Method Article

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

DOI:

10.3791/58298

⸱

January 23rd, 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

후 성적인 규정 유전자 발현에 있는 중앙 역할을 재생합니다. 히스톤 수정 1960 년대에서 발견 되었다, 이후 그 생리 및 병 적인 기능 광범위 하 게 공부 되었다. 실제로, 다음-세대 깊은 시퀀싱 및 특정 히스톤 수정 항 체를 통해 chromatin immunoprecipitation (칩)의 출현 게놈에 걸쳐 후 성적인 규칙의 우리의 보기를 혁명 하고있다. 반대로, 조직 일반적으로 다양 한 종류의 세포를 구성 하 고 그들의 복잡 한 혼합물 특정 세포 유형에 epigenome 조사 분석 도전 포즈. 게놈 넓은 방식 셀 유형 특정 chromatin 상태를 해결 하기 위해 우리는 최근 협동 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq), chromatin의 선택적 정화 셀에서 태그 코어 히스톤 단백질에 의해 기반으로 개발 뒤에 칩이 관심의 종류 이 프로토콜의 목표는 tChIP이 모범 사례 소개 이 기술은 다양 한 히스톤 수정 및 모형 유기 체에서 조직 관련 epigenome 조사에 대 한 다양 한 도구를 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다양 한 세포 유형 동물의 조직에 의하여 이루어져 있다. 유전자 규칙 각 셀에 셀 형식을 정의합니다. Chromatin 수정 DNA 메 틸 화와 히스톤 수정-셀 형 특이성 유전자 발현의 기반이 됩니다. 따라서, 각 세포 유형에 있는 후 성적인 규정의 측정, 원하는 하지만 그것은 기술적인 도전 하고있다.

특정 셀 형식에 epigenetics 조사, 탠덤 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 최근 개발 된 (그림 1)1했다. TChIP에 피토 프 태그 코어 히스톤 단백질 H2B 셀 형식 관련 발기인에서 표현 된다. 소재는 다양 한 종류의 세포 혼합물에서 시작 하지만이 기능은 관심의 세포에서 chromatins의 절연이 있습니다. 다음 칩 Seq-히스톤 수정 마크와의 다음-세대 깊은 시퀀싱을 통해 chromatin 정화 절연 DNA-우리 게놈 넓은 방식 대상된 세포 유형의 후 성적인 상태를 모니터링할 수 있습니다.

이 기술을 사용 하 여, 우리 신경 관련 trimethylation 히스톤 H3 리 4 (H3K4me3)에서 단백질의 최근 조사 표. 그 연구에 우리 개발 노크에 마우스는 C-말기 플래그 태그 H2B에 단백질 Cre 중재 재결합 (Rosa26CAG floxed pA H2B-플래그)에 따라 표현 했다. CamK2a 발기인의 통제 Cre endoplasmic 그물 (응급실) 유전자를 보유 하는 마우스와 함께 횡단에 의해 얻은 마우스 선 tamoxifen 주입 (Camk2aH2B 플래그)1시 활성 뉴런에서 H2B 플래그를 유도 한다. 설립된 마우스 라인의 두뇌에서 시작, 우리는 안티-H3K4me3 항 체와 tChIP-Seq 수행. H3K4me3 마크는 종종 발기인 지구에 해당, 이후 우리 신경1에서 구체적으로 표현 하는 mRNAs의 수백을 발견 수 있습니다.

여기, 우리는 도서관 건설 (그림 1)를 조직 해 부에서 단계를 커버 하는 전형적인 tChIP-Seq 메서드를 설명 합니다. 이 프로토콜의 최종 목표는 tChIP-Seq의 성능 및 다른 세포 유형 및 히스톤 수정이이 방법의 미래 응용 프로그램에 대 한 우리의 모범 사례를 공유 하는 것입니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 모든 메서드를 RIKEN (H27-EP071)의 안전 부문에 의해 승인 하 고 관련 지침 및 규정 실시 되었습니다.

1. 조직 해 부

  1. 작은 조각으로 관심의 조직 부 (약 < 3 m m2) 좋은 봄이 위를 사용 하 여.
    참고: 큰 조직 파편, 동결 하는 데 걸리는 그리고 작은 조각 버퍼, 결과 영향을 미칠 수 있습니다 둘 다의 더 큰 볼륨에 수행 한다.
  2. 액체 질소로 채워진 깨끗 한 용기에 해 부 조직 파편을 추가 하 고 액체 질소로 채워진 2 mL 튜브 (관 당 1 조각)으로 그들을 수집 합니다.
    참고:이 단계는 친수성 표면 튜브 권장 됩니다.
  3. > 5 분 남은 액체 질소를 증발 오픈 캡-80 ° C에서 튜브를 놓습니다.
    참고: 뚜껑을 닫은 후 조직 조각은 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 사용 하기 전에 한 달 동안.

2. 셀 고정

참고: 우리는이 단계에 대 한 편리한 저온 분쇄기를 사용. 다른 장치를 사용할 수 있습니다.

  1. 장소는 2 mL 단백질 낮은 바인딩 튜브 금속 얼음 선반에 조직 샘플을 포함 하는 액체 질소에 차게.
  2. 1.5 mL 튜브에 액체 질소로 냉각 금속 총알을 놓습니다. 금속 얼음 선반에 놓습니다.
  3. 2 mL 튜브를 열고 튜브에 prechilled 금속 총알을 배치 합니다. 뚜껑을 닫고, 편리한 저온 분쇄기의 튜브 홀더에 2 mL 튜브를 설정 하 고 즉시 1 분 액체 질소에 조립된 튜브 홀더를 찍어.
  4. 고정된 튜브 홀더 편리한 저온 분쇄기의 외부 카세트에 넣고 30 60 시간을 적극적으로 악수 s.
  5. 튜브 홀더를 분해, 금속 총알을 제거 하 고 장소 2 mL 튜브 샘플 쿨러에-20 ° c.에 prechilled
  6. 다음 단계에서 정착 액의 동결을 방지 하기 위해 15 분 동안-20 ° C에 샘플 쿨러를 놓습니다.
  7. 샘플 쿨러 벤치, 튜브의 뚜껑을 열고 가져오고 즉시 그것에 1% 포름알데히드의 900 µ L를 똑. 여러 번 pipetting 후 새로운 2 mL-튜브 1% 포름알데히드와 23 ° c.에 설정 하는 인큐베이터에서 부드러운 회전으로 10 분에 대 한 수정 프로그램의 900 µ L를 포함으로 정지 전송
    주의: 포름알데히드는 유독 하 고 유해한입니다.
  8. 중지 하려면 고정 반응, 각 튜브와 4 ° c.에 3000 x g에 5 분 동안 원심 분리기를 100 µ L 2.5 M 글리신의 추가 폐기는 상쾌한.
  9. 얼음 처럼 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL을 추가 하 고 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 (총에서 3 세척)를 반복 합니다.
    참고: 고정된 샘플 플래시-액체 질소로 냉동 고-80 ° c.에 저장 될 수 있습니다.
  10. 세포의 용 해 버퍼 1 500 µ L 추가 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)-코 (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (pH 8.0), 10 %w / v 글리세롤, 0.5 %w / v NP-40, 0.25 %w / v Triton X-100, 그리고 0.1 x protease 억제제 칵테일) 펠 릿, 피펫으로 여러 번 하 고 4 ° c.에서 10 분 동안 회전
    참고: 세포의 용 해 버퍼 1 필터링 및 사용 하기 전에 4 ° C에서 저장 되어야 한다.
  11. 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
  12. 세포의 용 해 버퍼 2의 1 mL을 추가 (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0.5 m m EGTA, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 0.1), 펠 릿을 소용돌이, 4 ° c.에서 10 분 동안 회전 하는 고
    참고: 세포의 용 해 버퍼 2 필터링 및 사용 하기 전에 4 ° C에서 저장 되어야 한다.
  13. 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
  14. 펠 릿을 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 radioimmunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 버퍼의 800 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 펠 릿을 resuspend.
  15. 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
  16. RIPA 버퍼 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 500 µ L를 추가 합니다.
  17. 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
  18. RIPA 버퍼 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1 mL를 추가 합니다. 즉시 다음 단계를 진행 합니다.

3입니다. chromatin 전단

  1. Sonicator 튜브는 lysate 전송 하 고 튜브를 ultrasonicator에 놓습니다.
  2. 다음 설정으로는 chromatin 전단: 온도: 4 ° C; 피크 사고 전력: 175 W; 의무 비율: 10%; 사이클/버스트: 200; 그리고 시간: 2400 s.
  3. 1.5 mL 단백질 낮은 바인딩 튜브 및 4 ° c.에 20000 x g에 5 분 동안 원심 분리기 샘플을 전송
  4. 새로운 단백질 낮은 바인딩 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다.
    참고: 샘플 수 있습니다 플래시-액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장

4. 품질 검사 DNA (가교 역)

  1. lysate의 믹스 20 µ L 및 칩 차입 버퍼의 180 µ L (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0), 그리고 1 %w / v 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브에서. 65 ° c 6 h 열 cycler 뚜껑 오픈에 대 한 열 cycler에서 샘플을 품 어. -변성을 피하기 위해 열 cycler 오픈의 뚜껑을 유지.
    참고: 칩 차입 버퍼 필터링 및 사용 하기 전에 실내 온도에 저장 되어야 한다. 이 외피는 하룻밤을 확장할 수 있습니다.
  2. 추가 10 mg/mL RNase의 1 µ L, 소용돌이, 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  3. 추가 15 mg/mL의 6.5 µ L 성분을 K, 소용돌이, 그리고 60 분 55 ° C에서 품 어.
  4. 전송 DNA 낮은 바인딩 튜브에 대 한 반응, 5 mg/mL glycogen, 그리고 소용돌이의 4 µ L를 추가 합니다. 그런 다음 실 온에서 18000 x g에서 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1) 및 5 분 동안 원심 분리기의 200 µ L를 추가 합니다.
  5. 새로운 DNA 낮은 바인딩 튜브는 상쾌한 전송. 트리 스-EDTA-NaCl 버퍼의 200 µ L 추가 (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 및 200 mM NaCl) 나머지 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 솔루션을 실 온에서 18000 x g에 5 분 동안 원심 분리기. 상쾌한을 수집 하 고 첫 번째 상쾌한 혼합.
  6. 얼음 처럼 차가운 에탄올의 900 µ L을 추가 하 고 1 시간-20 ° c.에 대 한 품 어
    참고:이 화 4-6 h를 확장할 수 있습니다.
  7. 4 ° c.에 18000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기
  8. 폐기는 상쾌한. 펠 릿을 4 ° c.에 18000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기 차가운 75% 에탄올의 1 mL을 추가 (총에서 두 세척)이이 단계를 반복 합니다.
  9. 상쾌한을 철저 하 게 무시 하 고 실 온에서 1 분 동안 건조.
  10. 트리 스-EDTA (테) 버퍼의 50 µ L을 추가 하 고 그것은 30 분 동안 실내 온도에 또는 4 ° C에서 하룻밤 배양 하 여 DNA를 분해. Vortexing 또는 pipetting 하지 마십시오. "입력"으로이 DNA를 유지 하 고 필요한 경우 라이브러리 준비를 위해 그것을 사용.
  11. 제조업체의 지시에 따라 fluorometer DNA 농도 측정 ( 테이블의 자료를 참조) 미세 전기 기계와 크기 분포를 확인 하 고 ( 그림에에서 표시 된 대표적인 데이터 참조 2A). 사용 10 ng 또는이 분석 결과 대 한 더 적은 DNA.
    참고: 100-500의 기본적인 쌍 (bp)의 파편 DNA의 50% 이상을 해야 합니다.

5. 친 화력 정화 반대로 플래그 항 체에 의해

참고: 신경 tChIP-Seq, 8 쥐에서 뇌 조직은 일반적으로 사용 tChIP-Seq의 한 샘플에 대 한 2를 준비 하 협동 면역-정화에 의해 순화 된 DNA의 ng (단계 7.1 참조). 우리의 손에서 0.1 ng의 DNA 여전히 제공 높은 품질 DNA 라이브러리 칩 Seq (회, 미 출판). 따라서, 이론적으로, 단일 마우스 신경 tChIP-이 수행 하기에 충분 한 있을 수 있습니다. 필요한 금액은 관심의 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 되어야 합니다. Imumuno 정화 실험의 부정적인 컨트롤에 대 한 뇌 조직의 lysate H2B 플래그 식 없이 쥐에서 해야 될 준비 하 고 사용.

  1. 단백질 낮은 바인딩 튜브로 양 반 마우스 면역 글로불린 G (IgG)를 활용 하는 자석 구슬의 200 µ L 플라스틱
  2. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 상쾌한, 얼음 처럼 차가운 PBS 및 소용돌이의 1 mL을 추가. (총에서 두 세척)이이 단계를 반복 합니다.
  3. 1 mg/mL 반대로 플래그 항 체의 20 µ L을 추가 하 고 5 h 4 ° c.에 대 한 회전
    참고:이 외피는 하룻밤을 확장할 수 있습니다.
  4. 워시 다음 단계 5.2 구슬. 15 mL 튜브에 비즈를 놓습니다.
  5. RIPA 버퍼의 1110 µ L에 구슬 resuspend 하 고 차단 하는 시 약 180 Denhardt의 솔루션 x 50 µ L, 프로 테아 제 억제 물 칵테일, x 100의 10 µ L, 3 단계에서에서 준비 lysate의 6.8 mL x 10의 900 µ L를 추가 합니다. 5 단백질 낮은 바인딩 튜브에이 혼합물을 분할. 6 h 4 ° c.에 대 한 회전
    참고:이 외피는 하룻밤을 확장할 수 있습니다.
  6. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 삭제는 상쾌한 RIPA 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 이 단계를 반복 하 여 5 회 (총에서 6 세척). 단일 단백질 낮은 바인딩 관으로 모든 구슬 풀.
  7. 칩 차입 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 회전. 4.11 ( 그림 2B와 C에서처럼 대표적인 데이터 참조) 단계에서 설명한 대로 DNA의 품질을 확인 합니다. 즉시 다음 단계를 진행 합니다.

6. 친 화력 정화 안티-H3K4me3 항 체와 역방향 가교에 의해

참고: 있는 다음 구슬 준비 단계 (6.1-6.4) 단계 5.7 하기 전에 수행 되어야 한다.

  1. 2 mL-단백질 낮은 바인딩 튜브로 양 반 마우스 IgG에 활용 된 자석 구슬의 40 µ L 플라스틱
  2. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 삭제는 상쾌한, 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. (총에서 두 세척)이이 단계를 반복 합니다.
  3. 1 mg/mL 안티-H3K4me3 항 체의 4 µ L을 추가 하 고 6 h 4 ° c.에 대 한 회전
  4. 워시 다음 단계 6.2 구슬. 2 mL 단백질 낮은 바인딩 관으로 구슬 놓습니다.
  5. RIPA 버퍼의 1558 µ L에 구슬 resuspend 하 고 차단 하는 시 약, Denhardt의 솔루션 x 50의 40 µ L, 프로 테아 제 억제 물 칵테일, x 100의 2 µ L 및 준비 단계 5.7 eluate의 200 µ L x 10의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 회전
    참고: 칩 차입 버퍼에 SDS이이 외피에 10 배 이상 희석 되었다.
  6. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 삭제는 상쾌한 RIPA 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 이 단계를 반복 하 여 4 회 (총에서 5 세척). 마지막 세척 후 DNA 낮은 바인딩 튜브에 비즈를 전송 하 고 삭제는 상쾌한.
  7. 칩 차입 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 회전. 새로운 DNA 낮은 bindingTube는 eluate 전송.
    참고:는 eluate-80 ° c.에 저장 될 수 있다
  8. DNA의 decrosslinking에 대 한 4 단계를 따릅니다. 20 µ L의 TE 버퍼에 순화 된 DNA를 resuspend.
  9. 4.11 ( 2D 그림에에서 표시 된 대표적인 데이터 참조) 단계에서 설명한 대로 DNA의 품질을 확인 합니다. (선택 사항) 양이 많은 PCR에 의해 농축 분석 수행 이전2에 설명 된 대로. Ten-fold 또는 큰 농축을 관찰 해야 합니다.

7. 도서관 건축

  1. 각 입력 및 칩 DNA 샘플에 대 한 미세 전기 기계에 대 한 소프트웨어의 얼룩 분석 기능을 사용 하 여 100-500-bp 지역에서 DNA의 비율을 계산 합니다. 추정 2를 얻을 하는 데 필요한 샘플 볼륨 100-500 bp DNA의 ng. 100-500-혈압 범위에 20 ng DNA를 사용 하 여 "입력된" 샘플으로.
  2. DNA 샘플 8 스트립 PCR 튜브에 플라스틱 고 다음 최종 수리 반응 및 크기 선택 H2O 10 µ L. (선택 사항) 총 볼륨을가지고 DNA의 볼륨 10 µ L, 비율을 초과 하는 경우를 추가 합니다.
  3. 준비 끝-복구 마스터 믹스 ( 재료의 표참조). DNA에 최종 복구 마스터 믹스의 4 µ L을 추가 하 고 20 ° c.에 30 분 동안 품 어
  4. 10 mM Tris-Cl, pH 8.5의 36 µ L을 추가 하 고 고체의 0.6 x 볼륨 (30 µ L) 가역 immobilization (SPRI) 자석 구슬 상 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  5. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.
  6. 새로운 튜브에는 상쾌한 전송 SPRI 자석 구슬, 1.2 x 볼륨 (60 µ L)를 추가 하 고 실 온에서 5 분을 품 어.
  7. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.
  8. 80%의 200 µ L로 두 번 구슬을 씻어 EtOH, 자석에 여전히 튜브를 들고.
  9. 짧게 원심 튜브 하단에 잔여 EtOH를 수집 하 고 다시 제자리에 자석. 잔여 EtOH를 철저 하 게 제거 합니다.
  10. 관 뚜껑을 증발 EtOH 수 있도록 1-2 분 동안 열어 둡니다.
  11. 뚜껑 닫고 얼음에 튜브를 유지 합니다.
    참고: 지금 당신을 가져올 구슬에 100-500 bp의 DNA 크기 선택. 더블 사이즈 선택에 대 한 자세한 내용은 제조업체의 웹 사이트 (www.beckman.com)에서 찾을 수 있습니다.
  12. A-미행 마스터 준비 믹스 ( 재료의 표참조).
  13. A-미행 마스터 믹스의 10 µ L로 (단계 7.10)에서 구슬 resuspend와 30 ° c.에 30 분 동안 품 어
  14. 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 1.8 x 볼륨 (18 µ L)를 추가 / NaCl 솔루션 및 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  15. 단계 7.7-7.11 DNA를 정화 합니다.
  16. 결 찰 버퍼 믹스를 준비 ( 재료의 표참조).
  17. 플라스틱 (에서 단계 7.14) 구슬에 결 찰 버퍼 믹스의 8 µ L, 1 µ M 어댑터의 1 µ L을 추가 하 고 구슬 resuspend. 5 µ M 어댑터의 1 µ L를 사용 하 여 입력된 샘플에 대 한. 다중화 각 샘플에 대 한 다른 어댑터를 사용 하는 것이 좋습니다.
  18. DNA 리가의 1 µ L을 추가 하 고 20 ° c.에 15 분 동안 품 어
  19. 못/NaCl 솔루션의 1.0 x 볼륨 (10 µ L)를 추가 하 고 resuspend 구슬, 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  20. 단계 7.7-7.10 DNA를 정화 합니다.
  21. 25 µ L 10 mM Tris-Cl, 튜브에 pH 8.5의 플라스틱 그리고 resuspend 구슬.
  22. 못/NaCl 솔루션의 1.0 x 볼륨 (25 µ L)를 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  23. 단계 7.7-7.10 DNA를 정화 합니다.
  24. 11 µ L 10 mM Tris-Cl, 튜브에 pH 8.5의 플라스틱 그리고 resuspend 구슬.
  25. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.
  26. 새로운 8 스트립 PCR 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다.
  27. 실시간 PCR 마스터 믹스를 준비 (자세한 자료 참조).
  28. 384 잘 정량 PCR (정량) 접시에 실시간 PCR 마스터 믹스 8.5 µ L 플라스틱 하 고 어댑터의 1.5 µ L 출혈 (단계 7.26)에서 DNA를 추가 합니다.
  29. 빈 우물에 각 형광 표준의 10 µ L 플라스틱
  30. 다음 프로그램으로 실시간 PCR 수행: (45 98 ° C s) 1 주기, x (15 98 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s) 20 주기 x 그리고 (60 72 ° C s) 1 주기 x.
  31. PCR 주기 형광 표준 2의 형광 강도 도달 하는 데 필요한 수를 결정 합니다.
  32. PCR 마스터 준비 믹스 ( 재료의 표참조).
  33. (단계 7.26)에서 나머지 어댑터 출혈 DNA에 PCR 마스터 믹스의 11.5 µ L 플라스틱 고 같이 단계 7.30 PCR 주기 단계 7.31에서와 PCR을 수행 합니다.
  34. 못/NaCl 솔루션의 1.0 x 볼륨 (20 µ L)를 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  35. 단계 7.7-7.10 DNA를 정화 합니다.
  36. 20 µ L 10 mM Tris-Cl, 튜브에 pH 8.5의 플라스틱 그리고 resuspend 구슬.
  37. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.
  38. 새로운 1.5 mL-DNA 낮은 바인딩 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다.
  39. 4.11 ( 그림 2E와 F에표시 된 대표적인 데이터 참조) 단계에 설명 된 대로 라이브러리의 품질을 확인 합니다. 라이브러리 DNA 샘플의 1 µ L을 사용 합니다. (선택 사항) 앞에서 설명한 2정량 여 농축 분석을 수행 합니다. Ten-fold 또는 큰 농축을 관찰 해야 합니다.

8입니다. 시퀀싱

  1. 다음-세대 시퀀서에서 라이브러리 순서 (대표 데이터 그림3 참조).
    참고: 시퀀스 깊이 데이터 분석에 대 한 충분 한 유기 체3의 게놈 크기에 따라 달라 집니다. 인간을 위한 마우스, 우리 적어도 20-40 백만 일자형 읽기를 얻는 것이 좋습니다. 읽기의 수익률에 따라 멀티플렉싱 비용 효과적인 수 있습니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리 조직 절 개, 고정, 세포 세포의 용 해, 탠덤 정화 chromatin, 및 DNA 도서관 준비 다음-세대 시퀀서에 대 한 설명. 절차, 중 하나는 여러 단계 (그림 2)에서 성공적인 시퀀싱 열쇠 DNA의 품질을 테스트할 수 있습니다. 때문에 단일 nucleosome 147 bp DNA 4로 일반적으로 둘러싸여, 전단된 DNA 크기 보다 짧은 수 없습니다. Ultrasonication, 직후 DNA는 고립 되었고 미세 전기 기계 (그림 2A)에서 실행. 크기 범위를 최적화 하기 위해 우리의 최선의 노력에도 불구 하 고 우리는 여전히 unsheared 유지 (약 2 kbp) DNA의 인구가 있었다. 이 단계에서 100-500 bp에서 배열 하는 DNA의 분수는 인구의 50% 이상 이어야 한다. 반대로 플래그 항 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 프로토콜 플래그 태그 H2B 표현의 tamoxifen 주입에 의해 유도 된다 마우스 뇌의 뉴런에 대 한 최적화 되었다. 발기인 H2B 식, 시작 조직 자료의 양과 조직에 사용 되는 성공적인 tChIP-이 대 한 중추적인 매개 변수 따라서, 이러한 요소의 최적화 관심의 각 세포 유형에 대 한 고려 되어야 한다.

이 프로토콜에 사용 되는 절차 중 중요 한 단계는 100-500 bp5는 chromatin 길이를 전단 하는 DNA 이다. 일반적으로, ultrasonication 단계 표준화 이후 매우 다양 한 요인;에 따라 도전 고정 조건, 사용 하는 조직, 울트라-쥡니다, 사용 장비 및 장비 설정, 다른 사람의 사이에서. 따라서,이 DNA의 전단 단계의 재판 및 오류 최적화 개별 실험에 필요한 것입니다. 울트라-쥡니다, 대신 micrococcal nuclease 치료 순진한 칩 방법6사용 단일...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 원고의 중요 한 독서의 이와사키 연구소의 모든 구성원을 감사합니다. 이 작품은 의해 부분적으로 지원 한 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (S.N. 고 S.I. 하 JP17H05679 #26113005); 젊은 과학자 들에 대 한 특정 (A) (JP17H04998 S.I. 하) 교육, 과학, 스포츠, 및 일본 (MEXT);의 문화에서 그리고는 개척 프로젝트 "세포 진화"와 모든 RIKEN 프로젝트 "질병 및 Epigenome" RIKEN에서 (S.N. S.I. 하)입니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
단백질 LoBind tube, 2 mLEppendorfNo.  0030108132세포 용해용
Protein LoBind tube, 1.5 mLEppendorfNo.  0030108116ChIP 및 라이브러리 준비용
DNA LoBind tube, 1.5 mLEppendorfNo.  0030108051ChIP 및 라이브러리 준비용
8-strip PCR tubeBIO-BIK3247-00ChIP 및 라이브러리 준비용
SK MillTOKKENSK-200고정용 세포 분말을 만드는 편리한 극저온 분쇄
금속 총알TOKKENSK-100-DLC10SK Mill
2 mL 스테인리스 스틸 튜브TOKKENTK-AM5-SUS셀 옵션 용해
2mL 스테인리스 스틸 튜브 홀더TOKKENSK-100-TL세포 용해 옵션
16% 포름알데히드(w/v), 메탄올 프리Pierce28906세포를 고정합니다. 사용하기 전에 1% 용액을 준비하십시오.
GlycineNacalai Tesque17109-352.5 M 재고
준비 D-PBS (-) (1x)Nacalai Tesque14249-24세척 용해물 및 정제 DNA
HEPESNacalai Tesque02443-05용해 버퍼 1. 1M, pH 7.5 스톡을 준비합니다.
5 M NaCl, 분자 생물학 등급Nacalai Tesque06900-14용해 버퍼 1, 용해 버퍼 2, ChIP 용리 버퍼 및 Tris-EDTA-NaCl 버퍼
0.5 M EDTA, 분자 생물학 등급Wako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075용해 완충액 1, 용해 완충액 2, ChIP 용출 완충액 및 Tris-EDTA-NaCl 완충액
글리세롤Wako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945용해 버퍼 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75용해 버퍼 1
Triton X-100, 분자 생물학 등급Nacalai Tesque12967-32용해 버퍼 1
TrisNacalai Tesque35406-91용해 버퍼 2, ChIP 용리 버퍼 및 Tris-EDTA-NaCl 버퍼. 1M, pH 8.0 스톡을 준비합니다.
0.1 M EGTA pH 중성Nacalai Tesque08947-35용해 버퍼 2
프로테아제 억제제 칵테일 (100x)Nacalai Tesque25955-24단백질
분해 차단 RIPA 버퍼Thermo Fisher Scientific89900세포 용해 및 세척 milliTUBE
1 mL AFA FiberCovaris520130초음파 처리 튜브. 집속 초음파의 액세서리
집속 초음파기CovarisS220 또는 E220DNA를 ChIP-Seq
UltraPure 10 % SDSThermo Fisher Scientific15553-027ChIP 용리 완충액
RNase ANacalai Tesque30141-14용해물에서 DNA를 정제하기 위해
Proteinase K, 재조합, PCR 등급Sigma-Aldrich3115887001에서 DNA를 정제하기 위해
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225마우스
Sigma-AldrichF1804에서 생성된 70% 용액 단클론 항 FLAG M2 항체관심 세포에서 발현된 염색질을 정제하기 위해
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgGThermo Fisher Scientific11201D이것은 anti-FLAG IP 및 anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), 마우스 단클론 항체.301-34811ChIP 분석을 위해 작동하는 다른 항체는
10x 차단 시약Sigma-Aldrich11096176001친화성 정제 중 차단을 위해
Denhardt' s 용액Nacalai Tesque10727-74친화성 정제 중 차단용
글리코겐(5 mg/ml)Thermo Fisher ScientificAM9510용해물에서 DNA를 정제하기 위해
Qubit 2.0 형광측정기Thermo Fisher ScientificQ32866분리된 DNA의 정량화용
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32851분리된 DNA의 정량화용
0.5 mL 튜브Axygen10011-830Qubit
페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1)Nacalai Tesque25970-56DNA를 정제하기 위해
Beckman CoulterA63881SPRI 마그네틱 비드 라이브러리 준비용
금속 얼음 선반FunakoshiIR-1세포 용해물을 동결
상태로 유지하기 위해Sample CoolerNew England BiolabsT7771S최소한의 손상으로 세포 고정을 돕습니다
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BA분리된 DNA 단편의 품질을 확인합니다. 다른 프래그먼트 분석기를 사용할 수 있습니다.
Bioanalyzer 2100 Expert 소프트웨어Agilent TechnologiesG2946CA
High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626된 DNA 단편의 품질을 확인하기 위해
KAPA LTP Library Preparation KitRoche0796189800110x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase 및 PEG/NaCl 용액
NEXTflex DNA 바코드BIOO ScientificNOVA-514101어댑터와 함께 제공라이브러리 준비용. DNA 바코드 어댑터 및 Primer Mix와 함께 제공됩니다.
KAPA 실시간 라이브러리 증폭 키트Roche079590280012x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix 및 형광 표준과 함께 제공
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602라이브러리 준비용. 또한 이 효소는 KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, pH 8.5 DNA
386-well qPCR 플레이트Thermo Fisher Scientific4309849Real-Time PCR을 위해
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR 시스템Thermo Fisher Scientific4485701을 정량화하는
.Thermo Fisher Scientific4311971For Real-Time
PCR MicroAmp 투명 접착 필름Thermo Fisher Scientific4306311플레이트 씰링용
End-repair 마스터 믹스콤바인 1.4 µ 10x KAPA 엔드 리페어 버퍼의 L, 1 µ KAPA 끝 수선 효소 혼합물의 L, 및 1.6 µ L의 H2O
A-taling 마스터 믹스결합 1 µ KAPA A-테일링 버퍼의 L, 0.6 &마이크로; KAPA A 테일링 효소의 L 및 8.4 µ H2O
결찰 완충액 혼합물2 µ 결합; KAPA 결찰 완충액의 L 및 6µ H2O
실시간 PCR 마스터 믹스5 & 마이크로를 결합합니다. 2x KAPA HiFi HS 실시간 PCR 마스터 믹스의 L, 0.35 &마이크로; PCR 프라이머 믹스의 L (10 &마이크로; M의 정방향 프라이머 AATGATACGGCGACCACCGAG 및 리버스 프라이머 CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), 및 3.15 &마이크로; H2O
PCR 마스터 믹스10 µ 결합; 2x KAPA HiFi Ready Mix의 L, 0.9 µ PCR 뇌관 혼합의 L, 및 0.6 &마이크로; L of H2O
Integrative Genomics ViewerBroad InstituteIGV_2.3.88염기서열분석 데이터를 시각화하기 위한 게놈 브라우저
DNA 올지오뉴클레오티드: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′Eurofins Genomics의 프로모터 영역을 증폭하는 프라이머
: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′Eurofins Genomics: GAPDH
SYBR Premix Ex TaqTakaraRR420LGADPH 프로모터 영역에 해당하는 DNA를 정량화하기 위해
, Thermal Cycler, DiceTakaraTP870GADPH 프로모터 영역에 해당하는 DNA를 정량화하기 위해
기 의 액세서리 에 적합한 크기로 소화하기 위해 용해물 에탄올 만들기 에 사용할 수 있습니다, 에 의한 정량화 용 용해물 AMPure XP 비드에서 Bioanalyzer 과 함께 제공됩니다. 분리의 용출을 위해 DNA MicroAmp 광학 접착 필름 데 필요할 수 있습니다의 L 의 L 의 L : GAPDH DNA 올지오뉴클레오티드프로모터 영역에 해당하는 DNA를 정량화하기 위해, ,

References

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