단백질 기반 Hydrogels 대상이 힘-클램프 Rheometry

요약

새로운 힘-클램프 rheometry 기술은 낮은 볼륨 단백질 기반의 히드로 샘플 음성 코일 모터와 힘 센서 사이의 곁의 기계적 성질을 조사 하는 데 사용 됩니다. 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템 강제로 원하는 프로토콜을 경험된의 '죄'에 대 한 수 있습니다.

초록

여기, 우리는 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 속성 특성 힘-클램프 rheometry 메서드를 설명 합니다. 이 메서드는 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템을 사용 하 여 원통형 단백질 기반의 히드로 샘플, 선형 음성 코일 모터와 힘 변환기 사이 곁에 힘 제어 프로토콜을 적용. 작업 중 PID 시스템 측정 및 설정 포인트 세력 간의 차이 최소화 하 여 힘을 미리 정의 된 프로토콜에 따라 하이드로 겔 샘플의 확장을 조정 합니다. 단백질 기반 hydrogels이 독특한 접근 방식 다른 단백질 농도와 매우 낮은 볼륨 하이드로 겔 샘플 (< 5 µ L)의 밧줄 수 있습니다. 힘 램프 프로토콜, 어디 적용된 스트레스 증가 하 고 선형 시간 감소, 아래 시스템 표준 탄성의 측정 및 단백질의 폴딩 (유엔)와 관련 된 탄성과 히스테리시스 동작의 연구 활성화 및 점 탄성 매개 변수입니다. 상수-힘, 힘 펄스는 단계 같은 모양, 탄성 응답 인해 힘에 있는 변화에 아래에서 점 탄성, 전개 및 refolding 단백질 도메인에서 분리 된입니다. 낮은 볼륨 샘플 및 다양 한 기계적 섭 적용에 다양성, 힘-클램프 rheometry 대량 접근을 사용 하 여에서 단백질의 기계적 응답을 조사 하기 위해 최적화 됩니다.

서론

독특한 물리적 특성 떨어져, 단백질 기반 hydrogels 붐비는 환경에 있는 단백질의 연구를 활성화 한 '당겨'에 몇 십억 분자의 측정 함으로써 힘 분광학을 혁명의 약속을 잡으십시오 피부와 다른 조직에 있어서 그 비슷한. 단백질 도메인 유지 hydrogels, 강제로, biomechanical 반응의 연구를 수 있도록 내부 접힌 파트너 및 화학 조건 바인딩. 또한, biomechanical 응답 hydrogels 내부 단백질 도메인의 단일 분자 힘 분광학 기법으로 본 응답을 유사 합니다. 예를 들어 화학 denaturants 및 산화 제 접힌된 상태, 단일 단백질 도메인 수준^1,2,3 와 거시적인 레벨^4,5 에서 안정성을 감소 ^{, 6 , 7}. osmolytes 단일 단백질^8,9, 동일한 힘 조건^7,10대 hydrogels의 점 탄성 응답 감소로 이어지는의 안정성을 증가 하는 유사 하 게.

중 합성 단백질 기반 hydrogels 구현 되었습니다 몇 가지 방법을 사용 하 여 물리적 상호 작용^11,12 또는 공유 상호^4,13. 화학식 반응 고정된 가교 위치에 대 한 허용 하 고 이러한 hydrogels 기계적 또는 화학적 섭의 제거에 따라 초기 상태를 복구할 수 있습니다. 화학식 cross-linking를 위한 성공적인 접근 초기자 (그림 1)¹⁴는 산화 제와 루 테 늄 (II) 소금으로 암모늄 persulfate (AP)를 사용 하 여 노출 된 티로신 아미노산 사이 화학식 탄소-탄소 유대 형성에 의존 합니다. 하얀 빛에 노출 되 면 집중된 단백질의 해결책은 하이드로 겔으로 설정할 수 있습니다. 제어 하 여 반응을 시작, 단백질-APS 믹스 어떤 주조 형태, 투입 될 수 있는 때 소계 (PFTE) 등 튜브 (그림 1B 및 1 C), 수 있도록 매우 작은 솔루션 볼륨¹⁵를 사용 하 여. 또한, 가교 반응을 방 아 쇠를 흰색 빛으로의 사용 제한 표백 형광 단백질의 결과 하며 복합 hydrogels의 정립 형광 마커 (그림 1) 다른 단백질 기반 하이드로 겔 형성 방법 SpyTag SpyCatcher 공유 상호 작용¹⁶, 아민 가교 를 통해 도¹³또는 biotin streptavidin 상호 작용¹⁷에 따라 교차 연결을 사용 합니다.

동적 기계적인 분석 (DMA)는 현재 광범위 하 게 폴리머 기반 hydrogels^13,18를 공부 하는 기술입니다. DMA 생체 재료에 일정 힘 프로토콜을 적용할 수 있습니다, 하는 동안 10 kPa, 및 이상의 200 µ L¹⁹의 큰 샘플 볼륨 영의 계수를 요구 한다. 이러한 제한으로 인해 단백질 hydrogels는 일반적으로이 기술에 의해 조사를 너무 부드러운. 설계 된 polyproteins 때문에 살아있는 시스템 생산에 필요한 고분자, 보다 합성 하 더로 같은 높은 볼륨 효율적, 최고의^4,15되지 않습니다. 또한, 대부분의 생물 학적 조직 10 kPa 보다 부드럽고 있다. 몇 가지 방법은 생물 학적 샘플, 근육 탄력^20,21연구에서 특히 개발 되었다. 이러한 기술은 또한 지속적인 힘을 피드백에서 동작할 수 있습니다 하지만 아주 짧은 시간 동안 강제로 노출 (미크론 범위)에서 작은 직경을 가진 샘플에 대 한 최적화 (일반적으로 1 s).

단백질 기반 hydrogels 수정된 rheometry 기술로 성공적으로 공부 했다. 예를 들어 반지 모양에는 히드로 주조 확장^4,22의 기능으로 경험 있는 힘에 있는 변화를 측정 하기 위해 extensional rheometry 사용 하 여 수 있습니다. 단백질 기반 hydrogels의 유 변 학적 특성을 공부에 대 한 다른 접근 제어 전단 응력 rheometry를 사용 합니다. 이 기술은 또한 낮은 샘플 볼륨을 달성 하 고 부드러운 소재를 용납 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 부족을 당기기 모방 능력 그 원인 단백질 펼쳐진 vivo에서, 고 탄성 계수 다양 한 가정 및²³필요로 하는 복잡 한 이론에 따라 계산 됩니다.

우리는 최근 단백질, 직경 튜브 내부 생산의 작은 볼륨을 이용 하는 새로운 접근 방식을 보고 < 1 m m. 이 기술은의 우리의 첫 번째 구현 젤 원하는 프로토콜¹⁵다음 확장 했다 길이 클램프 모드에서 운영 했다. 이 방법에서는, 단백질 경험 확장에 힘 연속 변경 도메인 전개 하는 동안 데이터 해석 복잡 하. 최근에, 우리는 새로운 힘-클램프 rheometry 기술, 피드백 루프는 사전 정의 된 힘 프로토콜⁷ (그림 2) 낮은 볼륨 단백질 hydrogels을 노출할 수 있습니다 보고 있다. 아날로그 PID 시스템 컴퓨터에서 보낸 세트 포인트와 힘 센서에 의해 측정 하는 힘을 비교 하 고 두 입력 간의 차이 최소화 하기 위해 음성 코일을 이동 하 여 젤 확장을 조정 합니다. 힘의이 '죄' 지금 허용 한다 실험의 새로운 유형에 대 한 단백질 hydrogels의 역학을 측정 하기 위하여.

힘-램프 모드에서 속박 되 단백질 히드로 지속적인 증가 시간 강제의 감소를 경험 한다. PID는 단백질 및 하이드로 겔 제제의 종류에 따라 비-선형 방법에 있는 확장명을 변경 하 여 점 탄성 변형에 대 한 보상. 힘 램프의 주요 장점은 그것은 영의 계수는 전개 및 refolding 단백질 도메인의 에너지 소비 등의 표준 매개 변수의 정량화를 허용 한다.

상수-포스 모드에서 적용 된 힘 단계 처럼에서 변경 됩니다. 이 모드에서 젤 확장 계약 탄력적 때 힘 증가 또는 감소, 각각, 시간에 따른 변형에 의해 따라. 이 점 탄성 변형, 젤 지속적인 힘을 경험 하는 동안 일어나는 도메인 전개 refolding와 직접 관련 됩니다. 단순화 된 방법으로,이 확장 몇 십억 단일 분자 추적 함께 평균 하 고 한 번에 측정의 동급으로 볼 수 있습니다. 상수-포스 프로토콜 크 리프 힘 및 시간의 기능으로 단백질 hydrogels의 휴식을 공부 하 고 사용할 수 있습니다. BSA-기반 단백질 hydrogels 위한 힘의 기능으로 우리 최근 나타났습니다 탄성 및 점 탄성 확장 및 적용 된 스트레인⁷반동 사이 선형 종속성입니다.

여기 우리 힘 클램프 고분자 형광 고 쉽게 전반적인 하이드로 겔을 만드는 단백질 L의 혼합물 (8 도메인²⁴, L₈로 묘사) 및 단백질 L eGFP 구문 (L-eGFP)에서 만든 복합 젤을 사용 하 여 작업 세부 사항 보여 줍니다.

프로토콜

1. 시 약 솔루션 준비

1. [20 m m tris (hydroxymethyl) aminomethane 및 150 mM NaCl, pH 7.4] Tris 버퍼를 사용 하 여 원하는 농도에 관심사의 단백질을 용 해/diluting 하 여 시작 단백질 솔루션을 준비 합니다.
   참고: hydrogels로는 상호 연결에 대 한 작은 단백질 농도 단백질 사용에 따라 달라 집니다 및 일반적으로 > 1 m m 이다.
2. Tris(bipyridine)ruthenium(II) 염화 암모늄 persulfate (APS) (1 M)의 주식을 준비 ([Ru(bpy)₃]^{2 +}) APS 용 해 하 여 (6.67 m m) 솔루션 및 Tris 버퍼에서 [Ru(bpy)₃]^{2 +} 파우더.

2. 단백질 기반 하이드로 겔 합성

1. 누르면된 플런저와 1 mL 주사기에 23 G 바늘을 수정.
2. 면도날을 사용 하 여 ()와 함께 0.022의 내부 직경에 0.044의 외부 직경 10 cm 소계 (PTFE) 튜브를 잘라. PTFE 튜브의 한쪽 끝을 바늘과 주사기를 연결 합니다.
3. 실 란 솔루션으로 튜브의 두 번째 끝을 삽입 하 고 튜브 주사기 플런저를 축소 하 여 작성. ~ 30 분에 대 한 튜브를 둡니다.
4. 실 란 솔루션을 제거 하 고 건조 한 압축 공기 튜브.
   참고: 모든 실 란 솔루션은 건조 하 고 아무 잔류물은 튜브에 남아 있는지 확인 합니다.
5. APS와 [Ru (bpy) 3] 단백질 해결책 혼합^{2 +} 일정 볼륨 비율을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 [예를 들어, 15:1:1 또는 15:0.5:0.5 (v:: v)].
6. 그것은 완전히 혼합 될 때까지 광 솔루션 소용돌이.
7. (예를 들어, 14000 x g) 솔루션에서 모든 거품을 제거 하는 최대 속도로 혼합 원심
8. 광 혼합물으로 치료 PTFE 튜브의 열린 끝을 삽입 하 고 튜브에 주사기 플런저를 제거 하 여 솔루션을 그립니다.
9. 로드 튜브가 열을 방지 하 고 실내 온도 (그림 1B)에 최대 30 분 동안 그것을 유지 하는 100 W 수은 램프에서 ~ 10 cm를 놓습니다.
   참고: 경우에 따라 빛을 노출 시간 수 30 미는 겔 화 시간 단축에 사용 되며 여기 형광 젤, photobleaching 제한으로 낮은.
10. 바늘에서 튜브를 제거 하 고 면도날으로 히드로 끝 근처 튜브의 가장자리를 잘라.
11. 무딘된 24 G 바늘을 사용 하 여 트리 스 솔루션 (그림 1C)에 히드로 돌출.
    참고: 무딘된 바늘은 모든 노치를 피하기 위해 또는 하이드로 겔 샘플을 손상 하는 데 사용 됩니다.
12. 돌출 하는 동안 또는 거품을 형성 하 고 결함을 가진 젤을 버리고 수도 있는 어떤 결점 든 지 젤을 않았는지 살펴보십시오.

3. 단백질 기반의 히드로 첨부 및 힘-클램프 제가 설정

1. 인스트루먼트 컨트롤 프로그램을 시작 합니다. 음성 코일 모터를 켭니다. 값 범위 (예를 들어, 7.5 m m)의 끝으로 코일 위치를 설정 합니다.
   참고: 음성 코일 위치는 히드로의 가능한 확장을 최대화 하기 위해 최대 운동 범위의 끝으로 될 것이 좋습니다.
2. Z에서 후크를 치환-방향 x벤드에 그들을 정렬-방향 (당기 좌표 이며 그림 2B참조). 마이크로미터 나사 x의 값을 기록-방향.
3. 2 살 균 봉합 길이가 가닥으로 잘라 (2-3 cm; 그림 3A 및 B참조).
4. 각각의 가닥에 느슨한 더블 overhand 매듭 고 힘 센서 (그림 3C 와 3D)에 연결 하는 연결에 2 루프를 배치.
5. Tris 버퍼 실험 챔버와 의료 핀셋을 사용 하 여 채워진된 챔버로 하이드로 겔 샘플을 전송.
6. 음성 코일 및 놓고, 강제로 솔루션 표면 가까이 센서 후크 모든 방향으로 x를 사용 하 여 후크를 정렬 /y/z-조작자를 위치.
7. 의료 핀셋, 기다려 음성에 연결 하는 걸이에 단백질 하이드로 겔 샘플의 양쪽 코일과 센서 (그림 3C)을 강제로 사용 하 여.
8. 의료 핀셋으로 봉합 루프의 양쪽 끝을 잡고, 동시에 그들을 당기고 하 여 음성 코일에 하이드로 겔 샘플 주위 봉합 루프 1 조입니다 (그림 3D).
9. 루프에 대 한 반복 단계 3.8 힘 센서 (그림 3D)에 연결합니다.
   참고: 어떤 구조적 손상 및 하이드로 겔 샘플의 횡단 절단을 방지 하기 위해 봉합의 극단적인 강화 하지 마십시오.
10. 어떤 미끄럼을 방지 하기 위해 각 연결의 벤드에 봉합 루프를 강화 참고로이 벤드 포인트 제로 구분 단계 3.2에서에서 후크를 찾을 수 사용. 의료가 위 (그림 3D)를 사용 하 여 봉합의 초과 길이 잘라.
11. Z를 사용 하 여 연결 된 하이드로 겔 이동- z따라 조작자-실험 솔루션에 히드로 몰입할 실험 챔버 쪽으로 축.
12. Y-z 는 젤 하지 어떤 스트레스는 조작자를 사용 하 여 하이드로 겔 샘플을 맞춥니다.
13. 제로 포스 센서와 x를 사용 하 여 2 개의 후크를 분리-마이크로미터 단계 젤 힘 발생 하기 시작할 때까지. 일단 이것이 일어나면, 약간 되돌릴 마이크로미터 나사 x-방향.
14. 음성 코일 모터 및 센서에 대 한 두 컨트롤러의 위치를 기록 하 고 이러한 값과 3.2 단계에서 측정 하는 것 들 사이의 차이 사용 하 여 정확한 실험의 시작에 tethering 후크 구분 계산.
15. ~1.5-2 m m로 여유 곡선에 대 한 범위를 설정 하 고 젤 여유 (그림 4A)를 측정 한다.
    참고: 여유 각 측정 2 정권 (그림 4A)에 맞게 최적의 수의 데이터 요소에 대 한 허용 초기 음성 코일 위치 근처 여유 정권의 시작을 유지 하려고 합니다. 젤 길이 갈고리와 느슨하게에 2 정권 사이의 교차로 사이의 분리를 사용 하 여 미크론 분해능으로 결정 될 수 있다 곡선 (단계 5.1 참조). 힘 센서는 실험 조건에 있는 변이 때문에 시간 드리프트 수 있습니다로 젤이 없는 아래 여유 곡선의 부분 힘이 가능한 드리프트에 대 한 보고서. 계측기 제어 프로그램 PID 루프 (그림 4A 인세트)를 세트 포인트 명령을 보낼 때 이러한 차이 대 한 자동으로 보정 합니다.

4. 단백질 기반의 히드로 특성 제어 힘 램프를 사용 하 여 상수-힘 측정

1. 힘-램프 실험
   1. 힘 램프 주기 원하는 로딩 속도 (예를 들어, 0.01 mN/s)에 힘을 증가 하 여를 수행 하려면 뒤집힌된 "V"로 시작 하 고 마지막 세력 및 프로토콜의 기간을 입력 합니다. 그런 다음 0 미네소타 (또는 낮은 힘) > 200 s refold를 복구 젤 탄력 단백질 도메인 있도록 젤 잡으십시오.
   2. 추적을 저장 합니다.
2. 상수-힘 실험
   1. 정의 된 시간 동안 일정 한 힘 (예를 들어, 1만)에 30 s와 증가 힘에 대 한 낮은 힘 (예를 들어, 0.1 mN)를 적용 하 여 상수-힘 프로토콜을 수행 (예를 들어, 120 s), 뒤에 동일 하 게 다시 힘을 낮은 냉각 값 (예, 0.1 mN) > 300 s refold를 복구 젤 탄력 단백질 도메인 수 있도록.
   2. 첫 번째 펄스 다음 PID 설정을 조정 하는 피드백의 응답 시간을 최대화 (참조 그림 2D) 루프.
      참고: 뻣 뻣 한 젤에 대 한 힘에 작은 변화에 대 한 루프의 응답 시간 힘 센서의 전자와는 코일의 응답 시간에 의해 제한 됩니다 그리고, 5 ms⁷만큼 낮을 수 있다. 부드러운 젤, 힘에 있는 큰 변화에 대 한 응답 시간이 hydrogels (그림 2D)의 탄성에 의해 결정 됩니다.
   3. 추적을 저장 합니다.

5. 데이터 분석

1. 젤 힘 ( 그림 4A 삽입에서 δ x) 경험, 젤 길이 L 방정식을 사용 하 여 계산을 시작 하면 갈고리와 계산 된 코일 위치 측정된 구분 활용 하 여:
   L = L₀ + ∆x
   여기, L₀ (단계 3.14) 실험 전에 마이크로미터 나사의 위치에서 측정 후크 사이 분리 이다.
   참고: 완전 한 cross-linking 귀착되는 낮은 단백질 농도와 젤에 대 한 측정된 길이 추적 추적에서 변경 됩니다. 또한, 시간의 오랜 기간 동안 hydrogels 내부 단백질 발생할 수 노화 효과²⁵, 젤의 전체 길이에 있는 결과.
2. 정상화 긴장을 젤 길이 측정된 확장.
3. 중 합에 사용 되는 관의 내부 직경을 사용 하 여 횡단 표면에 측정 된 힘을 정상화.

결과

그림 1A 는 L-£/ L₈ 하이드로 겔을 합성 하는 데 사용 하는 광 반응의 체계를 보여 줍니다. 그림 1B 는 photoactivation 전후 PTFE 튜브 히드로 혼합물을 보여줍니다. 그림 1C 트리 스 솔루션 내부 돌출된 L eGFP L₈ 하이드로 겔을 선물 한다. 하이드로 겔 샘플 노치 등 없는 구조적 결함이 있다. 명확 하 게 보이는 손상 Hydrogels 폐기 해야한다.

조립의 렌더링 및 힘-클램프 고분자의 분해 뷰 그림 2A 및 2B에 선물 된다.

토론

여기, 우리는 낮은 볼륨 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 응답을 조사 하는 힘-클램프 rheometry 기법을 설명 합니다. 또한, 균일 한 원통형 낮은 볼륨 단백질 하이드로 겔 샘플을 합성 하는 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜도는 걸이에 어떤 기계적 변형 또는 단백질 기반 하이드로 겔 샘플 또는 젤의 미끄럼에 손상을 유발 하지 않고 다른 유형의 다양 한 신축성으로 단백질 기반 hydrogels 넥타이 하는 방법에 설명 합니다 제공 됩니다. 선형 음성 코일 및 힘 센서, 아날로그 PID 시스템 힘 램프 및 지속적인 힘 등 힘 제어 프로토콜의 응용 프로그램을 사용 합니다. 최근,이 기술은 다른 실험적인 솔루션⁷에 BSA 기반 hydrogels의 다른 복사해올된 농도의 biomechanical 반응을 하 사용 되었습니다.

공식화 하 고 단백질 hydrogels 작업할 때 중요 한 측면은 측정의 재현성. 젤은 너무 낮...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SI-KG4A 포스 트랜스듀서	월드 정밀 기기 (WPI)	SI-KG4A
리니어 보이스 코일 모터	설비 솔루션	LFA2010
소 혈청 알부민	록키 마운틴 바이오 제제 (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
암모늄 퍼설페이	트 Sigma-Aldrich	248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride	Sigma-Aldrich	544981-1G
익스프레스 의료 용품  6-0 나일론 봉합사 12/PK	피셔 사이언티픽	NC0395626
1mL 주사기만, Luer-Lok Tip	BD	309628
실란, Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
마이크로보어 PTFE 튜빙, 0.022"ID x 0.042"OD, 100피트/롤	Cole-Parmer	EW-06417-21
피하 주사 바늘, 23 게이지	헬스케어 공급 전문가	305194
Jensen Global JG24-1.5X 레드 IT 분배 팁 - 24 게이지	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W 짧은 아크 수은 램프	ALB	USH-103D USHIO
의료 핀셋
의료 가위
Olympus
맞춤형 부품의 컴퓨터 코드 및 CAD 설계는 교신 저자에게 요청 시 제공될 수 있습니다.