TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

요약

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

초록

후 성적인 규정 유전자 발현에 있는 중앙 역할을 재생합니다. 히스톤 수정 1960 년대에서 발견 되었다, 이후 그 생리 및 병 적인 기능 광범위 하 게 공부 되었다. 실제로, 다음-세대 깊은 시퀀싱 및 특정 히스톤 수정 항 체를 통해 chromatin immunoprecipitation (칩)의 출현 게놈에 걸쳐 후 성적인 규칙의 우리의 보기를 혁명 하고있다. 반대로, 조직 일반적으로 다양 한 종류의 세포를 구성 하 고 그들의 복잡 한 혼합물 특정 세포 유형에 epigenome 조사 분석 도전 포즈. 게놈 넓은 방식 셀 유형 특정 chromatin 상태를 해결 하기 위해 우리는 최근 협동 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq), chromatin의 선택적 정화 셀에서 태그 코어 히스톤 단백질에 의해 기반으로 개발 뒤에 칩이 관심의 종류 이 프로토콜의 목표는 tChIP이 모범 사례 소개 이 기술은 다양 한 히스톤 수정 및 모형 유기 체에서 조직 관련 epigenome 조사에 대 한 다양 한 도구를 제공합니다.

서론

다양 한 세포 유형 동물의 조직에 의하여 이루어져 있다. 유전자 규칙 각 셀에 셀 형식을 정의합니다. Chromatin 수정 DNA 메 틸 화와 히스톤 수정-셀 형 특이성 유전자 발현의 기반이 됩니다. 따라서, 각 세포 유형에 있는 후 성적인 규정의 측정, 원하는 하지만 그것은 기술적인 도전 하고있다.

특정 셀 형식에 epigenetics 조사, 탠덤 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 최근 개발 된 (그림 1)¹했다. TChIP에 피토 프 태그 코어 히스톤 단백질 H2B 셀 형식 관련 발기인에서 표현 된다. 소재는 다양 한 종류의 세포 혼합물에서 시작 하지만이 기능은 관심의 세포에서 chromatins의 절연이 있습니다. 다음 칩 Seq-히스톤 수정 마크와의 다음-세대 깊은 시퀀싱을 통해 chromatin 정화 절연 DNA-우리 게놈 넓은 방식 대상된 세포 유형의 후 성적인 상태를 모니터링할 수 있습니다.

이 기술을 사용 하 여, 우리 신경 관련 trimethylation 히스톤 H3 리 4....

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드를 RIKEN (H27-EP071)의 안전 부문에 의해 승인 하 고 관련 지침 및 규정 실시 되었습니다.

1. 조직 해 부

1. 작은 조각으로 관심의 조직 부 (약 < 3 m m²) 좋은 봄이 위를 사용 하 여.
   참고: 큰 조직 파편, 동결 하는 데 걸리는 그리고 작은 조각 버퍼, 결과 영향을 미칠 수 있습니다 둘 다의 더 큰 볼륨에 수행 한다.
2. 액체 질소로 채워진 깨끗 한 용기에 해 부 조직 파편을 추가 하 고 액체 질소로 채워진 2 mL 튜브 (관 당 1 조각)으로 그들을 수집 합니다.
   참고:이 단계는 친수성 표면 튜브 권장 됩니다.
3. > 5 분 남은 액체 질소를 증발 오픈 캡-80 ° C에서 튜브를 놓습니다.
   참고: 뚜껑을 닫은 후 조직 조각은 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 사용 하기 전에 한 달 동안.

2. 셀 고정

참고: 우리는이 단계에 대 한 편리한 저온 분쇄기를 사용. 다른 장치를 사용할 수 있습니다.

1. 장소는 2 mL 단백질 낮은 바인딩 튜브 금속 얼음 선반에 조직 샘플을 포함 하는 액체 질....

결과

여기, 우리 조직 절 개, 고정, 세포 세포의 용 해, 탠덤 정화 chromatin, 및 DNA 도서관 준비 다음-세대 시퀀서에 대 한 설명. 절차, 중 하나는 여러 단계 (그림 2)에서 성공적인 시퀀싱 열쇠 DNA의 품질을 테스트할 수 있습니다. 때문에 단일 nucleosome 147 bp DNA ⁴로 일반적으로 둘러싸여, 전단된 DNA 크기 보다 짧은 수 없습니다. Ultrasonication, 직후 DNA는 고립 되었고 미세 전기 기계 (그림 2A)에서 실행. 크기 범위를 최적화 하기 위해 우리의 최선의 노력에도 불구 하 고 우리는 여전히 unsheared 유지 (약 2 kbp) DNA의 인구가 있었다. 이 단계에서 100-500 bp에서 배열 하는 DNA의 분수는 인구의 50% 이상 이어야 한다. 반대로 플래그 항 .......

토론

우리의 프로토콜 플래그 태그 H2B 표현의 tamoxifen 주입에 의해 유도 된다 마우스 뇌의 뉴런에 대 한 최적화 되었다. 발기인 H2B 식, 시작 조직 자료의 양과 조직에 사용 되는 성공적인 tChIP-이 대 한 중추적인 매개 변수 따라서, 이러한 요소의 최적화 관심의 각 세포 유형에 대 한 고려 되어야 한다.

이 프로토콜에 사용 되는 절차 중 중요 한 단계는 100-500 bp⁵는 chromatin 길이를 전단 하는 DNA 이다. 일반적으로, ultrasonication 단계 표준화 이후 매우 다양 한 요인;에 따라 도전 고정 조건, 사용 하는 조직, 울트라-쥡니다, 사용 장비 및 장비 설정, 다른 사람의 사이에서. 따라서,이 DNA의 전단 단계의 재판 및 오류 최적화 개별 실험에 필요한 것입니다. 울트라-쥡니다, 대신 micrococcal nuclease 치료 순진한 칩 방법⁶사용 단일.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
단백질 LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No.  0030108132	세포 용해용
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No.  0030108116	ChIP 및 라이브러리 준비용
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No.  0030108051	ChIP 및 라이브러리 준비용
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	ChIP 및 라이브러리 준비용
SK Mill	TOKKEN	SK-200	고정용 세포 분말을 만드는 편리한 극저온 분쇄
금속 총알	TOKKEN	SK-100-DLC10	SK Mill
2 mL 스테인리스 스틸 튜브	TOKKEN	TK-AM5-SUS	셀 옵션 용해
2mL 스테인리스 스틸 튜브 홀더	TOKKEN	SK-100-TL	세포 용해 옵션
16% 포름알데히드(w/v), 메탄올 프리	Pierce	28906	세포를 고정합니다. 사용하기 전에 1% 용액을 준비하십시오.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	2.5 M 재고
준비 D-PBS (-) (1x)	Nacalai Tesque	14249-24	세척 용해물 및 정제 DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	용해 버퍼 1. 1M, pH 7.5 스톡을 준비합니다.
5 M NaCl, 분자 생물학 등급	Nacalai Tesque	06900-14	용해 버퍼 1, 용해 버퍼 2, ChIP 용리 버퍼 및 Tris-EDTA-NaCl 버퍼
0.5 M EDTA, 분자 생물학 등급	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	용해 완충액 1, 용해 완충액 2, ChIP 용출 완충액 및 Tris-EDTA-NaCl 완충액
글리세롤	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	용해 버퍼 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	용해 버퍼 1
Triton X-100, 분자 생물학 등급	Nacalai Tesque	12967-32	용해 버퍼 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	용해 버퍼 2, ChIP 용리 버퍼 및 Tris-EDTA-NaCl 버퍼. 1M, pH 8.0 스톡을 준비합니다.
0.1 M EGTA pH 중성	Nacalai Tesque	08947-35	용해 버퍼 2
프로테아제 억제제 칵테일 (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	단백질
분해 차단 RIPA 버퍼	Thermo Fisher Scientific	89900	세포 용해 및 세척 milliTUBE
1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	초음파 처리 튜브. 집속 초음파의 액세서리
집속 초음파기	Covaris	S220 또는 E220	DNA를 ChIP-Seq
UltraPure 10 % SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	ChIP 용리 완충액
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	용해물에서 DNA를 정제하기 위해
Proteinase K, 재조합, PCR 등급	Sigma-Aldrich	3115887001	에서 DNA를 정제하기 위해
	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	마우스
Sigma-Aldrich	F1804	에서 생성된 70% 용액 단클론 항 FLAG M2 항체	관심 세포에서 발현된 염색질을 정제하기 위해
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	이것은 anti-FLAG IP 및 anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), 마우스 단클론 항체	.	301-34811	ChIP 분석을 위해 작동하는 다른 항체는
10x 차단 시약	Sigma-Aldrich	11096176001	친화성 정제 중 차단을 위해
Denhardt' s 용액	Nacalai Tesque	10727-74	친화성 정제 중 차단용
글리코겐(5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	용해물에서 DNA를 정제하기 위해
Qubit 2.0 형광측정기	Thermo Fisher Scientific	Q32866	분리된 DNA의 정량화용
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	분리된 DNA의 정량화용
0.5 mL 튜브	Axygen	10011-830	Qubit
페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1)	Nacalai Tesque	25970-56	DNA를 정제하기 위해
	Beckman Coulter	A63881	SPRI 마그네틱 비드 라이브러리 준비용
금속 얼음 선반	Funakoshi	IR-1	세포 용해물을 동결
상태로 유지하기 위해Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	최소한의 손상으로 세포 고정을 돕습니다
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	분리된 DNA 단편의 품질을 확인합니다. 다른 프래그먼트 분석기를 사용할 수 있습니다.
Bioanalyzer 2100 Expert 소프트웨어	Agilent Technologies	G2946CA
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	된 DNA 단편의 품질을 확인하기 위해
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase 및 PEG/NaCl 용액
NEXTflex DNA 바코드	BIOO Scientific	NOVA-514101	어댑터와 함께 제공라이브러리 준비용. DNA 바코드 어댑터 및 Primer Mix와 함께 제공됩니다.
KAPA 실시간 라이브러리 증폭 키트	Roche	07959028001	2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix 및 형광 표준과 함께 제공
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	라이브러리 준비용. 또한 이 효소는 KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 DNA
386-well qPCR 플레이트	Thermo Fisher Scientific	4309849	Real-Time PCR을 위해
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR 시스템	Thermo Fisher Scientific	4485701	을 정량화하는
.	Thermo Fisher Scientific	4311971	For Real-Time
PCR MicroAmp 투명 접착 필름	Thermo Fisher Scientific	4306311	플레이트 씰링용
End-repair 마스터 믹스			콤바인 1.4 µ 10x KAPA 엔드 리페어 버퍼의 L, 1 µ KAPA 끝 수선 효소 혼합물의 L, 및 1.6 µ L의 H2O
A-taling 마스터 믹스			결합 1 µ KAPA A-테일링 버퍼의 L, 0.6 &마이크로; KAPA A 테일링 효소의 L 및 8.4 µ H2O
결찰 완충액 혼합물			2 µ 결합; KAPA 결찰 완충액의 L 및 6µ H2O
실시간 PCR 마스터 믹스			5 & 마이크로를 결합합니다. 2x KAPA HiFi HS 실시간 PCR 마스터 믹스의 L, 0.35 &마이크로; PCR 프라이머 믹스의 L (10 &마이크로; M의 정방향 프라이머 AATGATACGGCGACCACCGAG 및 리버스 프라이머 CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), 및 3.15 &마이크로; H2O
PCR 마스터 믹스			10 µ 결합; 2x KAPA HiFi Ready Mix의 L, 0.9 µ PCR 뇌관 혼합의 L, 및 0.6 &마이크로; L of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	염기서열분석 데이터를 시각화하기 위한 게놈 브라우저
DNA 올지오뉴클레오티드: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		의 프로모터 영역을 증폭하는 프라이머
: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		: GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	GADPH 프로모터 영역에 해당하는 DNA를 정량화하기 위해
, Thermal Cycler, Dice	Takara	TP870	GADPH 프로모터 영역에 해당하는 DNA를 정량화하기 위해

기 의 액세서리 에 적합한 크기로 소화하기 위해 용해물 에탄올 만들기 에 사용할 수 있습니다, 에 의한 정량화 용 용해물 AMPure XP 비드에서 Bioanalyzer 과 함께 제공됩니다. 분리의 용출을 위해 DNA MicroAmp 광학 접착 필름 데 필요할 수 있습니다의 L 의 L 의 L : GAPDH DNA 올지오뉴클레오티드프로모터 영역에 해당하는 DNA를 정량화하기 위해, ,