게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

요약

여기, 우리가 첫 번째 코딩 exon 유전자의 전사 드라이버 대체 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 방법 제시. CRISPR/Cas9-기반 방법 대체 유전자의 생 규칙에서 transactivator 시퀀스를 장소 따라서 유전자 특정 spatiotemporal 패턴에 독점적으로 transctivator 식을 촉진 한다.

초록

이진 전송 시스템은 강력한 유전적 도구를 시각화 하 고 조작 하는 셀의 특정 그룹에서 세포 운명과 유전자 식 또는 조직 모형 유기 체에서 널리 이용 되는. 이러한 시스템 별도 유전자 변형 라인으로 두 개의 구성 요소가 포함 되어 있습니다. 드라이버 라인 조직의 특정 발기인/강화, 제어 및 대상 유전자의 녹음 방송 활성 제 바인딩 사이트에 하류 배치 기자/이펙터 라인 항구 transcriptional 활성 제를 표현 합니다. 두 구성 요소를 품고 동물 대상 유전자 발현의 조직-특정 transactivation 유도. 대상된 조직에 유전자의 정확한 spatiotemporal 식 세포/유전자 활동의 편견된 해석에 대 한 중요 하다. 따라서, 독점 세포/조직 관련 드라이버 라인을 생성 하기 위한 방법 개발이 필수적입니다. 여기에 우리가 매우 조직 특정 대상된 식 시스템을 채용 하 여 생성 하는 방법을 제시는 "정기적으로 클러스터 된 Interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 된" (CRISPR/Ca)-게놈 편집 기법을 기반으로. 이 방법에서는, Cas9 공상 두 대상 이다 endonuclease RNAs (gRNA) 더블-스트랜드 나누기 (DSB) 만들려고 초파리 게놈에서 유전자의 첫 번째 코딩 exon에 특정 사이트 안내. 그 후, transactivator 시퀀스를 포함 하는 외 인 기증자 플라스 미드를 사용 하 여 셀 자치 수리 기계 수 있습니다 homology 감독 수리를 (HDR) 정확한 삭제 하 고는 transactivator와는 엑손의 교체 DSB의 시퀀스입니다. 절에서 transactivator 셀에 독점적으로 표현 된다 어디 cis-대체 유전자의 규제 요소가 기능. 여기에 제시 된 초파리 fgf에 표현 하는 이진 transcriptional 드라이버 생성에 대 한 자세한 단계별 프로토콜 /branchless-상피/신경 세포 생산 유전자 또는 조직의 특정 식에 대 한 채택 될 수 있다.

서론

타겟된 유전자 발현에 대 한 유전 도구 상자 잘 초파리, 다양 한 세포질 프로세스에서에서 포함 된 유전자의 기능을 조사 하기 위해 최고의 모델 시스템 중 하나에서 개발 되었습니다. 이진 식 시스템, 효 Gal4/UAS (상류 활성화 순서), 초파리 유전자 모델¹ (그림 1)에서 조직 관련 증강 트랩 및 유전자 misexpression에 처음 채택 되었다. 이 시스템 기법 유전자 overexpression, misexpression, 선택 된 셀 그룹에 또한 셀 절제, 셀 표시, 세포질이 고 분자의 라이브 추적에서 녹아웃 spatiotemporal 규제 등의 많은 수의 개발을 촉진 배아와 조직, 계보 추적 및 모자이크 분석 개발 하는 동안에 처리 합니다. LexA세균성 같은 이진 전사 시스템의 수 /LexA_op 시스템 (그림 1)와 Neurospora Q-시스템, 초파리, 이외에에서 널리 사용 지금 되는 강력한 유전자 도구 타겟된 유전자 식^1,2,3에 대 한 원래 Gal4/UAS 체계.

여기, 우리는 게놈 편집 기법을 사용 하 여 신뢰할 수 있는 조직 관련 이진 식 시스템을 생성 하는 방법을 제시. CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술에 있는 최근 전진은 전례 없는 기회를 생물의 광범위 한 범위에서 감독된 게놈 변화를 만들 수 있다. 다른 사용 가능한 게놈 편집 기술에 비해, CRISPR/Cas9 시스템은 저렴 한 효율적이 고 신뢰할 수 있는. 이 기술은 이용 한다 세균성 적응 면역 시스템의 구성 요소: Cas9 endonuclease 만드는 두 배 물가 틈 (DSB), 연쇄 상 구 균 pyogenes 및 공상 가이드 RNA (gRNA)는 Cas9에 대 한 특정 게놈 사이트 안내 타겟된 DSB⁴. 셀은 DSB 다른 경로 사용 하 여 복구 하는 기계를 포함 합니다. 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 템플릿으로 exogenous HDR 기증자를 사용 하 여 정의 된 감독/바람직한 게놈 노크에서 / 노크-아웃을 소개 하는 homology 감독 수리 (HDR) 동안 유전자 기능을 방해 작은 삽입 또는 삭제를 리드. HDR-기반 대체 전략 전통적인 증강 트랩 메서드의 모든 한계를 극복할 수 있는 매우 신뢰할 수 있는 조직 관련 이진 식 시스템을 생성 하기 위해 효율적으로 활용할 수 있습니다. 우리 초파리의 내 생 transcriptional 및 post-transcriptional 규정의 제어에서 표현 되는 이진 전사 드라이버 라인 생성에 CRISPR/Cas9 기반 HDR 수리의 활용에 대 한 단계별 절차를 설명 유전자. 이 프로토콜에 대 한 특정 드라이버 라인의 세대 설명 branchless (bnl) 유전자 조절 tracheal 기도 상피⁵분기 morphogenesis FGF 가족 단백질을 인코딩. 이 예제에서 bnl 유전자의 첫 번째 코딩 exon 어떤 생 ci를 변경 하지 않고 세균 LexA transactivator 시퀀스의 순서에 의해 대체 되었다- bnl 유전자의 규제 시퀀스. 우리는 전략 생성 bnl LexA 드라이버 라인 spatiotemporally 독점적으로에서 bnl- LexAoperator (LexAop 또는 LexO)의 다운스트림 배치 취재 원 유전자의 표현을 제어 하는 표시 상피/엽/신경 세포를 표현합니다.

프로토콜

1. 설계 및 건설 gRNA 표정 벡터

1. 정확 하 게는 엑손의 긴 정의 된 영역을 대체 하려면 듀얼 gRNA 접근⁶, 있는 각 gRNA 특별히 선택 된 관심 영역의 두 끝을 타겟팅 할 수 있습니다 사용 합니다. 정확한 유전자 특정 spatiotemporal 표현의 드라이버를 얻으려면 첫 번째 코딩 exon 유전자의 두 gRNA 대상 사이트를 선택 합니다.
2. 초파리 melanogaster, flyCRISPR 최적의 대상 찾기 도구 (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/)를 사용 하 여 gRNA 대상 사이트를 선택 합니다. 다른 사용 가능한 CRISPR 디자인 도구 사용할 수 있습니다 뿐만 아니라, 최적화 CRISPR 디자인 도구 (http://crispr.mit.edu), FlyCas9를 포함 하 여 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9), 및 E-선명 (www.e-crisp.org/E-CRISP).
   참고: gRNA 디자인 및 복제의 다음과 같은 프로토콜 방법 앞에서 설명한^6,7에서 채택 되었다.
   1. 온라인 도구에 제공 된 상자에 실제 시퀀스를 복사 합니다. "선택 게놈"에 대 한 드롭 다운 메뉴에서 가장 최근에 출시 된 초파리 melanogaster 게놈 주석 버전, "r_6,"를 선택 필드 "선택 가이드 길이에서 (nt)," "20." 입력 "모든 CRISPR 대상"을 찾아서 "CRISPR 대상 찾기"를 클릭 하 여 선택 합니다.
   2. "팸"에 대 한 "엄중"와 "NGG만"에 대 한 "최대"를 설정 하 여 모든 후보 gRNA 목표를 평가 합니다. 어떤 잠재적인 오프-대상 또는 대상에서 가능한 최소 수 없이 gRNA 사이트를 선택 하려고 합니다. 웹 도구를 사용 하 여 Doench 그 외 여러분 2014 ⁸ 선택 gRNAs 잠재적인 "좋은" 활동 점수를 설명 합니다.
   3. 동시에, 거기는 없습니다 단일 염기 다형성 gRNA 대상에 주입 (예를 들어, nos Cas9 X 염색체, BL # 54591)에 대 한 선택 된 부모 플라이 라인의 게놈에 확인 합니다. Gratz 외. 2015⁷ 부모 비행 라인에서 게놈 DNA 추출에 설명 된 프로토콜을 따릅니다. PCR 증폭, 관심과 높은 충실도 DNA 중 합 효소;의 순서 측면 뇌관을 사용 하 여 500-1000 nt 지역 약, 시퀀스를 PCR 증폭 제품 확인 합니다.
3. 탠덤 gRNA 식 벡터를 생성 한 결 찰 독립적인 복제 프로토콜⁶ pCFD4 RNA 식 벡터 두 protospacer 시퀀스를 따릅니다. 참고 향상 된 멀티-gRNA 식 벡터 (pCFD5)는 지금 사용할 수 어디에 두는 sgRNAs 강한 U6:3 발기인⁹ (https://www.crisprflydesign.org)에서 표현 됩니다. PCFD4 벡터에는 gRNAs를 복제 하는 DNA 어셈블리 메서드를 사용 합니다.
   1. 디자인 하 고 RNA 식 벡터 pCFD4에 두 protospacer 시퀀스를 도입에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관 순서 (테이블 1A). 앞에서 설명한⁶, 앞으로 뇌관 U6-1 발기인 및 pCFD4; gRNA 코어에 해당 하는 영역을가지고 있는 첫 번째 protospacer 시퀀스가 포함 되어 있는 반전 뇌관 영역에 해당 하는 gRNA 코어와 pCDF4의 U6-3 발기인에 의해 형벌 두 번째 protospacer의 반전 보수 시퀀스를 포함 되어 있습니다.
   2. DNase과 RNase 무료 이중 증류수 (ddH₂O)와 100 μ M에 프라이 머 resuspend 10 μ M 작업 농도 뇌관을 확인 합니다. PCFD4 플라스 미드를 사용 하 여 서식 파일로 하 고 PCR 반응 높은 중 합 효소를 사용 하 여 PCR 반응⁶에 대 한 설정을 권장 합니다.
   3. PCFD4로 증폭 된 제품을, 다음 반응을 설정 하 여 BbsI 효소로 플라스 미드 pCFD4 소화: pCFD4 플라스 미드의 2-5 μ g, 소화 버퍼 x 10의 5 μ, BbsI 효소 및 ddH₂O 50 μ를 최종 볼륨을가지고 1 μ. 부드럽게 튜브를 활용 하 고 간단한 스핀에 의해 바닥에 튜브의 벽에서 흩어져 모든 방울을 수집 하 여 반응 내용을 혼합. 2 h 37 ° C에서 반응 혼합 품 어.
   4. 2 단계와 3 단계에서 소화 제품에서 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 합니다. 충분 한 시간을 완전히 DNA 밴드를 분리에 대 한 전기 영동을 수행 합니다. 잘라 올바른 예상된 제품 제조업체의 지시에 따라 젤 차입 열을 사용 하 여 정화 하기 전에 UV 트랜스-조명 아래 DNA 밴드 크기 ( 재료의 표참조). PCR 제품은 600 해야 혈압, 및 선형화 pCFD4 플라스 미드 ~6.4 kb ⁶이어야 한다.
   5. 제조업체의 지시 당, PCR 튜브에 DNA 어셈블리 반응 설정 ( 재료의 표참조).
   6. 유능한 박테리아 (DH5α 또는 ΔrecA1, ΔendA1와 유사한 긴장) 어셈블리 제품의 2 μ 변환, 암 피 실린에 접시 (100 μ g/mL) 파운드 (LB/앰프) 한 천 배지를 포함 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어. DNA 어셈블리 혼합 유의 특정 박테리아 계통에 독성이 있을 수 있지만 어셈블리 혼합을 diluting 독성을 줄일 수 있습니다.
   7. 밤새 incubated 접시에서 3-4 암 피 실린 내성 식민지를 선택 하 고 접종 3 ml 파운드 100 μ g/mL 암 피 실린, 포함 된 식민지 하룻밤 37 ° C 통에 접종된 박테리아를 성장. 제조업체의 지시에 따라 플라스 미드 소형 예비 키트를 사용 하 여 하룻밤 배양 박테리아에서 플라스 미드를 추출 ( 재료의 표참조).
   8. 탠덤 gRNA 삽입을 포함 하는 올바른 클론에 대 한 화면에 보편적인 뇌관 T3 플라스 미드를 시퀀스. 박테리아는 시퀀스 확인 pCFD4-gRNA 20% 글리세롤에서와 나중에 사용-80 ° C 냉동 고에 게 변환의 글리세롤 재고를 설정 합니다.

2. 설계 및 건설 HDR 기증자

1. 에 대 한 게놈 노크 Gal4 또는 LexA 시퀀스의, 두 상 동 팔에 의해 형벌 transactivator 시퀀스가 포함 된 더블-좌초 HDR 기증자 디자인.
   1. 사용 > 1.5 kb 왼쪽과 오른쪽 상 동 팔 gRNA를 대상으로 측면에 서는 사이트. 확장된 상 동 팔 복구 프로세스 ¹⁰동안 HDR의 효율성을 증가.
   2. PCR 증폭 주입을 위해 선택 된 부모 비행 라인에서 추출한 게놈 DNA (gDNA)에서 상 동 팔 (예, 개-Cas9 (X 염색체)에 BL # 54591). 긴 PCR 확장에 적합 한 감수 핫 스타트 Taq DNA 중 합 효소 효소를 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 시퀀스 확인 합니다.
2. 설계 현장에 gRNA의 retargeting를 방지 하려면 대체 기증자 gRNA 인식 사이트 소개 exogenous 시퀀스에 의해 혼란 된다 그런 방법으로 디자인.
   참고: 변경 상 상속 시스 규정 요소를 방지 하려면 항상 gRNA 인식 사이트 코딩 exon 지역 내에서 선택 합니다.
3. 교체 카세트를 생성 하기 위한 4 개의 세그먼트를 함께 가입 DNA 어셈블리 전략 계획: 5'과 3' 상 동 팔, 중간 세 transactivator DNA 시퀀스 및 선형화 복제 벡터 백본 (예: pUC19 또는 기타 통용 된다 클로닝 벡터). DNA 어셈블리에 대 한 제조업체의 지침에 따라 (재료의 표 참조), PCR 확대 및 각 세그먼트에 대 한 적당 한 뇌관 디자인. DdH₂O. 확인 10 μ M 작업 농도 뇌관 100 μ M에 프라이 머 resuspend 높은 중 합 효소를 사용 하 여 모든 PCR 반응에 대 한. 다음 프로토콜을 따르십시오.
   1. PCR 증폭에서 사용 가능한 벡터 Gal4 또는 LexA 식 카세트 (예를 들어, nls-LexA:p65; 이상적인 Gal4/LexA/QF2 식 플라스 미드를 찾아내고 Addgene 같은 일반적인 자원에서 얻은 수 있습니다) 사용 하는 표 1B에 나열 한 뇌관
      1. 모든 원래 transcriptional 및 post-transcriptional의 규정 transactivator DNA 시퀀스의 표현에 대체 exon 유지 하려면 편집된 게놈 대립 유전자 공상 mRNA 표현 것 이다 그런 방법으로 카세트 디자인의 transactivator 그리고 유전자입니다. 어떤 접합 신호를 유지 하기 위해 타겟된 exon 5'과 3' 끝을 유지 합니다.
      2. 잔여 5' exon와 공상 단백질으로 번역을 방지 하기 위해 transactivator 시퀀스 코딩 사이 T2A 자체 cleaving 펩 티 드 순서를 통합 합니다. (그림 5) 외 인 transactivator 시퀀스 후 번역 정지 codon를 추가 합니다.
   2. PCR 증폭 주입을 위해 선택 된 부모 비행 라인에서 추출한 게놈 DNA (gDNA)에서 상 동 팔 (예, 개-Cas9 (X 염색체)에 BL # 54591) 표 1B에 나열 된 뇌관을 사용 하 여. 높은 중 합 효소를 사용 하 여 다음과 같은 시스템을 사용 하 여 모든 PCR 반응: 반응 버퍼, 10mm dNTPs의 0.5 μ, 10 μ M의 1.25 μ x 5의 5 μ 앞으로 뇌관, 10 μ M의 1.25 μ 반전 뇌관, 서식 파일 DNA, 0.25 μ 고 충실도 DNA 중 합 효소의의 0.5 μ DdH₂오의 16.25 μ
   3. PUC19 같은 선형화 클로닝 벡터를 사용 합니다. 기증자 벡터 수 지금 사용할 수 있습니다. 다음 웹사이트 http://flycrispr.molbio.wisc.edu에서 포괄적인 목록 참조 하십시오.
   4. 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 합니다. 원치 않는 일반적인 밴드 (있을 경우)에서 원하는 밴드의 명확한 분리를 보장 하기 위해 충분 한 시간에 대 한 전기 영동을 수행 합니다. 젤-정화 예상된 DNA 파편. 분 광 광도 계를 사용 하 여 각 순화 된 DNA 파편의 농도 측정 합니다.
   5. 제조업체의 지시에 따라 DNA 어셈블리 반응을 설정 합니다. 단계 3에서에서 선형화 클로닝 벡터 및 대상 조각 믹스와 다음 반응에서 4 단계: 선형의 1 μ ddH와 20 μ를 최종 반응 볼륨을가지고 클로닝 벡터 (50 ng/μ), 각 대상 파편의 2-3 배 초과, DNA 어셈블리 마스터 믹스, x 2의 10 μ < c21 > 2오 품 50 ° c.에서 1 시간 동안 반응 혼합
   6. 변환 어셈블리 제품의 2 μ 유능한 박테리아, 접시에 LB/앰프 한 천 배지 100 μ g/mL 암 피 실린 포함. 또한, X-여자 + IPTG 블루/화이트 심사에 대 한 접시에 추가 합니다.
   7. 밤새 incubated 접시에서 3-4 백색 식민지를 선택 하 고 접종 3 ml 파운드 100 μ g/mL 암 피 실린, 포함 된 식민지 통에 하룻밤 37 ° C에서 성장. 제조 업체에 따라 플라스 미드 소형 예비 키트를 사용 하 여 하룻밤 배양 박테리아에서 플라스 미드 추출의 매뉴얼 ( 재료의 표참조).
   8. 긍정적인 식민지 PCR 또는 제한 소화에 의해 화면.
   9. 시퀀스 마지막 플라스 미드의 HDR 기증자 지역을 확인 합니다. 올바른 변형 세균성 주식 저장 미래 접종-80 ° C에서 20% 글리세롤에 복제 합니다.

3. 태아 주입, 플라이 유전학 및 게놈 편집에 대 한 심사

1. 준비 하는 높은 순수성도 무료 gRNA 식 벡터 뿐만 아니라 HDR 기증자 플라스 미드 플라스 미드 maxiprep를 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조).
2. Nos-Cas9 배아⁶의 생식으로 대체 기증자 (500 ng/μ)와 gRNA 식 플라스 미드 (100 ng/μ)을 주사 공동. 참고: 우리는 주입, 상업 서비스를 사용 하지만 또한 실험실에서이 절차를 수행할 수 있습니다.
3. 유전학 및 검사 (그림 2 및 그림 3) 비행:
   1. 주입 된 배아 개발 성인으로, 각 단일 G 크로스₀ 파리 분산 파리에. 타겟된 대립 유전자를 포함 하는 염색체에 대 한 적합 한 분산을 선택 합니다.
   2. F 1에서 각 G0 자손 CO₂ 패드에 교차 하 고는 stereomicroscope에서 10-20 남성을 무작위로 선택 anesthetize 교차 그들 개별적으로 분산 암컷에 그림 3에서 보듯이.
   3. 때 F2 애벌레 해치 각 십자가에서 단일 F1 아버지를 선택 하 고 단일 비행 게놈 DNA 준비 프로토콜을 사용 하 여 gDNA를 추출:
      1. GDNA 추출 버퍼 준비: 10 mM Tris Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, 상 온에서 저장. 20 mg/mL 가수분해 K 재고 솔루션을 준비 하 고 냉장고에 보관.
      2. 1.5 mL 마이크로 원심 관에 각 비행을 넣고 튜브 라벨. -80 ° C 냉장고에 하룻밤 보관.
      3. 가수분해 공화국의 200 µ g/mL 최종 농도 포함 하는 gDNA 추출 버퍼의 신선한 작업 볼륨 준비
         참고:이 단계에 대 한 오래 된 버퍼를 사용 하지 마십시오.
      4. 액체 분배 하지 않고 버퍼를 첨 벙 첨 벙의 50 μ를 포함 하는 피 펫 팁 10-15에 대 한 각 비행을 뭉 개 버려. 나머지 버퍼 튜브에 분배 하 고 잘 섞으십시오. 20-30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
      5. 가수분해 K. 비활성화를 1-2 분 동안 95 ° C 열 블록에 튜브를 넣어
      6. 10000 x g에 5 분 동안 아래로 회전 합니다. 저장 추가 PCR 분석을 위해 4 ° C에서 준비 합니다.
4. Nos-Cas9 파리, 부정적인 컨트롤 역할에서 gDNA를 준비 하는 같은 메서드를 사용 합니다. 3 단계 PCR 기반 화면 사용 하 여 올바른 "끝을" HDR (그림 2, 그림 5) 식별을 수행 gDNA 템플릿⁵각 F1 남자의. DNA 준비의 1 μ를 사용 하 여 다음 PCR 반응 시스템에서: PCR 주인 혼합 염료, 각 뇌관 (10 μ M), DNA 템플렛의 1 μ 그리고 ddH₂오의 7 μ의 1 μ x 2의 10 μ
5. 그림 5A같이 수행 PCR 뇌관 fwd1 및 rev1 화면을 사용 하 여 삽입 또는 교체;의 존재에 대 한 삽입 또는 3' 영역;에서 교체를 확인 하려면 fwd2 및 rev2 뇌관을 사용 하 여 PCR을 수행 "끝에" HDR (테이블 1C) 확인 M13F와 rev3 프라이 머를 사용 하 여 PCR을 수행 합니다.
6. 확인된 끝 아웃 HDR와 플라이 라인을 유지 하 고 설정 F2 세대에서 균형 잡힌된 주식. 다시 다른 염색체에 어떤 의도 하지 않은 돌연변이 제거 하려면 분산 파리에 outcross.
7. 긴 PCR 증폭에 대 한 설립된 주식에서 높은-품질 gDNA를 준비 (> 800-1000 nt) 높은 충실도 Taq 중 합 효소와 완전히 시퀀스 amplicon 확인 조작된 게놈 영역에서 얻은 amplicons. 또는,를 사용 하 여 원유 gDNA 추출 설명한 이전 짧은 증폭 (< 800 nt), 편집 된 게놈 시퀀스 유효성을 PCR 제품을 중복. 다음 프로토콜을 사용 하 여 좋은 품질 초파리 게놈 DNA를 준비.
   1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 25 성인 파리에 대 한 넣고 적어도 1 시간 동안-20 ° C 또는-80 ° C 냉동 고에서 얼어.
   2. 추가 솔루션의 250 μ (pH 9.0 Tris HCl 0.1 m M, 0.1 m M, EDTA SDS 1%).
   3. Microcentrifuge 튜브에 균질 화 pestles를 사용 하 여 파리를 균질 하 고 얼음에 튜브를 넣어.
   4. 30 분 동안 70 ° C에서 품 어.
   5. 35 KOAc (5 M)의 μ, 동요, 및 잘, 믹스를 추가 하지만 소용돌이 하지 마십시오.
   6. 30 분 동안 얼음에 품 어.
   7. 12000 x g 15 분 동안에 회전.
   8. 1 mL micropipette 신중 하 게 모든 침전 물은 다시 떠나 새로운 튜브만 분명 상쾌한 전송 또는 interphase.
   9. 소 프로 파 놀의 150 μ는 상쾌한에 추가 합니다. 부드럽게 반전에 의해 혼합.
   10. 5 분 동안 10000 x g 에서 회전 합니다.
   11. 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 튜브에 펠 릿을 두고.
   12. 1 mL 70%와 펠 릿을 세척 EtOH.
   13. 5 분 동안 12000 x g 에서 회전 합니다.
   14. 제거는 상쾌한. 공기 건조는 펠 렛 15 ~ 20 분. 펠 릿 이상 건조 하지 마십시오.
   15. DdH₂o.의 100 μ에 펠 릿을 녹
   16. 고 충실도 긴 amplicon 적합 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 (> 800 bp) 전체 편집된 영역을 증폭. 이상적으로, 2 개의 뇌관 벗어나게 게놈 영역 증폭 삽입된 카세트. 젤 PCR 제품을 정화 하 고 앞서 설명한 대로 시퀀스 여러 겹치는 뇌관으로 제품 확인.
8. 해 부 조직/설계 플라이 라인의 배아에서 올바른 spatiotemporal 식 패턴을 확인:
   1. 하이브리드 mRNA 제품 (테이블 1D)의 표현을 확인 하려면 총 RNA에서 RT-PCR을 수행 합니다.
   2. 식의 유효성을 검사 하는 애벌레 조직/배아에 대 한 관심의 mRNA 제품의 제자리에 하이브리드를 수행 합니다.
   3. 시퀀스 확인 끝 아웃 라인 가운데 정확한 조직 관련 spatiotemporal 식 패턴 편집된 라인의 각 교차에 대 한 화면을 LexOGFP 또는 LexO-RFP ( 에 대 한 이진 식 드라이버 획득 LexA 드라이버) (블루밍턴 재고 센터에서 사용 가능) 라인과 LexA 또는 Gal4 형광 현미경 배아, 애벌레, 그리고 성인 조직에 리포터 유전자 발현 제어를 관찰.

결과

이 프로토콜은 bnl 셀⁵표현에 대 한 대상된 이진 식 기자 시스템 특정 생성 하 성공적으로 사용 되었다. Cis-복잡 한 spatiotemporal bnl 식 제어 하는 규제 요소 (CREs) 특징 되지 않습니다. 따라서, spatiotemporal 식 생 bnl 규제 시퀀스의 통제를 달성 하기 위해, bnl 의 첫 번째 코딩 exon만 세균성 LexA transactivator의 순서 교체 하도록 설계 되었습니다. 알려진 초파리 에 최적의 식을 제공 하는 향상 된 nls LexA::p65 카세트 선정 됐다.

대체 전략은 공상을 생성 하기 위한 nls-LexA:p65-bnl 생...

토론

전통적으로, 초파리 증강 트랩은 두 가지 방법으로 생성 되었다. 방법 중 하나는 드라이버의 임의 삽입 포함 (예., Gal4) 이항에 의해 게놈 시퀀스 (예., P 요소 이항)¹ . 또는, 게놈^3,11의 소성 사이트에 통합 될 것 이라고 하는 플라스 미드 구문에 상 상속 증강/발기인 지역의 transcriptional 통제 드라이버 시퀀스를 배치할 수 있습니다. 이러한 방법은 초파리에 Gal4 또는 LexA 증강 트랩의 대형 수영장 생성, 비록 그들은 몇 가지 제한이 있다. 게놈에 있는 P 요소 중재 하는 무작위 삽입 중요 한 cis의 규제 활동 중단 될 수 있습니다-규제 시퀀스. 게놈에 있는 임의의 이항 인 transactivator 식 여러 인접 유전자의 패턴을 보고할...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	복제
LB-Agar	BD Difco	BD  244520	복제
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	분자 생물학
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	분자 생물학
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	분자 생물학
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	분자 생물학
10% SDS	시그마 Aldrich	71736	분자 생물학
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	분자 생물학
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	분자 생물학
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep 키트	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	제한 효소
프라이머	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA 템플릿 및 벡터 gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-high fidelity Taq	NEB NEB	#M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	DNA 어셈블리
pBPnlsLexA:p65Uw	LexA 증폭용	Addgene
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	분자 생물학
2x PCR PreMix, 염료 포함(빨간색)	Sydlab	MB067-EQ2R	분자 생물학
겔 용출 키트	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	분자 생물학
TRI 시약	Sigma-Aldrich		분자 생물학
직접 졸 RNA 정제 키트	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	분자 생물학
OneTaq< / em> 원스텝 RT-PCR 키트	NEB	E5315S	분자 생물학
lexO-< / em > CherryCAAX	Kornberg Lab		플라이 라인
UAS-CD8 : GFP	Kornberg lab		플라이 라인
btl-Gal4	Kornberg lab		Fly line
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
Confocal Microscope SP5X	Leica		Imaging expression pattern
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	플라이 푸싱
스테레오 현미경	Olympus	SZ-61	플라이 푸싱
유봉 마이크로튜브 균질화	Fisher-Scientific	03-421-217	게놈 DNA 분리
NanoDrop 분광 광도계	ThermoFisher Scientific	ND-1000	DNA 정량화