭제 하 고는 transactivator와는 엑손의 교체 DSB의 시퀀스입니다. 절에서 transactivator 셀에 독점적으로 표현 된다 어디 cis-대체 유전자의 규제 요소가 기능. 여기에 제시 된 초파리 fgf에 표현 하는 이진 transcriptional 드라이버 생성에 대 한 자세한 단계별 프로토콜 /branchless-상피/신경 세포 생산 유전자 또는 조직의 특정 식에 대 한 채택 될 수 있다.

Introduction

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타겟된 유전자 발현에 대 한 유전 도구 상자 잘 초파리, 다양 한 세포질 프로세스에서에서 포함 된 유전자의 기능을 조사 하기 위해 최고의 모델 시스템 중 하나에서 개발 되었습니다. 이진 식 시스템, 효 Gal4/UAS (상류 활성화 순서), 초파리 유전자 모델1 (그림 1)에서 조직 관련 증강 트랩 및 유전자 misexpression에 처음 채택 되었다. 이 시스템 기법 유전자 overexpression, misexpression, 선택 된 셀 그룹에 또한 셀 절제, 셀 표시, 세포질이 고 분자의 라이브 추적에서 녹아웃 spatiotemporal 규제 등의 많은 수의 개발을 촉진 배아와 조직, 계보 추적 및 모자이크 분석 개발 하는 동안에 처리 합니다. LexA세균성 같은 이진 전사 시스템의 수 /LexAop 시스템 (그림 1)와 Neurospora Q-시스템, 초파리, 이외에에서 널리 사용 지금 되는 강력한 유전자 도구 타겟된 유전자 식1,

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Protocol

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1. 설계 및 건설 gRNA 표정 벡터

  1. 정확 하 게는 엑손의 긴 정의 된 영역을 대체 하려면 듀얼 gRNA 접근6, 있는 각 gRNA 특별히 선택 된 관심 영역의 두 끝을 타겟팅 할 수 있습니다 사용 합니다. 정확한 유전자 특정 spatiotemporal 표현의 드라이버를 얻으려면 첫 번째 코딩 exon 유전자의 두 gRNA 대상 사이트를 선택 합니다.
  2. 초파리 melanogaster, flyCRISPR 최적의 대상 찾기 도구 (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/)를 사용 하 여 gRNA 대상 사이트를 선택 합니다. 다른 사용 가능한 CRISPR 디자인 도구 사용할 수 있습니다 뿐만 아니라, 최적화 CRISPR 디자인 도구 (http://crispr.mit.edu), FlyCas9를 포함 하 여 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9), 및 E-선명 (www.e-crisp.org/E-CRISP).
    참고: gRNA 디자인 및 복제의 다음과 같은 프로토콜 방법 앞에서 설명한6,7<....

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Results

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이 프로토콜은 bnl 셀5표현에 대 한 대상된 이진 식 기자 시스템 특정 생성 하 성공적으로 사용 되었다. Cis-복잡 한 spatiotemporal bnl 식 제어 하는 규제 요소 (CREs) 특징 되지 않습니다. 따라서, spatiotemporal 식 생 bnl 규제 시퀀스의 통제를 달성 하기 위해, bnl 의 첫 번째 코딩 exon만 세균성 LexA transactivator의 순서 교체 하도록 설계 되었습니다. 알려진 초파리 에 최적의 식을 제공 하는 향상 된 nls LexA::p65 카세트 선정 됐다.

대체 전략은 공상을 생성 하기 위한 nls-LexA:p65-bnl 생.......

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Discussion

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전통적으로, 초파리 증강 트랩은 두 가지 방법으로 생성 되었다. 방법 중 하나는 드라이버의 임의 삽입 포함 (예., Gal4) 이항에 의해 게놈 시퀀스 (예., P 요소 이항)1 . 또는, 게놈3,11의 소성 사이트에 통합 될 것 이라고 하는 플라스 미드 구문에 상 상속 증강/발기인 지역의 transcriptional 통제 드라이버 시퀀스를 배치할 수 있습니다. 이러한 방법은 초파리에 Gal4 또는 LexA 증강 트랩의 대형 수영장 생성, 비록 그들은 몇 가지 제한이 있다. 게놈에 있는 P 요소 중재 하는 무작위 삽입 중요 한 cis의 규제 활동 중단 될 수 있습니다-규제 시퀀스. 게놈에 있는 임의의 이항 인 transactivator 식 여러 인접 유전자의 패턴을 보고할.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgements

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우리 박사 F. 포트, 감사 닥터 K. 오 코너-자일 스, 닥터 미 Feng CRISPR 전략;에 대 한 토론에 대 한 박사 결핵 콘 버그, 그리고 시 약; 대 한 블루밍턴 재고 센터 UMD 이미징 핵심 시설; NIH에서 자금: R00HL114867 및 R35GM124878 미스터를

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
X-Gal/IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218복제
LB-AgarBD DifcoBD  244520복제
Tris-HClSigma AldrichT3253분자 생물학
EDTASigma AldrichE1161분자 생물학
NaClSigma AldrichS7653분자 생물학
UltraPure DNase/RNase-Free WaterThermoFisher Scientific10977-023분자 생물학
10% SDS시그마 Aldrich71736분자 생물학
KOAcFisher-ScientificP1190분자 생물학
EtOHFisher-Scientific04-355-451분자 생물학
GeneJET MiniprepThermoFisher ScientificK0503Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep 키트ThermoFisher ScientificK210006Maxiprep
BbsINEBR0539S제한 효소
프라이머IDT-DNAPCR
pCFD4Kornberg LabDNA 템플릿 및 벡터 gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-high fidelity TaqNEB NEB#M0491PCR
Gibson Assembly Master MixNEBNEB #E2611DNA 어셈블리
pBPnlsLexA:p65UwLexA 증폭용Addgene
Proteinase KThermoFisher Scientific25530049분자 생물학
2x PCR PreMix, 염료 포함(빨간색)SydlabMB067-EQ2R분자 생물학
겔 용출 키트Zymo Research (Genesee Scientific)11-300분자 생물학
TRI 시약Sigma-Aldrich분자 생물학
직접 졸 RNA 정제 키트Zymo Research (Genesee Scientific)11-330분자 생물학
OneTaq< / em> 원스텝 RT-PCR 키트NEBE5315S분자 생물학
lexO-< / em > CherryCAAXKornberg Lab플라이 라인
UAS-CD8 : GFPKornberg lab플라이 라인
btl-Gal4Kornberg labFly line
MKRS/TB6BKornberg labFly line
Confocal Microscope SP5XLeicaImaging expression pattern
CO2 stationGenesee Scientific59-122WCU플라이 푸싱
스테레오 현미경OlympusSZ-61플라이 푸싱
유봉 마이크로튜브 균질화Fisher-Scientific03-421-217게놈 DNA 분리
NanoDrop 분광 광도계ThermoFisher ScientificND-1000DNA 정량화
DNA 템플릿

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophil....

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Tags

CRISPR Cas9Binary Transcription SystemTissue specific ExpressionDrosophila Genome EditingHomology directed RepairGuide RNA DesignTransactivator Knock inExon ReplacementSpatiotemporal RegulationGAL4 LexA System

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