단백질 기반 Hydrogels 대상이 힘-클램프 Rheometry

요약

새로운 힘-클램프 rheometry 기술은 낮은 볼륨 단백질 기반의 히드로 샘플 음성 코일 모터와 힘 센서 사이의 곁의 기계적 성질을 조사 하는 데 사용 됩니다. 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템 강제로 원하는 프로토콜을 경험된의 '죄'에 대 한 수 있습니다.

초록

여기, 우리는 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 속성 특성 힘-클램프 rheometry 메서드를 설명 합니다. 이 메서드는 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템을 사용 하 여 원통형 단백질 기반의 히드로 샘플, 선형 음성 코일 모터와 힘 변환기 사이 곁에 힘 제어 프로토콜을 적용. 작업 중 PID 시스템 측정 및 설정 포인트 세력 간의 차이 최소화 하 여 힘을 미리 정의 된 프로토콜에 따라 하이드로 겔 샘플의 확장을 조정 합니다. 단백질 기반 hydrogels이 독특한 접근 방식 다른 단백질 농도와 매우 낮은 볼륨 하이드로 겔 샘플 (< 5 µ L)의 밧줄 수 있습니다. 힘 램프 프로토콜, 어디 적용된 스트레스 증가 하 고 선형 시간 감소, 아래 시스템 표준 탄성의 측정 및 단백질의 폴딩 (유엔)와 관련 된 탄성과 히스테리시스 동작의 연구 활성화 및 점 탄성 매개 변수입니다. 상수-힘, 힘 펄스는 단계 같은 모양, 탄성 응답 인해 힘에 있는 변화에 아래에서 점 탄성, 전개 및 refolding 단백질 도메인에서 분리 된입니다. 낮은 볼륨 샘플 및 다양 한 기계적 섭 적용에 다양성, 힘-클램프 rheometry 대량 접근을 사용 하 여에서 단백질의 기계적 응답을 조사 하기 위해 최적화 됩니다.

서론

독특한 물리적 특성 떨어져, 단백질 기반 hydrogels 붐비는 환경에 있는 단백질의 연구를 활성화 한 '당겨'에 몇 십억 분자의 측정 함으로써 힘 분광학을 혁명의 약속을 잡으십시오 피부와 다른 조직에 있어서 그 비슷한. 단백질 도메인 유지 hydrogels, 강제로, biomechanical 반응의 연구를 수 있도록 내부 접힌 파트너 및 화학 조건 바인딩. 또한, biomechanical 응답 hydrogels 내부 단백질 도메인의 단일 분자 힘 분광학 기법으로 본 응답을 유사 합니다. 예를 들어 화학 denaturants 및 산화 제 접힌된 상태, 단일 단백질 도메인 수준^1,2,3 와 거시적인 레벨^4,5 에서 안정성을 감소 ^{, 6 , 7}. osmolytes 단일 단백질^8,9, 동일한 힘 조건....

프로토콜

1. 시 약 솔루션 준비

1. [20 m m tris (hydroxymethyl) aminomethane 및 150 mM NaCl, pH 7.4] Tris 버퍼를 사용 하 여 원하는 농도에 관심사의 단백질을 용 해/diluting 하 여 시작 단백질 솔루션을 준비 합니다.
   참고: hydrogels로는 상호 연결에 대 한 작은 단백질 농도 단백질 사용에 따라 달라 집니다 및 일반적으로 > 1 m m 이다.
2. Tris(bipyridine)ruthenium(II) 염화 암모늄 persulfate (APS) (1 M)의 주식을 준비 ([Ru(bpy)₃]^{2 +}) APS 용 해 하 여 (6.67 m m) 솔루션 및 Tris 버퍼에서 [Ru(bpy)₃]^{2 +} 파우더.

2. 단백질 기반 하이드로 겔 합성

1. 누르면된 플런저와 1 mL 주사기에 23 G 바늘을 수정.
2. 면도날을 사용 하 여 ()와 함께 0.022의 내부 직경에 0.044의 외부 직경 10 cm 소계 (PTFE) 튜브를 잘라. PTFE 튜브의 한쪽 끝을 바늘과 주사기를 연결 합니다.
3. 실 란 솔루션으로 튜브의 두 번째 끝을 삽....

결과

그림 1A 는 L-£/ L₈ 하이드로 겔을 합성 하는 데 사용 하는 광 반응의 체계를 보여 줍니다. 그림 1B 는 photoactivation 전후 PTFE 튜브 히드로 혼합물을 보여줍니다. 그림 1C 트리 스 솔루션 내부 돌출된 L eGFP L₈ 하이드로 겔을 선물 한다. 하이드로 겔 샘플 노치 등 없는 구조적 결함이 있다. 명확 하 게 보이는 손상 Hydrogels 폐기 해야한다.

조립의 렌더링 및 힘-클램프 고분자의 분해 뷰 그림 2A 및 2B에 선물 된다.

토론

여기, 우리는 낮은 볼륨 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 응답을 조사 하는 힘-클램프 rheometry 기법을 설명 합니다. 또한, 균일 한 원통형 낮은 볼륨 단백질 하이드로 겔 샘플을 합성 하는 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜도는 걸이에 어떤 기계적 변형 또는 단백질 기반 하이드로 겔 샘플 또는 젤의 미끄럼에 손상을 유발 하지 않고 다른 유형의 다양 한 신축성으로 단백질 기반 hydrogels 넥타이 하는 방법에 설명 합니다 제공 됩니다. 선형 음성 코일 및 힘 센서, 아날로그 PID 시스템 힘 램프 및 지속적인 힘 등 힘 제어 프로토콜의 응용 프로그램을 사용 합니다. 최근,이 기술은 다른 실험적인 솔루션⁷에 BSA 기반 hydrogels의 다른 복사해올된 농도의 biomechanical 반응을 하 사용 되었습니다.

공식화 하 고 단백질 hydrogels 작업할 때 중요 한 측면은 측정의 재현성. 젤은 너무 낮.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SI-KG4A 포스 트랜스듀서	월드 정밀 기기 (WPI)	SI-KG4A
리니어 보이스 코일 모터	설비 솔루션	LFA2010
소 혈청 알부민	록키 마운틴 바이오 제제 (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
암모늄 퍼설페이	트 Sigma-Aldrich	248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride	Sigma-Aldrich	544981-1G
익스프레스 의료 용품  6-0 나일론 봉합사 12/PK	피셔 사이언티픽	NC0395626
1mL 주사기만, Luer-Lok Tip	BD	309628
실란, Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
마이크로보어 PTFE 튜빙, 0.022"ID x 0.042"OD, 100피트/롤	Cole-Parmer	EW-06417-21
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