만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

요약

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

초록

만성 림프모구 백혈병 (CLL) 악성 B 세포 복제품 확장 특징 이다 고 서방 국가에서 가장 흔한 백혈병을 나타냅니다. CLL 환자의 대다수는 질병의 나태 한 과정 뿐만 아니라 그들의 백혈병 세포의 anergic 형 B 세포 수용 체 외부 자극에 응답을 참조를 표시 합니다. 우리는 최근 녹음 방송 요인 NFAT2 CLL에 아의 중요 한 레 귤 레이 터가 나타났습니다. 다른 질병에서 녹음 방송 요인의 역할의 분석의 주요 과제는 그것의 특정 대상 유전자의 id입니다. 이 pathogenetic 메커니즘 및 잠재적인 치료 내정간섭의 해명에 대 한 큰 의미입니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 단백질 DNA 상호 작용을 설명 하는 고전적인 기법 이며 포유류 세포에 있는 녹음 방송 요인의 직접적인 대상 유전자를 식별 하는 데 따라서 수 있습니다. 여기, 칩 인간 CLL 세포에 NFAT2의 직접적인 대상 유전자로 LCK 를 식별 하기 위해 사용 되었다. DNA와 관련 된 단백질 포름알데히드를 사용 하 여 가교 된 이며 이후 쥡니다 대략 200-500의 기본적인 쌍 (bp)의 DNA 파편에 의해 전단. NFAT2와 관련 된 상호 연결 된 DNA 파편은 다음 선택적으로 αNFAT2 항 체를 사용 하 여 셀 파편에서 immunoprecipitated. 정화, 후 관련된 DNA 파편은 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해 검색 됩니다. 분명 농축 된 DNA 시퀀스 NFAT2에서 비보에의해 타겟으로하는 게놈의 지구를 대표 한다. DNA와 필요한 항 체의 선택의 적절 한 전단 하는 것이이 방법의 성공적인 응용 프로그램에 대 한 특히 중요 합니다. 이 프로토콜은 대상 유전자와 NFAT2의 직접적인 상호 작용의 데모에 이상적입니다. 그것의 주요 한계는 그대로 생물의 여러 전사 인자 들의 대상 유전자 분석 대규모 분석에 칩을 사용 하는 데 어려움.

서론

만성 림프모구 백혈병 (CLL) 나타냅니다 서방 국가 있는 성인에서 가장 흔한 백혈병,¹세포 성숙 B 표현 CD19, CD23, 그리고 CD5의 고유한 축적을 전시. 대부분의 환자 들은 몇 년에 대 한 구체적인 치료를 필요로 하지 않는다는 나태 한 질병 과정을 전시 한다. 반면, 일부 환자는 면역 화학요법 또는 다른 표적으로 한 치료^2,3즉각적인 치료 내정간섭을 요구 하는 빠른 진행을 보여줍니다. 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요소는 다양 한 발달을 조절 하는 전사 인자와 수많은 셀 종류^4,,56활성화 프로세스의 집합입니다. 우리가 최근에⁷나태 한 질병 가진 환자에서 overexpression 헌법의 및 활성화 CLL 세포에 NFAT2 보여 주었다. 여기, 그것은 라는 아⁷B 세포 수용 체 자극에 응답 하지 않는 상태를 조절. NFAT2에 림프 톨 특정 단백질 티로신 키 니 아 제 (

프로토콜

모든 실험 인간의 소재와 실시 튀빙겐 대학교의 윤리 위원회에 의해 승인 했다 고 서 면된 동의 샘플이이 연구에 기여 하는 모든 환자에서 얻은.

1. 격리와 자극의 Jurkat 세포

참고: 프로토콜을 최적화 하려면 사용 Jurkat 세포 라인을 표현 하는 NFAT2의 높은 수준으로 알려져 있다. 모든 단계는 층 류 두건 아래 수행 됩니다.

1. 물 욕조에 37 ° C로 온난 하 여 10 %FCS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640의 50 mL를 준비 합니다.
2. RPMI 1640의 20 mL에서 37 ° C, 5% CO₂ 셀 문화 플라스 크에 1-2 d⁶ 셀/mL 10 %FCS 1% 페니실린/스 약 2 x 10의 밀도 보충을 위한 Jurkat 세포 문화 (셀 Trypan와 계산 됩니다 블루 얼룩 및 현미경 Neubauer 챔버) 200 x g에 5 분 동안 centrifuging 여 수확 하는 고.
3. 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 10 %FCS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640의 10 mL에 셀 resuspend. 그 후, 기존의 trypan 푸른 얼룩 및 현미경 Neubauer 챔버 ....

결과

그림 1 에서는 CLL 환자 CD19 FITC와 CD5-PE 항 체와 얼룩 후 수행의 모범 흐름 cytometry 분석. 그림 1a 는 CLL 환자의 혈액에 있는 세포의 대부분을 대표는 림프 톨의 게이팅 보여 줍니다. 그림 1b CD19의 비율을 보여줍니다⁺/CD5⁺ CLL 세포, 림프 톨이 예에서 89.03%를 대표 하는. CD19 비율⁺/CD5^- B 세포는 각각 환자에 3.72%.

그림 2 다른 기간 SDS-PAGE 그리고 서쪽 오 점 하 여 평가 대 한 고정 Jurkat.......

토론

성공적인 칩 분석 실험을 수행의 중요 한 단계는 적절 한 항 체의 선택과 과정²⁵전단 chromatin의 최적화. ΑNFAT2 항 체의 선택이이 프로토콜의 개발 중 특히 어려운 것으로 판명. 상업적으로 사용할 수 있는 여러 αNFAT2 항 체와이 작품 부 럽 잘 및 다른 응용 프로그램의 대부분은, 복제 7A6 칩⁷성공적으로 사용 될 수 있는 유일한 항 체 했다. 도 살 일 걸 요 다른 제조 업체에서 동일한 7A6 항 체 칩에 그들의 성과 관하여 중요 한 차이 전시. 주요 도전은 XChIP 프로토콜²⁵에서 사용 하는 고정 과정에 의해 대상 단백질 epitopes의 잠재적인 장애 이다.

절차를 기울이기 chromatin XChIP에서 적절 한 결과 얻기 위한 중요 한 이기도 합니다. 200-500 bp의 조각 크기 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 평.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 X PBS	Sigma Aldrich	D8537
1.5 mL 튜브 쉐이커 Themomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	유사한 기기로 대체 가능
10X Bolt Sample Reducing Agent	Thermo Scientific	B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer	Thermo Scientific	B0002
37 % 포름알데히드 p.a., ACS	Roth	4979.1
4X 볼트 LDS 시료 버퍼	Thermo Scientific	B0007
Anti-NFAT2 항체	Alexis	1008505	Clone 7A6
Anti-NFAT2 항체	세포 신호 전달	8032S	Clone D15F1
Anti-NFAT2 항체 ChIP 등급	Abcam	ab2796	Clone 7A6
big Centrifuge	Eppendorf	5804R	유사한 기기로 대체 가능
CD19-FITC 마우스, Anti-human	BD Biosciences	555412	Clone HIB19
CD5-PE 마우스, Anti-human CD5	BD Biosciences	555353	Clone UCHT2
밀도 구배 매체, Biocoll (밀도 1,077 g/ml)	Merck	L 6115
DNA, LoBind Tube, 1.5 mL	eppendorf	22431021
FBS superior	Merck	S0615
유세포 분석기	BD Biosciences	FACSCalibur	유사한 기기로 대체 가능
Halt Protease 및 Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440
iBlot 2 Gel Transfer Device	Thermo Scientific	IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, 니트로셀룰로오스, 일반 크기	Thermo Scientific
IRDye 680LT 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L), 0.5 mg	LI-COR Biosciences	926-68023
IRDye 800CW 염소 안티 마우스 IgG (H + L), 0.1 mg	LI-COR Biosciences	925-32210
LI-COR Odyssey 적외선 이미징 시스템	LI-COR Biosciences	B446
LightCycler 480 멀티웰 플레이트 96, 흰색	Roche	4729692001	다른 실시간 PCR 기기의 다른 플레이트로 대체 가능
Lysing Solution OptiLyse B	Beckman Coulter	IM1400
M220 AFA 등급 물	Covaris	520101
M220 집속 초음파,	Covaris	, 500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet	Thermo Scientific	12301D	유사한 기기로 대체 가능
MEM, Non-Essential Amino Acids Solution, 100X,	Thermo Scientific	11140050
Columns, Axiovert, 25	Zeiss	451200	유사한 기기
로 대체 가능microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm	Covaris	520045
Neubauer improved counting chamber	Karl Hecht GmbH &                       Co KG	40442012	유사한 기기로 대체 가능
NH4 Heparin Monovette	Sarstedt	02.1064
Nuclease-free water	Promega	P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Scientific	NP0323BOX
Odyssey® 차단 완충액(TBS) 500 mL	LI-COR Biosciences	927-50000
페니실린/스트렙토마이신 100X	Merck	A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix	Quanta Bio	95072-012
PMA	Sigma Aldrich	P1585
Primer CD40L 프로모터 영역 포워드	Sigma Aldrich		5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3'
프라이머 CD40L 프로모터 영역 리버스	시그마 Aldrich		5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'
프라이머 IL-2 프로모터 영역 포워드	시그마 알드리치		5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3'
프라이머 IL-2 프로모터 영역 리버스	시그마 Aldrich		5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'
프라이머 LCK 프로모터 지역 포워드	시그마 알드리치		5'-CAGGCAAAACAGGCACAT-3'
프라이머 LCK 프로모터 영역 리버스	시그마 Aldrich		5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control	Cell Signaling	# 3900S	Clone DA1E
Real-time PCR instrument	Roche	LightCycler 480	유사한 기기로 대체 가능
롤러 믹서	Phoenix Instrument	RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Scientific	61870010
Safety-Multifly-needle 21G	Sarstedt	851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925
Shaker Duomax 1030	Heidolph Instruments	543-32205-00	유사한 기기로 대체 가능
소형 Centrifuge	Thermo Scientific	Heraeus Fresco 17	유사한 기기로 대체 가능
Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070
ß-Mercaptoethanol	Thermo Scientific	21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)	Cell Signaling	#12498
Trypan Blue solution	Sigma Aldrich	93595-50ML

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