Method Article

라벨-무료 3 차원 양적 위상 이미징 사용 하 여 림프 구의 식별 및 기계 학습

DOI:

10.3791/58305

⸱

November 19th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Cambridge, 2Department of Physics, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 림프 구 정량 위상 이미징 및 기계 학습 알고리즘을 사용 하 여 레이블 없는 식별 프로토콜을 설명 합니다. 림프 톨의 3 차원 굴절률 tomograms의 측정 3D 형태학 및 생화학 정보 개별 셀에 대 한 다음 종류의 식별을 위한 기계 학습 알고리즘으로 분석을 제시.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기의 림프 구 정량 위상 이미징 및 기계 학습을 사용 하 여 레이블 없는 식별 프로토콜을 설명 합니다. 림프 톨의 식별 진단 면역학의 연구 및 다양 한 질병의 치료에 대 한 중요 하다. 현재, 항 원-항 체 반응을 통해 특정 막 단백질을 라벨에 의존 하는 림프 구 종류를 분류 하기 위한 표준 방법. 그러나, 이러한 라벨 기술을 세포 기능 변경의 잠재적인 위험. 여기에 설명 된 프로토콜 3D 양적 위상 이미징 및 기계 학습 알고리즘에 의해 측정 하는 내장 광학 대조를 이용 하 여 이러한 문제를 극복 한다. 림프 톨의 3 차원 굴절률 (RI) tomograms의 측정 3 차원 형태 및 개별 셀의 고기에 대 한 정량적 인 정보를 제공합니다. 측정 된 3D 리 tomograms에서 추출 생물 매개 변수는 양적 단일 세포 수준에서 림프 구 종류의 식별 라벨 무료 사용 기계 학습 알고리즘으로 분석 됩니다. 우리는 B, T CD4 + 및 CD8 + T 림프 톨의 3D RI tomograms를 측정 하 고 80% 이상으로 그들의 세포 유형 식별 정확도. 이 프로토콜에서 우리는 림프 구 분리, 3D 양적 위상 이미징 및 림프 구 종류를 식별 하기 위한 기계 학습에 대 한 자세한 단계를 설명 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

림프 톨 B, 도우미 (CD4 +) T, 세포 독성 (CD8 +) T, 및 T는 규제를 포함 한 다양 한 하위 유형으로 분류 될 수 있다 세포. 각 림프 구 종류는 다른 역할 적응 면역 체계; 예를 들어 B 림프 톨 생성 항 체, T 림프 톨 특정 항을 검색 하 고 비정상 세포를 제거 하 고, B 림프 톨을 규제 하는 반면. 림프 구 기능 및 규정은 밀접 하 게 의해 제어 되며 암1,2, 자가 면역 질환 및 바이러스 감염3를 포함 하 여 다양 한 질병에 관련 된. 따라서, 림프 구 종류의 식별은 같은 질병에 immunotherapy 클리닉에 대 한 그들의 병 태 생리 역할을 이해 하는 것이 중요.

현재, 림프 구 종류를 분류 하기 위한 방법 특정 표면 막 단백질 또는 표면 마커4를 대상으로 항 원-항 체 반응에 의존 합니다. 표면 마커를 대상으로 림프 구 종류를 결정 하는 정확 하 고 정확한 방법입니다. 그러나, 그것은 비싼 시 약 및 시간이 걸리는 절차를 요구 한다. 또한, 그것은 막 단백질 구조의 수정 및 세포 기능 변경의 위험을 운반합니다.

이러한 문제를 해결 하려면 여기에 설명 된 프로토콜 레이블 없는 신분의 림프 구 종류 (QPI) 이미징 3D 양적 단계5를 학습 하는 기계를 사용 하 여 소개 합니다. 이 메서드는 개별 세포의 레이블 없는 3D 영상에서 추출한 형태학 정보에 따라 단일 셀 수준에서 림프 구 종류의 분류를 수 있습니다. 기존의 형광 현미경 검사 법 기술, 달리 QPI 광학 대조6,7굴절률 (RI) 배포판 (라이브 세포 및 조직의 기본 광학 속성)를 사용합니다. 개별 세포의 RI tomograms 세포의 특정 하위 phenotypic 정보를 나타냅니다. 이 경우에, 개별 세포의 3D RI tomograms를 체계적으로 활용 하는 감독된 기계 학습 알고리즘은 이용 되었다.

다양 한 QPI 기술을 사용 하 여, 셀의 3D RI tomograms 적극적으로 사용 되었습니다 셀 이상의 연구에 대 한 레이블-무료, 제공 하기 때문에 양적 이미징 기능8,,910, 11,,1213. 또한, 개별 셀의 3D 리 배포판 형태학, 생화학, 및 biomechanical 셀에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 3D RI tomograms 이전 혈액학14,15,,1617, 전염병18,19, 의 분야에 이용 되었습니다 20,21면역학, 세포 생물학22,23, 염증24, 암25, 신경 과학26,27, 개발 생물학28, 독극물 29, 그리고 미생물학12,30,,3132.

3D RI tomograms 셀의 자세한 형태학 및 생화학 정보 제공, 림프 구 하위 분류 단순히 3D RI tomograms5을 이미징 하 여 달성 하기 어렵습니다. 체계적으로 그리고 양이 많게 측정된 3D RI tomograms 셀 유형 분류에 대 한 악용, 우리는 기계 학습 알고리즘을 활용. 최근, 여러 작품 보고 되었습니다 어떤 양적 단계에서 셀의 이미지 분석 되었다 다양 한 기계 학습 알고리즘33, 미생물34, 세균성 속35 의 분류의 탐지를 포함 하 여 , 36, 탄 저 균 포자37, 신속 하 고 레이블 없는 감지 자동 정자 세포38의 분석, 암 세포39,40, 분석 및 대 식 세포 활성화41의 검출.

이 프로토콜 3D QPI 및 기계 학습을 사용 하 여 개별 셀 수준에서 림프 구 종류의 레이블 없는 식별을 수행 하는 자세한 단계를 제공 합니다. 이것은 포함 한다: 1) 림프 구 분리 마우스 혈액, 림프 구 2) 3D 리 tomograms에서 흐름 cytometry, 3) 3D QPI, 4) 양적 특징 추출 통해 정렬 및 림프 구 종류를 식별 하는 데 5) 감독된 학습에서.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 관리 및 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 한국 과학 기술원 (KA2010-21, KA2014-01, 및 KA2015-03)의 승인 아래 수행 했다. 이 연구에서 모든 실험 승인된 지침에 따라 실시 했다.

1. 림프 구 별개로 마우스 피

  1. C57BL/6J 마우스는 CO2 흡입을 통해 안락사는, 일단 마우스 마음에 26 G 바늘을 삽입 하 고 0.3 mL의 혈액을 수집. 직접 넣어 혈액 튜브 100 U/mL 헤 파 린 솔루션 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL로 희석.
    참고: 또는, 비장에서 세포 수 고립.
  2. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 관을 원심
  3. 관에 염화 염화 칼륨 lysing 버퍼의 0.5 mL를 추가 하 고 부드럽게 반전 그것을 몇 번 솔루션을 혼합.
  4. 5 분 동안 실내 온도 (RT)에 튜브를 품 어.
  5. 4.5 mL PBS의 추가 하 고 두 번 4 ° C에서 5 분에 대 한 400 x g에서 centrifuging 여 세포를 씻어.
  6. 상쾌한을 제거 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 신선한 RPMI 1640 매체의 100 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend.
  7. 차단에 대 한 튜브를 CD16/32 (2.4G2) 항 체의 0.1 µ g을 추가 합니다.
  8. 얼음에 튜브를 유지.

2. flow Cytometry 및 림프 톨의 정렬

참고: 지상 진리 (즉, 올바른) 셀을 설정 하기 위한 필수적 이다 림프 톨 세포 유형에 따라 정렬 훈련 하 고 감독된 학습에서 셀 유형 분류자를 테스트 레이블을 입력. Cytometry, 골드 표준 방법 림프 톨42분리를 식별 하는 데 사용 됩니다.

  1. 표면 마커 얼룩 신선한 RPMI 1640 매체의 100 µ L에 항 체의 혼합물을 만들기 [10 %FBS, CD3e의 0.1 µ g (17A2), CD8a (53-6.7), CD19 (1 일 3), CD45R (B220, RA3-6B2), 및 NK1.1 (PK136)]와 대상 B, CD4 + T, 및 CD8 + T CD4 (GK1.5) 항 체의 0.25 µ g 림프 톨입니다.
  2. (단계 1.8에서에서 얻은) 세포 현 탁 액에 항 체 혼합물의 100 µ L를 추가 합니다.
  3. 얼음에 25 분 동안 품 어.
  4. PBS의 5 mL을 추가 하 고 두 번 4 ° C에서 5 분에 대 한 400 x g에서 centrifuging 여 세포를 씻어.
  5. 셀 펠 릿 10 신선한 RPMI 1640 매체의 5 ml에서 resuspend %FBS DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)의 2.5 µ g.
  6. Cytometry 위에서 설명한 마커의 형광 레벨을 사용 하 여와 별도로 각 림프 구 종류를 수집 합니다. 동시에 제외 죽은 세포 DAPI 신호를 사용 하 여.
    참고:42흐름 있다 cytometry 기반 셀 정렬에 관한 상세한 프로토콜 기술 이전.

3. 3D 양적 위상 이미징

  1. 세포 손상 및 생 화 확 적인 변경 방지 하기 (마우스에서 림프 구 분리) 이후 5 h 내에서 완료 해야 하는 이미징 절차에 걸쳐 얼음에 정렬 된 세포를 유지.
  2. (B, T CD4 + 및 CD8 + T 림프 톨) 가운데 정렬된 셀 형식을 선택 하 고 샘플 (단계 2.6에서에서 얻은) 최적의 이미징 조건 (즉, 단일 보기 필드 당 하나의 셀)에 대 한 RPMI 매체와 180 셀 / µ L을 희석.
  3. 천천히 주입 하 여 희석된 샘플의 120 μ 이미징 챔버를 로드. 샘플 영상 실에서 거품의 존재에 철저 하 게 확인 하십시오. 거품이 있다면 신중 하 게 제거, 그들은 측정의 품질을 타협 것입니다.
  4. 상업적인 3D 양적 위상 현미경, 또는 holotomography, 및 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 3D RI tomograms를 취득 합니다.
    참고: 실험 설정에 대 한 자세한 내용은 원래 원고5에서 찾을 수 있습니다.
    1. 현미경의 대물 렌즈 위에 증류수 한 방울을 놓습니다.
    2. 현미경의 번역 단계에 샘플 영상 챔버를 놓고 샘플 맞춥니다 대물 렌즈의 위치를 조정 합니다.
    3. 이미징 소프트웨어의 "현미경" 관점의 "보정" 탭에 각각, 초점 및 표면를 클릭 하 여 객관적이 고 콘덴서 렌즈의 축 위치를 조정 합니다.
    4. 자동 모드를 클릭 하 여 객관적이 고 콘덴서 렌즈를 맞춥니다. 또는, 스캔 모드 를 사용 하 고 수동으로 조정 렌즈 조명 패턴 보기의 필드의 중앙 지역에서 지역화 됩니다.
    5. 정상 모드로 돌아갑니다 고 보기 필드에서에서 셀을 찾으려면 번역 단계를 조정 합니다.
    6. 대물 렌즈의 축 위치를 조정 하 여 초점면을 찾아. 완벽 한 집중 하면 화면에서 시각화 샘플 경계 거의 보이지 않습니다.
    7. 셀 없이 위치를 찾을 번역 단계를 조정 합니다.
    8. 다양 한 조명 각도와 여러 2D 홀로그램 측정을 보정 을 클릭 합니다.
    9. 보기의 필드의 중앙에는 셀을 찾을 번역 단계를 조정 합니다.
    10. "수집" 탭으로 이동 하 고 3D 스냅숏 단계 3.4.8에서에서 다 동일한 조명 각도와 셀의 홀로그램을 측정 하기 위해 클릭.
    11. 수집 된 데이터는 "데이터 관리" 패널에 표시 됩니다, 수집 된 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 고 과정 재구성 단계 3.4.8 3.4.10, 회절 단층 촬영 알고리즘을 사용 하 여 측정 하는 홀로그램에서 3D RI tomogram를 클릭 9 , 10 이미징 소프트웨어에 구현입니다.
    12. 기계 학습에 대 한 통계적 인 힘을 위해 100 개 이상의 셀을 측정 하는 단계 3.4.5-3.4.11를 반복 합니다.
    13. 3.4.11 단계를 통해 처리 되는 이미지에 대 한 모든. 구상 될 수 있다. "데이터 관리" 패널에서 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 데이터를 시각화 하려면 열기를 클릭 합니다. "데이터 매니저" 패널에 RI Tomogram를 클릭 합니다. "미리 설정" 탭에서 로드를 클릭 하 고 "lymphocyte.xml"은 3D RI 배포판에 따라 tomogram를 시각화 하기 위해 이미징 소프트웨어에 의해 제공 된 미리 정의 된 전송 기능을 두 번 클릭 합니다.
  5. 3.2-3.4 모든 림프 톨의 3D RI tomograms 측정을 단계를 반복 합니다.

4. 양적 형태학 및 생화학 기능 3D 리 Tomograms에서 추출

  1. 단일 폴더에 위에 측정 모든 단층 촬영 데이터를 배치 합니다. 이 폴더의 하위 폴더에 셀 형식 분할 합니다. 각 tomogram는 단일 .mat 파일을 준비 합니다.
  2. 보조 파일 1 -기능 추출 (이미지 프로세싱 소프트웨어에 대 한 서 면)를 엽니다.
  3. 편집 라인 14 단계 4.1에서 tomogram 폴더를 지정 합니다.
  4. 편집 라인 15 추출된 기능 데이터를 저장 하는 폴더를 지정 합니다.
  5. 필요에 따라 편집 라인 기능 추출에 대 한 RI 임계값 매개 변수를 조정 17. 기본 옵션은 앞에서 설명한50.002의 증가 함께 1.340 1.378에서 20 리 임계값입니다.
  6. 코드를 실행 합니다. 데이터 집합에 있는 모든 tomogram에 대 한 코드 계산 5 특징: 표면 영역 (SA), 세포 볼륨 (CV), 구형 (SI), 단백질 밀도 (PD), 건조 질량 (DM), RI 임계값 당. 기능 추출에 대 한 자세한 알고리즘은 설명 되어5.
  7. 모니터링 기능 추출 하기 위하여 실행 하는 동안 시각화 RI 임계값 기반 셀 분할 화면에서 확인 합니다.
  8. 4.4 단계에서 지정 하는 폴더에 저장 하는 tomogram 당 .mat 파일 추출된 기능 데이터에 확인 하십시오.

5. 감독 학습 및 식별

  1. 임의로 별도 폴더와 훈련 (70%) 및 테스트 (30%)에 4.8 단계 집합에서 가져온 기능 데이터 분할.
  2. 오픈 보조 파일 2 -기차 (이미지 프로세싱 소프트웨어에 대 한 서 면).
  3. 편집 라인 14 단계 5.1에서에서 준비 학습 집합을 지정 합니다.
  4. 편집 라인 훈련된 분류자를 저장 하는 폴더를 지정 하는 16.
  5. 편집 라인 17 분류자에 대 한 파일 이름을 설정 합니다.
  6. 필요에 따라 선 훈련에 대 한 기능을 선택 하려면 19 편집. 기본 옵션 지정 이전5, 아래의 대표적인 결과 얻기 위해 사용 되었다.
  7. 코드를 실행 합니다. 학습 집합의 선택 된 기능을 사용 하 여 코드 열차 k분류자-가장 가까운 이웃 알고리즘 (k-NN; k = 4) 다음 (단계 5.5에서에서 이름)으로 하는 분류자 단계 5.4에서에서 지정 하는 폴더에 저장.
  8. 분류자 성능 및 교차 유효성 검사 정확도 시각화 화면에서 확인 합니다.
  9. 필요한 경우, 단계 5.5-5.7를 반복 하 여 다른 기능 조합으로 여러 개의 분류자를 기차. 다음 가장 높은 교차 유효성 검사 정확도 분류자를 선택 합니다.
  10. 보조 파일 3 -테스트를 열고 (이미지 프로세싱 소프트웨어에 대 한 서 면).
  11. 편집 라인 14-15 테스트 훈련 된 분류자를 지정 합니다.
  12. 편집 라인 17 단계 5.1에서에서 준비 된 테스트 집합을 지정 합니다.
  13. 코드를 실행 합니다. 위에서 설명한 분류자는 테스트 집합에 개별 세포의 세포 유형 식별 합니다.
  14. 식별 및 테스트 정확도 시각화 화면에서 확인 합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 1 전체 프로토콜의 구조 과정을 보여 줍니다. 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리 B 고립 (n = 149), CD4 + T (n = 95), 및 CD8 + T (n = 112) 림프 톨. 다양 한 각도에서 조명의 위상 및 진폭 정보를 얻으려면 각 림프 톨의 여러 2D 홀로그램 (60 °-60 °)에서 조명의 각도 변경 하 여 측정 되었다. 일반적으로, 50 홀로그램 3D RI tomogram 재구성을 사용할 수 있습니다 하지만 이미징 속도 품질을 고려 하 고 2D 홀로그램의 수를 조정할 수 있습니다. 푸리에 변환43,44에 따라 필드 검색 알고리즘을 사용 하 여 측정 된 홀로그램의 진폭 및 위상 정보를 검색 합니다. 각 림프 톨의 3D RI tomogram 여러 2D 검색된 위상 및 진폭 정보...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

선물이 3D 양적 위상 이미징 및 기계 학습을 이용 하는 림프 구 종류의 레이블 없는 식별을 가능 하 게 하는 프로토콜. 이 프로토콜의 중요 한 단계는 양적 위상 이미징 및 기능을 선택 합니다. 최적의 홀로그램 영상에 대 한 위에 설명 된 대로 셀의 밀도 제어 한다. 셀의 기계적 안정성도 부동 또는 진동 세포 움직임 조명 각도 변화에 따라 홀로그램 측정을 방해 하기 때문에 정확한 3D RI 분포를 얻기 위해 중요 하다. 우리는, 따라서 샘플 된 안정적이 고 정적 이미징 챔버에 홀로그램을 측정 하기 전에 때까지 몇 분 정도 기다렸다. 홀로그램 공기와 샘플; 사이 리 차이 측정할 때 마지막으로, 이미징 챔버 내부 거품 문제가 있다 따라서, 샘플 영상 실로 신중 하 게 적재 되어야 한다.

특징 추출 및 선택 분류자의 식별 성능을 확인할. 5 양적 형태학 (CV, SA, SI) 계산 및 생화학 (PD, DM) 20 다른 RI 임계값 값; 3D 리 유통에서 기능 따라서, 우리는 총 100...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y. 박 교수, 당 조, 텍와 S. 리 Tomocube, Inc., 광학 회절 단층 촬영 및 양적 위상 이미징 기기를 상품화 하는 작품의 스폰서 중 하나입니다 회사에에서 금융 관심 있다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 KAIST BK21 + 프로그램, Tomocube, Inc., 및 연구 재단의 국립 (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396)에 의해 지원 되었다. Y. 조 KAIST 대통령 친목 및 아산 재단 생물 의학 과학 장학금 지원을 인정합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
마우스Daehan BiolinkC57BL/6J 마우스 성별 및 연령 일치, 6 – 8주
Falcon 원뿔형 원심분리기 튜브ThermoFisher Scientific14-959-53A15 mL
인산염 완충 식염수 Sigma-Aldrich806544-500ML
암모늄-염화물-칼륨 용해 완충액 ThermoFisher ScientificA1049201
RPMI-1640 배지Sigma-AldrichR8758
소 태아 혈청ThermoFisher Scientific10438018
항체BD Biosciences553140 (RRID:AB_394655)CD16/32 (클론 2.4G2)
항체BD Biosciences555275 (RRID:AB_395699)CD3&엡실론; (클론 17A2)
항체Biolegnd100734 (RRID:AB_2075238)CD8α (클론 53-6.7)
항체BD Biosciences557655 (RRID:AB_396770)CD19 (clone 1D3)
항체BD Biosciences557683 (RRID:AB_396793)CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
항체BD Biosciences552878 (RRID:AB_394507)NK1.1 (clone PK136)
항체eBioscience11-0041-85 (RRID:AB_464893)CD4 (clone GK1.5)
DAPI Roche102362760014,6-diamidino-2-phenylindole
유세포 분석 BD BiosciencesAria II 또는 III 
이미징 챔버Tomocube, Inc.TomoDish
홀로토모그래피Tomocube, Inc.HT-1H
홀로토모그래피 이미징 소프트웨어Tomocube, Inc.TomoStudio
이미지 전문 소프트웨어MathWorksMatlab R2017b

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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