이 프로토콜은 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 하에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 각 막 limbal 상피 줄기 세포를 분화 하는 간단한 2 단계 방법을 소개 합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 각 막 세포 치료 이용에 적용 가능한 임상 질 세포의 비용 효율적인, 대규모 생산 가능
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방법 논문
임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
상피 각 막 limbal 줄기 세포 (LESCs)는 각 막 상피를 지속적으로 갱신 하 고 따라서 각 막 항상성 및 시각적 선명도 유지 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-각 막 세포 대체 요법에 대 한 유망한 셀 소스를 제공 하는 파생 된 LESCs. 정의 되지 않은, xenogeneic 문화와 차별화 조건 연구 결과에서 변형 원인과 hPSC 유래 치료제의 임상 번역을 방해. 이 프로토콜 hPSC LESC 차별화 이종-및 피더 세포 무료 조건 하에서 재현 하 고 효율적인 방법을 제공합니다. 첫째, 단층 문화 undifferentiated hPSC 재조합 laminin-521 (LN-521)에 정의 된 hPSC 매체의 차별점에 대 한 높은-품질 시작 물자의 강력한 생산 위한 기초 역할을 합니다. 둘째, 신속 하 고 간단한 hPSC LESC 차별화 방법 24 일만에 LESC 인구를 생성합니다. 이 방법은 작은 분자로, 정의 된 각 막 상피 분화 매체에 LN-521/콜라겐 IV 조합 매트릭스에 부착 문화 단계 다음에 4 일간 표면 ectodermal 유도 포함 합니다. Cryostoring와 확장된 차별화 더 세포 인구를 정화 하 고 대량 세포 치료 제품에 대 한 셀의 은행 수 있습니다. 결과 높은 품질 hPSC LESCs 치료 limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD) 각 막 표면 재건을 위한 잠재적인 새로운 치료 전략을 제공 합니다.
서론
안구 표면에 투명 한 각 막 빛이 망막을 입력을 허용 하 고 눈의 굴절 힘의 대부분을 제공 합니다. 바깥쪽 레이어 층 화 각 막 상피를 지속적으로 limbal 상피 줄기 세포 (LESCs)에 의해 다시 생성 됩니다. LESCs corneoscleral 접속점1,2limbal 틈새의 기저 레이어에 상주합니다. LESCs 부족 구체적이 고 독특한 마커, 그래서 그들의 식별 putative 마커 집합의 더 광범위 한 분석을 요구 한다. 상피 녹음 방송 요인 p63, 및 특히 N 말기 잘린 p63의 알파 isoform의 (ΔNp63α), 관련 긍정적인 LESC 마커3,4으로 제안 되었습니다. LESCs의 비대칭과 자기 갱신, 하지만 또한 centripetally 및 anteriorly 마이그레이션하는 자손을 생산 수 있습니다. 세포 막 표면으로 진행 그들은 점차적으로 그들의 stemness 잃게 되 고 마지막으로 지속적으로 각 막 표면에서 손실 표면 편평 세포에 분화 말기.
각 막 층의 손상이 심각한 시각 장애, 이어질 수 있습니다 그리고 각....
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프로토콜
탐 페 레 대학의 인간 배아에 대 한 연구를 수행 하 핀란드 (Dnro 1426/32/300/05) 법의학 담당 국가 기관의 승인이 있다. 연구소는 또한 파생, 문화, 및 hESC 라인 (Skottman/R05116)를 차별화 하 고 안과 연구 (Skottman/R14023)에서 hiPSC 라인을 사용 하는 Pirkanmaa 병원의 윤리 위원회의 지원 문이 있다. 아니 새로운 셀 라인은이 연구에 대 한 파생 되었다.
참고: 설명 프로토콜 기반으로 특정, 상용 hPSC 및 각 막 상피 분화 미디어 합니다. 제조 업체/공급 업체 정보 및 카탈로그 번호 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
1. 이종 급지대 무료 hPSC 문화 구축
- 준비
- 인간의 재조합 laminin-521 (LN-521)와 코트 24-잘 접시. 첫 번째 급지대 무료 (FF) 통과 위해 사용 하 여 LN-521 1.09 µ g/c m2의 농도에 그리고 0.55 µ g/c m2 에서 다음과 같은 구절에 대 한. 제안 된 LN-521 농도 성공적인 FF 문화에 대 한 시작 지점으로 제공 하지만 낮아질 수 있습니다.
- LN-521....
- 인간의 재조합 laminin-521 (LN-521)와 코트 24-잘 접시. 첫 번째 급지대 무료 (FF) 통과 위해 사용 하 여 LN-521 1.09 µ g/c m2의 농도에 그리고 0.55 µ g/c m2 에서 다음과 같은 구절에 대 한. 제안 된 LN-521 농도 성공적인 FF 문화에 대 한 시작 지점으로 제공 하지만 낮아질 수 있습니다.
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결과
HPSC-LESCs에 hPSCs에서
FF hPSCs cryostoring hPSC-LESCs로의 분화 유도에서 전체 프로세스는 약 3.5 주 걸립니다. 그것의 주요 단계를 강조 차별화 방법의 도식 개요 그림 1A에 제공 됩니다. 그림 1B 는 프로토콜의 여러 단계에서 세포 인구의 일반적인 형태학을 보여줍니다. 제공 된 데이터 Regea08/017 hESC 라인과 UTA.04607.WT hiPSC 선, 파생와 앞에서 설명한26,,2728탐 페 레, 핀란드의 대학에서 특징 모두 얻을 수 있습니다.
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토론
이 프로토콜의 예상된 결과 성공적이 고 강력한 세대 LESCs의 FF hPSC의 단일 세포 현 탁 액에서 약 3.5 주 이내. 각 막 상피 표면 ectoderm29에서 개발, 프로토콜의 첫 번째 단계는이 혈통으로 hPSCs을 운영 목표로 합니다. 성장 인자 (TGF-β) 베타 길 항 제 SB-505124과 bFGF와 짧은 24 h 유도 세포 표면 ectoderm 향해 밀어 48 h mesodermal BMP-4 큐 다음 ectodermal 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 화학적 정의 차별화 매체와 열 4/LN-521 조합 매트릭스에 다음 부착 분화 단계 추가 안내 LESCs로 차별화 하는 데 사용 됩니다.
시작 자료 (FF hPSCs)의 높은 품질은 성공적인 차별화 중요 합니다. 만 FF hPSC 문화 합류 근처 및 미 분화 형의 100%를 사용 한다. 일반 hPSC karyotyping은 권장, 성장과 감 별 법 이점
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
연구 기술 및 혁신, 핀란드 (부여 번호 297886)의 아카데미, 인간의 예비 부품 프로그램 Tekes, 핀란드 자금이 체 기구에 의해 지원 되었다 핀란드 눈 및 조직 은행 재단 및 핀란드 문화 재단. 저자는 생물 의학 실험실 기술자를 Outi Melin, 한 나 Pekkanen, 엠마 Vikstedt, 및 Outi Heikkilä 우수한 기술 지원 및 세포 배양에 기여 감사합니다. 교수 카트리나 Aalto-Setälä 형광 이미징 장비를 제공 하 고 사용 하는 hiPSC 라인 BioMediTech 이미징 핵심 시설 제공을 위한 인정 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Gibco | 를 | ||
| strong>Material/Reagent | |||
| 2+ 및 Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm 세포 배양 접시 | Corning CellBIND# | 3296 | 배양 용기 형식 분화 |
| 12웰 플레이트 | Corning CellBIND# | 3336 | IF 시료용 배양 용기 형식 |
| 24웰 플레이트 | Corning CellBIND | #3337 | IF 시료용 배양 용기 형식 |
| 2-메르토에탄올 | Gibco | #31350-010 | |
| 6웰 플레이트, 초저 부착 | Corning Costar | #3471 | 현탁액 유도용 배양 용기 형식 culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | 에 대한 2차 항체 |
| ThermoFisher Scientific | #A-11057 | IF | |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | |
| IF Basic 섬유아세포 성장인자 2차항체 (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | 동물이 없는 재조합 인간 FGF 베이직(154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 솔루션 | BD Biosciences | #554722 | 유세포 분석을 위한 고정 및 투과화 솔루션 |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | 유세포 분석을 위한 세척 버퍼 |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 항체 | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | 에 대한 1차 |
| 항체 | R& D Systems | #MAB3164 | |
| Cytokeratin 15 항체 | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | 부착성 hPSC-LESC 분화를 위한 배양 배지 |
| 겐 IV형(인간) | Sigma-Aldrich | #C5533 | 인간 태반 콜라겐 IV형 |
| CoolCell LX 냉동 용기 | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure 튜브 | Sarsted | #72.380 | hPSC-LESC 동결 보존을 위한 1.6mL 극저온 튜브 |
| 정의 트립신 억제제 | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| 라미닌 521 | Biolamina | #Ln521 | 인간 재조합 laminin 521 |
| Δ NP63&알파; 항체 | BioCare Medical | #4892 | 에 대한 1차 항체 |
| D Systems | #AF1759 | 에 대한 1차 항체 | |
| ; 항체 | 세포 신호 기술 | #ACI3066A | 에 대한 1차 항체 |
| ; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | 세포 신호 기술 | #56687 | p63-α 유세포 분석을 위한 PE 접합 항체 |
| PAX6 항체 | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | 에 대한 기본 항체 |
| Lonza | #17-602E | ||
| 파라포름알데히드(PFA) | 시그마-알드리치 | #158127 | IF ProLong |
| Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI for hard IF |
| PSC 동결 보존 키트 | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco' 장착 s 변형 된 독수리' s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM 비필수 아미노산 | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | 용 투과화제 |
| #H-1200 | IF | ||
| strong>Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Equipment | |||
| cytocentrifuge, e.e. CellSpin II | Tharmac | ||
| 유세포분석기, 예: BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| 형광 현미경, 예: Olympus IX 51 | Olympus |
참고문헌
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R.
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