Method Article

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 하에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 각 막 limbal 상피 줄기 세포를 분화 하는 간단한 2 단계 방법을 소개 합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 각 막 세포 치료 이용에 적용 가능한 임상 질 세포의 비용 효율적인, 대규모 생산 가능

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상피 각 막 limbal 줄기 세포 (LESCs)는 각 막 상피를 지속적으로 갱신 하 고 따라서 각 막 항상성 및 시각적 선명도 유지 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-각 막 세포 대체 요법에 대 한 유망한 셀 소스를 제공 하는 파생 된 LESCs. 정의 되지 않은, xenogeneic 문화와 차별화 조건 연구 결과에서 변형 원인과 hPSC 유래 치료제의 임상 번역을 방해. 이 프로토콜 hPSC LESC 차별화 이종-및 피더 세포 무료 조건 하에서 재현 하 고 효율적인 방법을 제공합니다. 첫째, 단층 문화 undifferentiated hPSC 재조합 laminin-521 (LN-521)에 정의 된 hPSC 매체의 차별점에 대 한 높은-품질 시작 물자의 강력한 생산 위한 기초 역할을 합니다. 둘째, 신속 하 고 간단한 hPSC LESC 차별화 방법 24 일만에 LESC 인구를 생성합니다. 이 방법은 작은 분자로, 정의 된 각 막 상피 분화 매체에 LN-521/콜라겐 IV 조합 매트릭스에 부착 문화 단계 다음에 4 일간 표면 ectodermal 유도 포함 합니다. Cryostoring와 확장된 차별화 더 세포 인구를 정화 하 고 대량 세포 치료 제품에 대 한 셀의 은행 수 있습니다. 결과 높은 품질 hPSC LESCs 치료 limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD) 각 막 표면 재건을 위한 잠재적인 새로운 치료 전략을 제공 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

안구 표면에 투명 한 각 막 빛이 망막을 입력을 허용 하 고 눈의 굴절 힘의 대부분을 제공 합니다. 바깥쪽 레이어 층 화 각 막 상피를 지속적으로 limbal 상피 줄기 세포 (LESCs)에 의해 다시 생성 됩니다. LESCs corneoscleral 접속점1,2limbal 틈새의 기저 레이어에 상주합니다. LESCs 부족 구체적이 고 독특한 마커, 그래서 그들의 식별 putative 마커 집합의 더 광범위 한 분석을 요구 한다. 상피 녹음 방송 요인 p63, 및 특히 N 말기 잘린 p63의 알파 isoform의 (ΔNp63α), 관련 긍정적인 LESC 마커3,4으로 제안 되었습니다. LESCs의 비대칭과 자기 갱신, 하지만 또한 centripetally 및 anteriorly 마이그레이션하는 자손을 생산 수 있습니다. 세포 막 표면으로 진행 그들은 점차적으로 그들의 stemness 잃게 되 고 마지막으로 지속적으로 각 막 표면에서 손실 표면 편평 세포에 분화 말기.

각 막 층의 손상이 심각한 시각 장애, 이어질 수 있습니다 그리고 각 막 결함은 이렇게 전세계 시각 손실의 주요 원인 중 하나. Limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD)는 limbus 질병 또는 conjunctivalization, 비전5,6의 후속 손실과 각 막 표면의 opacification 외상에 의해 소멸 됩니다. 세포 대체 요법 사용 헌 또는 수용자 limbal 이식 LSCD4,7,,89환자에 대 한 치료 전략을 제공 합니다. 그러나, 그리고 건강 한 눈에 합병증의 위험 곰 수확 자가 이식 기증자 조직 공급 부족 이다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 특히 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 임상 관련 종류의 세포, 각 막 상피 세포를 포함 하 여 무제한 원천이 될 수 있습니다. 따라서, hPSC에서 파생 된 LESCs (hPSC-LESCs) 안구 세포 대체 요법에 대 한 매력적인 새로운 셀 소스를 나타냅니다.

전통적으로, undifferentiated hPSC 문화 메서드 및 LESCs 그들의 분화 프로토콜 정의 되지 않은 피더 세포, 동물 세라, 바른된 미디어 또는 양수 막10,11, 의 사용에 의존 해야 12 , 13 , 14 , 15. 최근, 노력 더 안전한 세포 치료 제품으로 표준화 하 고 이종 문화 및 분화 프로토콜에 대 한 검색 하 라는 메시지가 있다. 그 결과, undifferentiated hPSCs의 장기 문화에 대 한 여러 가지 정의 및 이종 무료 방법을 상용16,,1718지금 있다. 연속체, 각 막 상피 운명에 hPSCs 가이드 분자 신호에 의존 하는 프로토콜은 최근 되었습니다 감독된 차별화 도입19,20,,2122, 23. 아직 이러한 프로토콜의 많은 소재, 또는 차별화에 대 한 복잡 한, xenogeneic 증가율 칵테일을 시작으로 중 정의 되지 않은, 피더 기반으로 hPSCs를 사용.

이 프로토콜의 목적은 제공 하는 강력 하 고, 최적화, 이종 하-급지대 무료 hPSC 문화 방법 및 각 막 LESCs에 후속 차별화. 단층 문화 정의 알 부 민 무료 hPSC 매체 (특히 필수 8 플렉스)에 laminin-521 (LN-521) 매트릭스에 만능 hPSCs의 차별점에 대 한 균질 시작 물자의 급속 한 생산을 허용 한다. 그 후, 간단한 2 단계 차별화 전략 hPSCs 서 스 펜 션, 부착 차별화 LESCs 뒤에 표면 ectodermal 운명 향해 가이드. 24 일 이내 > 65% ΔNp63α를 표현 하는 세포 인구를 얻을 수 있습니다. Xeno 급지대 무료 프로토콜 셀 라인 특정 최적화에 대 한 어떤 요구 든 지 없이 여러 hPSC 라인 (hESCs 및 hiPSCs), 테스트 되었습니다. 주말 무료 유지 보수, 뿌리고, cryostoring 및 hPSC LESC 형질 여기 설명에 대 한 프로토콜 사용에 대 한 높은-품질 LESCs의 큰 배치의 생산 임상 또는 연구 목적.

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Protocol

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탐 페 레 대학의 인간 배아에 대 한 연구를 수행 하 핀란드 (Dnro 1426/32/300/05) 법의학 담당 국가 기관의 승인이 있다. 연구소는 또한 파생, 문화, 및 hESC 라인 (Skottman/R05116)를 차별화 하 고 안과 연구 (Skottman/R14023)에서 hiPSC 라인을 사용 하는 Pirkanmaa 병원의 윤리 위원회의 지원 문이 있다. 아니 새로운 셀 라인은이 연구에 대 한 파생 되었다.

참고: 설명 프로토콜 기반으로 특정, 상용 hPSC 및 각 막 상피 분화 미디어 합니다. 제조 업체/공급 업체 정보 및 카탈로그 번호 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

1. 이종 급지대 무료 hPSC 문화 구축

  1. 준비
    1. 인간의 재조합 laminin-521 (LN-521)와 코트 24-잘 접시. 첫 번째 급지대 무료 (FF) 통과 위해 사용 하 여 LN-521 1.09 µ g/c m2의 농도에 그리고 0.55 µ g/c m2 에서 다음과 같은 구절에 대 한. 제안 된 LN-521 농도 성공적인 FF 문화에 대 한 시작 지점으로 제공 하지만 낮아질 수 있습니다.
      1. LN-521 유리병 제조 업체에 의해 지시 대로 4 ° C에서 천천히 녹여
        참고: 적절 하 게 처리 LN-521 솔루션 저장 됩니다 4 ° C에 녹고 후 최대 3 개월.
      2. 코팅 솔루션을 준비 하려면 희석 LN-521 재고 솔루션의 적절 한 금액으로 1 x Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS) 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 잘 당 300 µ L의 총 볼륨을 포함 하.
      3. 피펫으로 웰 스, 코팅 솔루션 parafilm, 함께 잘 플레이트 및 4 ° c.에서 밤새 품 어 코팅된 판 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장할 수 있습니다.
        (선택 사항): 또는 빠른 코팅 프로토콜에 대 한 37 ° C, 5% CO2에서 2 시간을 위한 코팅 솔루션 잘 접시를 품 어.
    2. 제조업체에서 지시 제공된 보완과 기저 매체를 보완 하 여 hPSC 문화 매체 (특히 필수 8 플렉스)를 준비 합니다. 추가 50 U/mL 페니실린-스. 정립은 빛과 높은 온도에 민감한 note. 보충을 해 동 하 고 따뜻한 실내 온도 (RT), 미디어 빛 으로부터 보호. 보충된 hPSC 매체를 사용 하 여 보충 날짜 로부터 2 주 이내.
  2. LN-521에 FF 문화는 hPSC 전송
    1. 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
    2. 급지대 레이어 (예: 사 인간의 포 피 (hFF) 또는 마우스 미 발달 섬유 아 세포)에 표준 문화 시스템 또는 표준 방법론을 사용 하 여 다른 FF 문화 시스템에서 통로 hPSCs. 예를 들어 hPSC 식민지 hFF 피더 세포에 교양 메스와 작은 조각과 조각 다음 바늘 팁과 분리 하는 해 부 수 있습니다. 인간의 PSCs FF 문화 시스템을 사용 하 여 양식 메서드 또는 사전 효소 치료 없이 뿌리고 클러스터를 사용 하 여 전송할 수 있습니다.
    3. 24-우물에서 LN-521 코팅 솔루션을 제거 하 고 잘 당 1 mL 미리 데워 진된 hPSC 매체를 추가.
      참고: LN-521 건조 시 비활성화 것으로 건조 우물을 허용 하지 않습니다.
    4. LN-521 코팅 24-웰 스는 피 펫과 hPSC 매체에 식민지 조각/셀 클러스터를 전송 합니다. 잘, 우물과 밀 피하 당 20-30 식민지 조각 전송 합니다.
    5. 대체 매체 hPSC 매체의 1 mL 하루 전송 및 매일 그 후 후. 문화 뿌리고 3-4 일 후 hPSCs 부드러운, undifferentiated 형태와 식민지를 밖으로 성장에 대 한 준비가 되었습니다. 참고로, 그림 1B 를 참조 (첫번째 이미지). 첫 번째 FF 통과 위해 완전히 confluent 단층 성장 식민지 수 없다는 하지만 문화는 식민지는 1 m m의 대략적인 크기를 도달 하는 때 passaged 한다.
  3. 뿌리고 및 FF hPSC 문화의 유지 보수
    1. 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
    2. 두 번째 FF 통과 이후,에서 문화는 80-100 %confluency 도달 했습니다 때 FF hPSCs 통로. 새로운 LN-521에 통로 FF hPSCs 24-잘 접시 undifferentiated 형태와 높은 품질 문화를 유지 하 고 달성 먹이 처방 주말 무료 단일 셀 뿌리고 (월요일과 목요일)에 일주일에 두 번을 사용 하 여 코팅. 자세한 내용은,18,,2425를 참조 하십시오.
      1. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +없이 1 x DPBS의 1 mL로 두 번 FF hPSCs 린스.
      2. 37 ° C, 5% CO2에서 잘 당 500 µ L 잠복기 FF hPSCs 이종 무료 트립 신-EDTA (특히 TrypLE 선택 효소)와 분리 합니다. 않을 최적의 부 화 시간에 대 한 셀을 모아만 분리 하지 수 있습니다. 이 보통 37 ° C, 5% CO2 에서 3 분 소요 (5 분을 초과 하지 않는).
      3. Xeno 무료 트립 신-EDTA를 제거 하 고 잘 정의 된 트립 신 억제제의 당 500 µ L를 즉시 추가.
      4. 주의 아직 철저 한 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 pipetting FF hPSCs을 분리 합니다. 미리 데워 진된 hPSC 매체를 포함 하는 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 FF hPSC 정지를 전송.
      5. HPSC 매체의 1 mL와 함께 우물을 세척 하 고 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브를 세척 매체를 추가.
      6. 300 x g에 5 분에 대 한 단일 세포 현 탁 액을 원심 셀 펠 릿을 발음 하 고, 1 mL 미리 데워 진된 hPSC 매체에 resuspend.
      7. Hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 셀을 계산 합니다.
      8. 24-우물에서 LN-521 코팅 솔루션 (0.55 µ g/c m2)를 제거 하 고 1.2.3에서 hPSC 매체를 추가.
      9. 플레이트 FF hPSCs 0.55 µ g/c m2 LN-521에 40000-50, 000 셀/c m2의 세포 조밀도에 24-웰 스 코팅.
      10. 보통을 신선한 hPSC 매체 뿌리고, 후 일 그 후 일요일을 제외한 매일 바꿉니다.
    3. 세포 감 별 법 문화에 도달 했습니다 때 뿌리고, 후 3-4 일 사용 준비가 > 85 %confluency. hPSCs의 높은 품질을 보장에 대 한 이전 작품18,,2425에 자세히 설명 된 특성화 방법을 참조 하십시오. 그것은 karyotypic 변경 되지 않도록 하려면 뿌리고 단일 셀을 사용 하 여 ff로 시스템에 통로 레벨 15까지 문화 hPSCs만을 권장. 만 높은-품질, undifferentiated hPSCs를 사용 하 여 차별점에 대 한 자료를 시작으로.

2. 감독 차별화 및 hPSC에서 파생 된 LESCs의 Cryopreservation

  1. 준비
    1. Xeno 무료 기저 유도 매체 (기저 유도 매체) 준비: 보충 Dulbecco의 15% 이종 무료 혈 청 대체가 글의 중간 (특히 녹아웃 DMEM) 수정 (spesifically CTS 녹아웃 SR XenoFree), 2 m m L-글루타민, 0.1 m m 2- mercaptoethanol, 1% 비 본질적인 아미노산, 고 50 U/mL 페니실린-스. 기저 유도 매체를 사용 하 여 2 주 이내.
    2. 현 탁 액 문화에서 각 막 유도 대 한 미디어를 준비 합니다.
      1. 제 1 일: 5 μ M blebbistatin와 기저 유도 중간 보충.
      2. 주 2: 10 µ M SB-505124 및 50 ng/mL 인간 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF)와 기저 유도 중간 보충.
      3. 하루 3-4: 25 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 4 보충 기저 유도 매체 (BMP-4).
    3. 각 막 상피 분화 매체 (차별화 매체, 특히 CnT-30) 부착 문화에 대 한 준비: 제조업체의 지침에 따라 기저 중간에 보충을 추가 하 고 50 U/mL 페니실린-스 추가.
      참고: 차별화 매체 정립은 빛에 민감합니다. 보충된 차별화 매체를 사용 하 여 보충 날짜 6 주 이내.
    4. 100 m m 조직 문화 요리 부착 차별화 코트 (단계 2.3 참조) (열 IV) 5 µ g/c m2 인간의 태 반 콜라겐 유형 IV의 혼합물 및 0.5 µ g/c m2 LN-521 1 x DPBS 포함 하는 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 총에에 희석 접시 당 5 mL의 코팅 볼륨입니다. 준비 하 고 열 IV와 코팅 및 LN-521 1.1.1.3에 설명 된 대로 저장.
  2. 단계 i: 각 막 유도 현 탁 액 문화에서
    1. 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
    2. 단계 1.3.2.1–1.3.2.6의 설명 대로 FF hPSCs 이종 무료 트립 신-EDTA와 단일 세포 현 탁 액을 분리 합니다. 셀, 그리고 2-3 배 낮은 첨부 6 잘 플레이트, 5 μ M blebbistatin EB 형성을 유도 하는 것으로 보충 하는 기저 유도 매체의 3 mL의 총 볼륨에서에서 하룻밤 37 ° C, 5% CO2 (주 1) 당 106 셀을 배포.
    3. 다음 날 (주 2), 매체를 제거 하 고 기저 유도 매체 10 µ M SB-505124 및 50 ng/mL bFGF와 보충의 3 mL을 바꿉니다.
    4. 다음에 2 일 (3-4 일), 매체를 제거 하 고 기저 유도 매체 25 ng/mL BMP-4 보충의 3 mL을 바꿉니다.
  3. 단계 II: 각 막 분화 부착 문화에
    1. 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
    2. 5 일에 100 m m 조직 문화 요리 5 µ g/c m2 열 4 및 0.5 µ g/c m2 LN-521 코팅에 EBs 다운 접시.
      1. 100 m m 조직 문화에서에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 접시 당 미리 따뜻하게 차별화 매체의 10 mL을 추가.
        참고: 건조 LN-521 건조 시 비활성화 것으로 요리를 허용 하지 않습니다.
      2. EBs에서에서 전송 한 6 잘 플레이트 잘 2 세 100 m m 조직 문화 요리 (약 50 c m2당 EBs) pipetting으로. 부드러운 진동으로 EBs를 균등 하 게 배포 합니다.
    3. 37 ° C, 5% CO2, 대체 매체 10 mL 신선한 차별화 매체의 다음 2.5-3 주 (월요일, 수요일 및 금요일)에 주 당 세 번에 부착 문화에 세포를 유지 합니다. 단계 대조 현미경을 사용 하 여 올바른 상피 형태학의 출현에 대 한 정기적으로 셀을 확인 합니다.
  4. 단계 III: 곳을 알아내는-뱅킹 hPSC 파생 된 LESCs
    1. 사전에 모든 필요한 재료와 미리 냉장 해야 cryopreservation 매체를 제외 하 고 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
    2. Xeno 무료 트립 신-EDTA와 hPSC에서 파생 된 LESCs를 분리 하 고 단계 1.3.2.1–1.3.2.6, 하지만 차별화 매체를 사용 하 여 FF hPSCs에 대 한 지시는 셀의 개수.
      참고: hPSC에서 파생 된 LESCs에 대 한 최적의 부 화 이종 무료 트립 신-EDTA와 시간은 오래 (약 5 분). Xeno 무료 트립 신-EDTA와 정의 된 트립 신 억제 물 3 mL를 사용 하 여 100 mm 접시 당.
    3. 계산 후 셀, 300 x g에 5 분 동안 반복 원심 분리 매체를 발음 하 고 미리 냉장, 이종 무료 hPSC cryopreservation 매체에 셀 펠 릿 resuspend. 피펫으로 각 cryotube 1 mL cryopreservation 매체에 0.5 ~ 1 x 106 셀이 포함 되도록 단일 cryotubes에 정지를 셀.
    4. 냉동 컨테이너와 전송 즉시 (5 분) 이내-80 ° C에 하룻밤 튜브를 놓습니다.
    5. 다음 날, 장기 저장을 위한 액체 질소에 튜브를 전송 합니다.
  5. 단계 IV: 녹고 cryopreserved hPSC-LESCs
    1. 녹고, 이전 5 µ g/c m2 열 4 및 0.5 µ g/c m2 LN-521 요리/잘 플레이트 코트.
    2. 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
    3. 요리/우물에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 미리 따뜻하게 차별화 매체의 적절 한 볼륨을 추가.
      참고: 건조 LN-521 건조 시 비활성화 것으로 요리를 허용 하지 않습니다.
    4. RT에 신속 하 게 세포를 해 동 하 고 즉시 미리 따뜻하게 차별화 매체의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
    5. 300 x g 5 분 발음, 그리고 차별화 매체 cryopreservation 매체를 제거 하는 펠 릿 resuspend 세포 현 탁 액을 원심.
    6. 요리/웰 스 5 µ g/c m2 열 4 및 0.5 µ g/c m2 LN-521, 40000-50, 000 셀/c m2의 조밀도에 차별화 매체에 코팅에 셀 접시 37 ° C, 5% CO2, 대체 차별화 중간 3 회에서 세포를 유지 합니다.

3입니다. hPSC에서 파생 된 LESCs의 형질

  1. 질적 면역 형광 분석
    1. 면역 형광 검사에 대 한 5 µ g/c m2 열 4 및 0.5 µ g/c m2 LN-521 및 플레이트/해 동 hPSC-LESCs 40의 밀도에서 차별화 매체에 24 또는 12 잘 플레이트 웰 스 코트 000-50 000 셀/c m2.
    2. 문화는 confluency에 도달, 4 %paraformaldehyde (PFA)와 셀 수정: 웰 스 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +1 x DPBS로 두 번 세척 하 고 4 %15-20 분을 품 어 PFA 실시간에 그 후, 모든 PFA 잔류물을 제거 하려면 1 x DPBS 두 번 씻어. 잘 당 솔루션의 사용 0.5-1 mL.
      참고: 고정 된 셀 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 x DPBS에 최대 1 주일 이전에 얼룩.
      주의: PFA 유독 하 고 부식성 이다입니다. PFA 증기 두건에서 처리 하 고 보호, 눈 보호, 그리고 장갑 착용.
    3. 1 x DPBS 발음 및 1 x DPBS에 Triton X-100 0.1%와 10-15 분 동안 배양 하 여 세포 막 permeabilize.
    4. 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 1 x DPBS에 0.5 %BSA 실시간 준비 1 차적인 항 체 희석에서 1 x DPBS에서 1 h를 위한 잠복기 하 여 0.1% 트라이 톤 X-100 및 블록 특이 항 체 바인딩 사이트를 발음.
      참고: 권장 기본 항 체 표 1 을 참조 하십시오.
    5. 3 %BSA 발음 및 4 ° c.에 하룻밤 적절히 희석된 1 차 항 체로 품 어
    6. 3 웰 스 워시 x 5 분 1 x DPBS. 1 x DPBS에 0.5 %BSA 이차 항 체 희석을 준비 합니다.
      참고: 권장된 2 차 항 체에 대 한 표 1 을 참조 하십시오.
    7. 1 x DPBS를 발음 하 고 빛 으로부터 보호 하는 RT에 1 시간을 위한 적당 한, 적절 하 게 희석 이차 항 체와 함께 품 어.
      참고:이 단계에서 샘플 형광 염료의 퇴색을 방지 하기 위해 빛 으로부터 보호 유지.
    8. 3 웰 스 워시 x 1 x DPBS와 5 분을 마지막으로 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 형광 미디어를 마운트 마운트 counterstain 핵. DAPI는 제조업체의 지침에 따라 별도로 사용 하거나 설치 매체에 포함 될 수 있습니다. 장소 라운드 coverslips (직경 19 m m와 13mm 대 12-24-잘 접시, 각각)에 각 잘. 건조 및 탑재 된 샘플의 저장에 관한 제조업체의 지침을 따릅니다.
    9. 형광 현미경으로 얼룩진된 셀을 이미지.
  2. 정량적 면역 형광 분석
    1. HPSC에서 파생 된 LESCs 개체 안경에의 cytospin 샘플을 준비 합니다.
      1. 이종 무료 트립 신-EDTA와 hPSC에서 파생 된 LESCs를 분리 하 고 단계 2.4.2에서에서 지시 하는 대로 셀을 카운트.
      2. 후, 미리 냉장된 1 x DPBS와 300 x g. 조정 샘플 볼륨에서 5 분 동안 원심 분리기와 주어진된 cytocentrifuge, 예를 들면 의 제조업체의 지침에 따라 세포 농도 50000-100000 셀 추가 150 µ L의 샘플 볼륨에서 합니다.
      3. 개체는 cytocentrifuge 예: 28 x g 및 즉시 4 %15-20 분에 대 한 수정 프로그램에서 5 분와 안경 아래로 셀 스핀 PFA 실시간에서 1 x DPBS에서 권장된 회전 시간과 속도 대 한 주어진된 cytocentrifuge의 설명서를 참조 하십시오.
    2. 소수 성 원 샘플을 둘러싸고 경제적인 연습에 대 한 작은 물방울에 얼룩 수행 하 고 단계 3.1.3–3.1.8 사용 액체 차단 펜에 설명 된 대로 cytospin 샘플을 얼룩이 지기를 진행 합니다. 세척 과잉 항 체와 최소한의 배경 얼룩의 효율적인 제거를 보장 하기 위해 슬라이드 홀더, 컨테이너에서 수행할 수 있습니다. DAPI와 핵 counterstain 그리고 형광 미디어, coverslips 커버 장착으로 얼룩진된 샘플을 탑재. 건조 및 탑재 된 샘플의 저장에 관한 제조업체의 지침을 따릅니다.
    3. 형광 현미경의 예를 들어 10 배 확대를 사용 하 여 무작위로 선택 된 위치에서 샘플 당 5-10 이미지를 캡처하십시오.
    4. 예: ImageJ 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/) 도구와 총 (DAPI 긍정적인) 셀에 관하여 긍정적으로 얼룩진된 세포의 백분율을 견적 한다. 선호 분석 > 샘플 당 500 셀.
      1. ImageJ 소프트웨어에서 분석할 이미지를 엽니다. 이미지와 잡음 제거를 기본 가우스 블러와 함께 필터를 중복.
      2. 임계값을 만듭니다. 긍정적으로 얼룩진된 세포 핵의 최적의 선택으로 임계값을 조정 하 고 적용. 중복된 이미지 이진 보기 이제 변환 됩니다.
      3. 프로세스 이진 처리로 바이너리 이미지 도구 "채우기 구멍"와 "분수령" 자동으로 단일 핵을 대표 하는 병합 된 영역을 별도 것입니다.
      4. "입자 분석" 도구를 사용 하 여 명령을 적용 시 열립니다 ROI 관리자 창 관심사 (ROIs)의 자동으로 목록 영역을. 바이너리 이미지를 닫습니다.
      5. "모두 표시" ROI 관리자에서 선택 하 여 원본 이미지에 ROIs를 시각화 합니다. 얼룩진된 세포 핵의 올바른 선택을 확인 하 고 필요한 경우 수동으로 제거 하 고 개별 선택 추가.
  3. 교류 cytometry 분석
    1. P63α 식 수준 확인, cytometry에 대 한 셀을 얼룩.
      1. 이종 무료 트립 신-EDTA와 hPSC에서 파생 된 LESCs를 분리 하 고 단계 2.4.2에서에서 지시 하는 대로 셀을 카운트.
      2. 워시 1 mL로 두 번 셀 300 x g. 수정에서 5 분 동안 원심 및 4 ° c.에 20 분에 대 한 준비-사용 고정/permeabilization 솔루션 permeabilize 미리 냉장 1 x DPBS 그 후 세척 1 mL로 두 번 셀은 미리 세척 버퍼 permeabilizing x 1 차게.
        참고:이 단계에서 계속 셀 4 ° C에서 또는 얼음에 달리 명시 되지 않는 한.
      3. 주의: 고정/permeabilization 솔루션은 4.2% 포름알데히드를 포함 되어 있습니다. 증기 두건에서 위험한 솔루션을 처리 하 고 보호, 눈 보호, 그리고 장갑 착용.
      4. 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 샘플 나눕니다. 각 샘플은 100000-200, 000 셀 포함 되어야 하 고 워시 버퍼 x 1의 약 100 µ L를 샘플 볼륨을 조정 합니다.
      5. 형광 색소 활용 된 항 체를 FACS p63-α의 2 µ L 추가 (권장된 하는 항 체에 대 한 참조 테이블의 장비 및 재료) 샘플 튜브로. 하나의 샘플 흠 없는 부정적인 제어 역할을 남겨 주세요. 소용돌이 샘플 1 h RT, 빛 으로부터 보호에 대 한 품 어 고.
      6. 워시 버퍼 x 미리 냉장된 1의 1 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 마지막으로, resuspend 버퍼의 300 µ L와 펠 릿. 튜브를 저장 얼음, 빛 으로부터 보호 합니다.
    2. 교류 cytometer와 샘플을 분석 합니다. 흠 없는 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여 올바른 세포 인구의 게이팅에 대 한 형광 배경 신호를 제외. 최소 10000 p63-α의 분석-셀 스테인드. 자세한 기술 구현에 대 한 주어진된 교류 cytometer의 사용자 설명서를 참조 하십시오.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HPSC-LESCs에 hPSCs에서

FF hPSCs cryostoring hPSC-LESCs로의 분화 유도에서 전체 프로세스는 약 3.5 주 걸립니다. 그것의 주요 단계를 강조 차별화 방법의 도식 개요 그림 1A에 제공 됩니다. 그림 1B 는 프로토콜의 여러 단계에서 세포 인구의 일반적인 형태학을 보여줍니다. 제공 된 데이터 Regea08/017 hESC 라인과 UTA.04607.WT hiPSC 선, 파생와 앞에서 설명한26,,2728탐 페 레, 핀란드의 대학에서 특징 모두 얻을 수 있습니다.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 예상된 결과 성공적이 고 강력한 세대 LESCs의 FF hPSC의 단일 세포 현 탁 액에서 약 3.5 주 이내. 각 막 상피 표면 ectoderm29에서 개발, 프로토콜의 첫 번째 단계는이 혈통으로 hPSCs을 운영 목표로 합니다. 성장 인자 (TGF-β) 베타 길 항 제 SB-505124과 bFGF와 짧은 24 h 유도 세포 표면 ectoderm 향해 밀어 48 h mesodermal BMP-4 큐 다음 ectodermal 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 화학적 정의 차별화 매체와 열 4/LN-521 조합 매트릭스에 다음 부착 분화 단계 추가 안내 LESCs로 차별화 하는 데 사용 됩니다.

시작 자료 (FF hPSCs)의 높은 품질은 성공적인 차별화 중요 합니다. 만 FF hPSC 문화 합류 근처 및 미 분화 형의 100%를 사용 한다. 일반 hPSC karyotyping은 권장, 성장과 감 별 법 이점

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

연구 기술 및 혁신, 핀란드 (부여 번호 297886)의 아카데미, 인간의 예비 부품 프로그램 Tekes, 핀란드 자금이 체 기구에 의해 지원 되었다 핀란드 눈 및 조직 은행 재단 및 핀란드 문화 재단. 저자는 생물 의학 실험실 기술자를 Outi Melin, 한 나 Pekkanen, 엠마 Vikstedt, 및 Outi Heikkilä 우수한 기술 지원 및 세포 배양에 기여 감사합니다. 교수 카트리나 Aalto-Setälä 형광 이미징 장비를 제공 하 고 사용 하는 hiPSC 라인 BioMediTech 이미징 핵심 시설 제공을 위한 인정 됩니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Gibco를
strong>Material/Reagent
2+ 및 Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm 세포 배양 접시Corning CellBIND#3296배양 용기 형식 분화
12웰 플레이트Corning CellBIND#3336IF 시료용 배양 용기 형식
24웰 플레이트Corning CellBIND#3337IF 시료용 배양 용기 형식
2-메르토에탄올Gibco#31350-010
6웰 플레이트, 초저 부착Corning Costar#3471현탁액 유도용 배양 용기 형식 culture
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgThermoFisher Scientific#A-21202IF
Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgThermoFisher Scientific#A-21206에 대한 2차 항체
ThermoFisher Scientific#A-11057IF
Alexa Fluor 568 anti-mouse IgThermoFisher Scientific#A-10037
IF Basic 섬유아세포 성장인자 2차항체 (bFGF, human)PeproTech Inc.#AF-100-18B동물이 없는 재조합 인간 FGF 베이직(154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 솔루션BD Biosciences#554722유세포 분석을 위한 고정 및 투과화 솔루션
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723유세포 분석을 위한 세척 버퍼
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Cytokeratin 12 항체Santa Cruz Biotechnology#SC-17099에 대한 1차
항체R& D Systems#MAB3164
Cytokeratin 15 항체ThermoFisher Scientific#MS-1068-P
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30부착성 hPSC-LESC 분화를 위한 배양 배지
겐 IV형(인간)Sigma-Aldrich#C5533인간 태반 콜라겐 IV형
CoolCell LX 냉동 용기Sigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure 튜브Sarsted#72.380hPSC-LESC 동결 보존을 위한 1.6mL 극저온 튜브
정의 트립신 억제제Gibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
라미닌 521Biolamina#Ln521인간 재조합 laminin 521
Δ NP63&알파; 항체BioCare Medical#4892에 대한 1차 항체
D Systems#AF1759에 대한 1차 항체
; 항체세포 신호 기술#ACI3066A에 대한 1차 항체
; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)세포 신호 기술#56687p63-α 유세포 분석을 위한 PE 접합 항체
PAX6 항체Sigma-Aldrich#HPA030775에 대한 기본 항체
Lonza#17-602E
파라포름알데히드(PFA)시그마-알드리치#158127IF ProLong
Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI for hard IF
PSC 동결 보존 키트Thermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' 장착 s 변형 된 독수리' s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM 비필수 아미노산Gibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787용 투과화제
#H-1200IF
strong>NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
cytocentrifuge, e.e. CellSpin IITharmac
유세포분석기, 예: BD Accuri C6BD Biosciences
형광 현미경, 예: Olympus IX 51Olympus
함유한1x DPBS Ca 부착성 hPSC-LESC를 위한 IF Alexa Fluor 568 anti-goat IF Cytokeratin 14 항체 IF 에 대한 기본 항체 IF 에 대한 기본 항체 콜라 IF OCT3/4 항체 R& IF p63&alpha IF p63-&alpha IF 페니실린/스트렙토마이신 IF VectaShield Vector Laboratories<

References

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Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

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