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방법 논문

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

8.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58307

⸱

2018년 10월 3일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wesleyan University

이 논문에서

요약

여기 우리는 혐 기성 단백질 정화, 혐 기성 단백질 농도, 그리고 산소 전극 시스템을 사용 하 여 후속 운동 특성에 대 한 프로토콜을 제시. DesB, 더 안정적이 고 적극적인 정화 하 고 혐 기성 환경에서 저장 한 dioxygenase 효소 효소를 사용 하 여 메서드를 보여 줍니다.

초록

산소에 민감한 단백질, 그 효소를 활용 한 기질으로 산소를 포함 하 여 전통적인 호 기성 정화 방법을 사용 하 여 정화 하는 때 안정성을 줄일 수 있습니다. 이 원고에서는 장갑 상자에 담 론 전에 단백질의 버퍼 및 시 약, 열 착 색 인쇄기에 대 한 방법의 준비를 포함 하 여 혐 기성 정화 과정에 관련 된 기술적인 세부 사항을 보여 줍니다. 또한 준비 하 고 산소를 이용 하는 효소의 활동적인 특성화를 수행 하는 산소 전극 사용 방법이 있습니다. 이 메서드는 DesB, Sphingobium sp. 스트레인 SYK-6 박테리아에서 gallate dioxygenase dioxygenase 효소를 사용 하 여 그림.

서론

철 또는 산소를 활성화 하기 위하여 다른 금속을 사용 하는 효소 들은 정화 과정 동안 비활성화에 취약 그들의 제거 때문에 셀의 줄이는 환경에서. 따라서이 단백질, 세포 lysates로 사용 해야 외부 감소 시키는 대리인를 복종 될 또는 있도록 그들은 최적 효소 활동1,2,,34anaerobically 정화. 그 효소는 산소에 민감한 (특히 철 분 포함 된 효소), 혐 기성 상태를 유지 하면서 모든 정화 및 특성화 단계를 수행 완전히 그들을 특성화 하는 데 필요한입니다. 이 주도하 고 있다 결정학5,6,7,8 단백질 표정에서 배열 하는 연구에 대 한 혐 기성 챔버의 범위 내에서 전체 실험실 체제를 개발 하는 연구원 .

여기, 우리는 혐 기성 정화 및 효소는 산소 전극 시스템을 사용 하 여 DesB의 운동 특성에 대 한 방법을 보고 합니다. DesB은 Sphingobium sp. 스트레인 SYK-6 LigAB, 동일한 유기 체에서 protocatecuate dioxygenase 관련 된 박테리아에서 gallate dioxygenase입니다. 두 효소 유형 II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily 날짜9, 에어로빅 표준을 사용 하 여 정화 하는 때 비활성화에 취약 되 고이 superfamily의 효소 때문에 가능성이 광범위 하 게 공부 하지는에 속한다 단백질 정화 방법입니다. PCAD 효소의 일부 표시 기판 성행위 동안 다른 기판 전용2,10, 추가이 superfamily의 특이성 결정을 식별 하는 데 필요한입니다. 으로 여러 효소 superfamilies11,12,13,,1415에 관찰 되었습니다, 작은 분자 직접 경쟁 저해를 통해 활동 또는의 바인딩을 변경할 수 있습니다. 분자 효소 활동16감소 또는 증가 일으키는 allosteric 주머니를 분리. 속도 론 혼자는 변조기의 바인딩 위치를 차별화 수 없습니다, 하는 동안 활동 변화의 크기를 결정 하는 것이 효과 이해 중요 합니다. 기본 DesB 활동과 4-nitrocatechol (4NC), 일반적으로 특성 및 dioxygenase 효소2,17, 를 억제 하는 데 사용 하는 화합물의 존재 그것의 활동의 운동 특성, 방법 18, 표시 됩니다.

DesB는 gallate, 리그 닌 파생 향기로운 화합물, 어떤 반지 여 기판10,19의 하나로 산소를 사용 하 여 촉매는 extradiol dioxygenase (에) 반응을 통해 무 너 뜨 리 수 있다. 이 효소 반응은 식물의 세포 벽에서 발견 한 향기로운 heteropolymer 리그 닌의 붕괴의 컨텍스트 내에서 발생 합니다. 리그 닌을 depolymerized 수 있습니다, 그리고 다양 한 방향족 화합물을 저조한 세분화 될 수 있습니다 추가 중앙 대사3,20,,2122,23,24에 ,25,26,,2728,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (에) 촉매 dihydroxylated 방향족 화합물, 금속 조정 diol;에 인접 한 분열이 발생에 반응 열 반지 대조적으로, intradiol dioxygenases 쪼개 두 개의 수 산 기 그룹 (그림 1) 간의 유사한 향기로운 화합물. 다른 많은 metalloenzymes 같은 EDOs 2 히스티딘, 1-카복실산 깡패9,,3435의 구성 조정 Fe(II) divalent 금속 센터가 있다. 이 metalloenzymes 될 산화, autoxidation 또는 비활성화 메커니즘에 기초를 둔 반면 효소 비활성2,36,,3738렌더링 됩니다.

이 원고에서 설명 하는 실험 절차에 우리 DesB, 박테리아 Sphingobium sp. SYK-6, gallate (그림 2A)의 c 4-c 5 본드에 걸쳐 산소의 추가 촉매 하에서 PCAD superfamily의 구성원을 사용 합니다. 이 분열의 regiochemistry는 유사한 LigAB, protocatechuate-4, 5-dioxygenase (그림 2B). 지금까지,이 gallate dioxygenase의 조사 DesB10,,1939을 억제 하는 화합물의 보고를 포함 한다. 호 기성 정화 방법의 사용으로 DesB 전시 변수 활동, 혐 기성 방법의 사용으로 일관 되 게 재현할 수 활동 단백질을 얻을 수 있었습니다. 여기에 설명 된 운동 연구 DesB, gallate와 DesB의 반응과 4-nitrocatechol (4NC)에 의해 DesB의 억제의 운동 특성의 혐 기성 정화에 대 한 방법을 보여줍니다.

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프로토콜

1. 일반 재료 및 방법

  1. 표 1에 설명 된 대로 모든 필요한 미디어를 준비 합니다. 압력솥에서 15 분 멸 균에 대 한 120 ˚C 0.2 µ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여 MgCl2 , 포도 당의 추가 후 SOC 솔루션을 필터링 합니다. 압력가 마로 소독 전에 밀러의 Lysogeny 국물 (파운드 미디어) 솔루션의 pH를 조정 합니다. 0.2 m m L-시스테인, 다음 0.1 m m 철 암모늄 황산 단백질 표정 및 가용성을 향상 시키기의 살 균 솔루션 압력가 마로 소독 후 파운드 앰프 미디어 솔루션을 보완 합니다.
  2. 표 2에 설명 된 대로 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 대 한 Laemmli 버퍼 및 실행 버퍼를 준비 합니다. 그들의 마지막 볼륨에 구성 요소를 희석 하기 전에 (버퍼 준비를 위한 1 M HCl와 트리 스 기준을 사용 하 여) 솔루션의 pH를 조정 합니다.
  3. 표 3에 설명 된 대로 단백질 정화에 대 한 버퍼를 준비 합니다. 그들의 마지막 볼륨에 구성 요소를 희석 하기 전에 (버퍼 준비를 위한 1 M HCl와 트리 스 기준을 사용 하 여) 솔루션의 pH를 조정 합니다.
  4. 유리 튜브를 포함 하 고 한 홀 고무 마 개와 함께 밀봉 될 수 있다 병을 준비 버퍼를 전송 합니다.
    1. 유리 튜브 마 개에 진공 원본에 연결 하는 호스를 사용 합니다. 중간 속도에서 교 반 하면서 약 30 분에 대 한 부정적인 압력을 받고 드 솔루션을 수 있습니다.
    2. 도장 먼저, 다음 해제 진공 진공 브레이크. 다음, (병, 그리고 가스 탈출 환기로 사용 될 수 있는 한 짧은 바늘의 하단에 도달 충분히 하나) 두 20 G 바늘 고무 마 개를 통해 피어스. 30 분 동안 중간 속도로 교 반 하면서 질소의 지속적인 흐름에 거품.
    3. 바늘을 제거 하 고 세 사이클의 총에 대 한 생성 및 질소에서 버블링을 반복 합니다. 완료 되 면, 제대로 단단한 고무 마 개와 함께 병 인감. 또한 파라핀 영화와 구리 와이어 (20 G), 스 토퍼를 장악 하 고는 글러브에 넣어.
      참고: 모든 재료는 글러브에 배치 되며 산소 밖으로 진공 청소기로 청소 및 질소로 충 진 antechamber 정화의 3 주기를 받게. 정화 및 농도 사용 되는 버퍼 출장 고 글러브 박스에 무기한으로 저장 될 수 있습니다.
  5. 약 한 주걱 (0.31 "x 2", 양방향 마이크로 테이퍼 스테인레스 주걱의 작은 끝) 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 degassed 물 약 1 mL에 나트륨 dithionate의 완전 용 해 하 여 나트륨 dithionate 솔루션을 준비 . 글러브 박스에서 제거 하기 전에 파라핀 영화 튜브 인감.
    참고: 산화를 방지 하기 위해 장갑 상자에 고체 나트륨 dithionate를 저장 합니다.

2. 단백질 정화 Amylose 열의 준비

  1. Amylose 열 버퍼의 높은 흐름 amylose 수 지 (15 mL) 5 열 볼륨 (75 mL)와 함께에서 슬러리를 확인 합니다. 2 50 mL 혈 청 병으로 수 지 슬러리를 전송 하 고 각 병 고무 격 막 인감. 현 탁 액에서 산소를 제거 하려면 약 1 분간 슬러리에 20 G, 격 막, 및 거품 질소 통해 305 m m 바늘 찔린 합니다. 글러브 박스에 수 지와 단백질을 포함 하는 솔루션을 전송.
  2. 글러브 박스에 정착 하 고 레벨 침대를 만들 수 있도록 하는 간단한 자 지 장착 2 x 30 cm 붕 열으로 수 지를 붓는 다. 배수 열 버퍼와 3 열 양의 (~ 30 mL 총) degassed amylose 열 버퍼 용 매 보다 큰 될 때까지 약 1 드롭/s 또는 5 mL/min, 수 지를 통해 버퍼를 압축된 질소 가스를 사용 하는 열 equilibrate는 수 지 침대입니다.
    참고: 단백질 후는 eluted (단계 아래 3.5 참조) amylose 열 수 지 물, 1 열 볼륨 (10 mL) 1 열 양의 1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 그리고 마지막으로, 3 열 양의 (30 mL) 물으로 세척 하 여 다시 생성 됩니다. 이 단계는 장갑 상자 완료할 수 있습니다. 열 수 지는 20% 에탄올에 4 ° C에 저장 되며 최대 5 배를 다시 생성할 수 있습니다.

3. 단백질 표정 및 DesB의 혐 기성 정화

참고: DesB 유전자는 상업적으로 합성, 애완 동물-15b, 애완 동물-32a, 및 NdeI 및 BamHI 제한 사이트 복제를 사용 하 여 pMAL c5x 벡터에 배치 하는 데.

  1. 단백질 표정 분석 대규모 식 (아래에 간단히 설명)에 대 한 정확한 조건을 확인 하려면 제조업체의 지침에 따라 완료 합니다.
    1. 상업적으로 제작한, 화학적으로 유능한 대장균 으로 DesB를 포함 하는 플라스 미드를 변환 BL21 (DE3) 셀, 제조업체의 지침에 따라. 간단히, 해 동이 분 동안 얼음에 셀 추가, 플라스 미드 DNA의 약 10-50 ng 셀 혼합물, 열 충격에 셀 10 42 ° C에서 s, 고 추가 5 분 추가 SOC 및 미디어를 1 mL의 최종 볼륨을 얻을 수 있도록에 대 한 얼음에 그들을 품 어는 (~ 200 rpm) 60 분 동안 37 ° C에서 흔들어 셀. 파운드 앰프 접시에 추가 및 셀 솔루션의 100 µ L를 확산 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
    2. 하룻밤 배양 후 플레이트에서 단일 콜로 니 형성 단위를 선택 하 고이 식민지를 사용 하 여 파운드 앰프 미디어의 10 mL를 접종. (~ 200 rpm) 37 ° c.에 떨고 밤새, 세포 성장
    3. 미디어의 10 mL를 100 µ L 하룻밤 성장 솔루션의 추가 하 고 37 ° c.에 단계 3.1.2에에서 설명 된 대로 새로운 미디어를 흔들 때 광학 밀도 600 nm (OD600) 0.4-0.8, 사이 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 m m의 최종 해결책 농도를 추가.
    4. 즉시 솔루션의 약 1 mL 수를 제거 하 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브 레이블이 지정 된 시간에 전송 = 0 시간. 작은 셀 10 분 15000 x g에서 튜브를 회전 합니다. 회전 후에 상쾌한을 제거 하 고 4 ° c.에서 셀 저장
    5. (일반적으로 5, 10, 12, 18, 24 h)에서 IPTG의 추가 후에 시간 간격 추가 aliquots (각 1 mL)을 제거 합니다. 3.1.4 단계에 설명 된 대로 각 튜브 원심, 상쾌한, 가만히 따르다와 4 ° c.에서 셀 저장
    6. aliquots, 가져온 모든 resuspend에서 셀 각 timepoint 30 µ L 세균성 단백질 추출 솔루션,에 10-15 분 동안 실내 온도에 그들을 품 어 고 가용성과 불용 성 분리 5 분 15000 × g에서 튜브 원심 단백질입니다.
    7. 새로운 microcentrifuge 튜브에 녹는 단백질 해결책을 전송 하 고 30 µ L 세균성 단백질 추출 솔루션의와 나머지 불용 성 펠 릿 resuspend.
    8. 각 솔루션 (각 timepoint에 대 한 가용성과 불용 성 솔루션)의 30 µ L Laemmli 버퍼의 동등한 양으로 결합 다음 SDS 페이지 젤40에 시각화. 대규모 단백질 표정과 정화에 대 한 수용 성 보다 정확한 크기 밴드를 포함 하는 차선에 해당 하는 조건을 선택 합니다.
      참고: 때문에 최소한의 수용 성 단백질은 처음 위의 조건을 사용 하 여 생성 된, 다양 한 보충제에 추가 된 0.2 m L-시스테인 m와 0.1 m m 철 암모늄 황산 보여주는 향상 된 단백질 용 해 단백질 표정에 효과 대 한 테스트 식입니다. 이 단백질 식 화면에 따르면 DesB의 용 해 생산을 위한 적절 한 표정 벡터 pMAL c5x 벡터를 했다.
  2. 대장균 BL21로 변환에 따라 (DE3), 80% 글리세롤의 100 µ L 900 µ L 세균성 문화 (성장된 하룻밤 200 rpm 고 37 ° C에서 흔들어와) 결합 하 여 DesB/pMal-c5x의 재고를 확인. 극저온 튜브에서-80 ° C에서 재고를 저장 합니다.
    참고: 새로운 냉동 주식 약 6-8 개월 마다 확인 합니다.
  3. 피 펫 팁을 사용 하 여 냉동된 주식에서 셀 긁 고 떨고와 37 ° C에서 파운드 앰프 미디어의 5 mL에서 하룻밤 성장 세균성 문화 시작. 37 ° C와 하룻밤 성장된 세균성 문화를 사용 하 여 200 rpm에서 2 L 플라스 크에 파운드-앰프 미디어의 1.5 리터 접종
    참고: 산소에 단백질의 관찰 된 감도 때문으로 밝혀졌다 그 감소 headspace 플라스 크에 대규모 식에 대 한 속도 향상 된 단백질 수율을 떨고 온건.
  4. 유도 단백질 표정 때 600에서 광학 밀도 (OD600) 1 m IPTG 0.4-0.8 사이 및 0.2 m m L-시스테인과 0.1 m m 철 황산 암모늄으로 보충. 부 화 온도 30 ° c와 200 rpm에서 흔들어. 4700 x g 10 분에서 24 h 후 유도 후 원심 분리를 통해 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 보낸된 미디어를 삭제.
  5. Amylose 열 버퍼의 성장, lysozyme의 1 밀리 그램의 추가 의해 다음 모든 1.5 L 당 20 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 얼음에 20 분 동안 저 어.
    참고: 더 많은 버퍼 추가할 수 있습니다 솔루션 너무 점성 이면 단백질으로 솔루션 너무 점성을 균질 화 하는 다음 단계를 중단 될 수 있습니다.
  6. 약 15000 psi에 3-5 패스와 고압 균질 통해 resuspended 셀 솔루션 lyse 50 mL 원심 분리기 튜브에 단백질을 전송 하 고 headspace 1 분에 대 한 질소로 플러시. 그런 다음 세포 lysate 불용 성 파편을 제거 40 분 20000 x g에서 원심.
    참고: 컬렉션 플라스 크, 그리고 튜브를 통해 흐르는 하 고 솔루션 반투명 회색 갈색 색상으로 나타납니다 양식 micelles 단백질을 하면 성공적인 조직. 과정 전반에 걸쳐 얼음에 무 균된 단백질을 유지.
  7. 원심, 후 (이상 하나 필요할 수 있습니다), 50 mL 튜브에는 상쾌한 전송 튜브 고무 격 막 그리고 20 게이지 바늘, 산소를 치환 하 2 분에 대 한 솔루션을 통해 천천히 거품 질소 가스 모자. 파라핀 영화 심장 랩 더 구리 철사, 그것을 확보 하 고 열 자료와 함께 글러브 박스에는 상쾌한을가지고.
  8. Equilibrate 열 (단계 2.3 참조) 고 열에 표면에 뜨는 단백질을 로드. 적당히 가압된 질소 (1 드롭/초 또는 약 5 mL/min)에서 5 mL 분수에서 흐름 통해 수집 합니다. 다음, 다른 3 열 양의 amylose 열 버퍼를 사용 하 여 열 세척 하 고 적당히 가압된 질소 (약 5 mL/min)에서 유리 시험관에 3ml 분수를 수동으로 수집. 5 열 양의 (50 mL) 차입 버퍼를 사용 하 여 단백질을 elute 고 적당 한 질소 압력 (약 5 mL/min) 3 mL 분수를 수동으로 수집 합니다.
    참고: 분수 또는 수집할 수 있습니다 중력 여과 사용 하 여. 약 12 차입 분수를 수집 해야 합니다.
  9. 분수의 30 µ L aliquots를 수집 하 고 포함 하는 단백질의 시각화 수 있도록 장갑 상자에서 그들을 제거 SDS 페이지 분석을 통해 분수.
    참고: 수집 된 분수는이 테스트의 기간에 대 한 장갑 상자에 남아 있습니다. 순화 DesB 일반적으로 분수 3-5 열에서 elutes.

4. 혐 기성 단백질 농도/버퍼 교환

  1. 76 mm 재구성된 셀 루 로스 멤브레인 필터 (10 kDa 컷오프) 가압, 흔들 셀 집중 장치를 조립. 글러브 박스에 조립된 집중 전송으로 젖은 막 계속 집중 장치에 충분 한 양의 20% 에탄올을 추가 합니다.
    주: 막에 눈물이 고 o-링 주름이 되지 확인 하십시오.
  2. 데리고 후 장갑 상자에 흔들된 셀 집중 세척 물으로 막에서 에탄올 솔루션. 모자 하 고 기 압 튜브와의 어떤 과잉의 물 막 청소를 냈다 셀.
  3. 집중 장치에 SDS 페이지 (그림 3)에 의해 결정 되는 단백질을 포함 하는 모든 분수를 추가 합니다. 충분 한 exchange 버퍼 총 단백질 솔루션 볼륨의 150 mL를 추가 합니다.
  4. 외부 N2 라인을 사용 하 여 흔들된 셀 챔버 압력 그리고 보통 교 반 속도와 50 mL에 단백질을 집중.
    참고: 약 20 분 걸립니다 50 mL의 농도 달성.
  5. 100 mL의 0.1 m m dithiothreitol (DTT)와 0.1 m m 철 암모늄 황산 exchange 버퍼를 보충 하 고 흔들된 셀에 솔루션을 추가 교 반 속도 보통으로 50 mL의 총 볼륨에 단백질을 집중.
  6. 솔루션 50 mL의 볼륨에 도달, 후 보충된 교환 버퍼에 한 번 더 추가 하지만 보통 교 반 속도와 10 ml 전체 볼륨에 대 한 해결책을 집중.
  7. 필터링을 사용 하 여 0.45 μ m 기 공 크기 주사기 필터와 약 수 개별 0.2 mL 중 합 효소 연쇄 반응 (pcr) 튜브 (각 단백질 해결책의 약 150 µ L) 집중된 단백질. 글러브 박스에서 받은 aliquots를 제거 하 고 즉시 플래시 액체 질소 그들을 동결. -80 ° c.에 aliquots 저장

5. 염 DesB

  1. 사용 하기 전에 약 1.5 시간 동안 질소 가스와 장갑 가방을 플러시.
  2. 얼음에 장갑 가방 내부 정화 DesB 단백질의 150 µ L 약 수 동
  3. 단백질 녹아서, 하는 동안 작은 중력, 담 9 mL 붕 열에서 Sephadex G-25 거친 염 젤의 3 mL를 포함 하는 열을 준비 합니다. 열 2 열 볼륨 (~ 6 mL)을 씻어 degassed desalt 버퍼.
    참고: 대체 염 젤 (약 7 사용) 후 노란색 흰색에서 젤 색깔에 변화가 있을 때.
  4. 해 동된 DesB 중력 제어 과정을 통해 열에 로드 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다. 버퍼를 담의 약 5 mL와 단백질 elute
    참고: 지속적으로 장갑 부 대를 작성 하는 가스 탱크에서 압력을 솔루션 열에서 물방울 속도 영향을 줍니다.
  5. 열에서 단백질 차입의 초기 결정에 대 한 12 병/elutions (병 당 3 방울 포함)를 수집 합니다. 고무 격 막으로 밀봉, 그들을 제거 장갑 가방 및 단백질의 존재에 대 한 테스트에서 SDS 페이지 젤 분석) (통해 직접 또는 간접적으로 (심사를 통해 각 분수의 활동의).
    참고: 일반적으로, 분수는 개별적으로 대 한 테스트 활동, 활성 단백질의 가장 큰 농도와 분수를 해당 하는 가장 큰 활동으로 7.1, 단계에서 설명한 대로. DesB는 보통 7 드롭, desalted 단백질의 다음 9 방울 수집 후에 시작을 elutes. 단백질 aliquots 속도 측정 (단계 7.1-7.4) 동안 얼음에 저장 됩니다.

6. 산소 전극 준비

  1. 검정 산화물 예금의 표시 흔적까지 실버 양극 반지와 플래티넘 음극 전극 청소기와 젖은 면봉을 폴란드어.
  2. 가 위, 약 1 개의 1.5 인치 광장 스페이서 종이 (또는 동등 하 게 잘 작동 하는 담배 롤링 종이)의 잘라. 다음, 전극의 배치를 원조 하기 위하여 모서리에 광장과 2) 슬릿으로의 각 면에 1) 작은 삼각형을 잘라.
  3. 양극에 50 %KCl 용액 5 방울 그루브와 솔루션의 한 지속적인 반지를 형성 하는 그들은 그래서 그들을 연결을 추가 합니다. 백 금 전극의 상단에 50 %KCl 용액 2 방울을 추가 합니다. 신중 하 게 백 금 전극 위에 스페이서 종이 놓고 아무 공기 방울 되므로 스페이서 종이 밖으로 부드럽게 합니다.
    참고: 주의 사용 하 여 공백 종이 찢 어 하지 않도록.
  4. 약 2 인치 긴 S4 30 m PTFE (소계) 막의 조각을 잘라 하 고 스페이서 종이 위에 두십시오. 막의 가장자리를 잘라 그래서 그들은 전극의 외부 반지와 함께 정렬 됩니다.
  5. 종이 막 전극에는 스페이서를 확보 하 여 전극에 작은 o-링을 밀어 링 주걱을 사용 하 여. 아래 아무 막 확보는 전극의 원형 홈에 큰 링을 놓습니다. 기지에 전극의 상단 챔버를 슬라이드와 나사 2 개를 함께.
    참고: 두는 망했다에 제대로 경우 챔버의 양쪽에 없는 공기 거품 지팡이.
  6. 그것의 기초에 조립된 전극을 놓고 전극 모니터링 시스템에 연결 합니다. 전극 제어 프로그램을 시작 하 고 액체 단계 교정 프로토콜 (그림 4A)를 수행 하 여 전극 보정. 온도 변수는 실험 수행은, 방의 온도 및 주위 압력 변수 지역 현재 날씨 상태에 따라 달라 집니다.
    참고: 주위 압력 지역의 날씨 보고서를 얻을 수 있습니다.
  7. 추가 25mm Tris 버퍼의 1 mL 전극 실로, 플런저를 삽입, 산소 포화 솔루션의 보정을 시작 하 고 100 교 반기 속도 조정. 후 전극 안정화, 산소 포화 솔루션 결정에 대 한 보정 설정 포인트 (그림 4B).
  8. 플런저를 제거 하지 않고 어떤 기포 (그림 4C) 추가 되지 않도록 주의 하면서 챔버로 나트륨 dithionite 솔루션의 약 1 mL를 주입 하는 1.2 x 40 m m 바늘과 1 mL 주사기를 사용 합니다. 고무 마 개를 사용 하 여 나트륨 dithionite 추가 후 바로 전극 챔버를 밀봉 하기 위하여.
  9. 모든 산소 활용 및 프로그램 완료 될 때까지 계속 하 여 저장 (그림 4D) 교정 교정 하실 수 있습니다. 상공에서 솔루션을 발음 하 고 플런저와 챔버 이온된 물으로 5-6 번 씻어 나트륨 dithionite의 완전 한 제거를 보장 하기 위해. Rinsing, 장착 피 펫 팁 쪽 팔 진공 플라스 크에 연결 된 플라스틱 관을 사용 합니다. 멤브레인을 손상 하지 마십시오.

7. 운동 분석 산소 전극을 사용 하 여

  1. 직렬 25mm Tris 버퍼, ph 7.5의 솔루션에 1 µ L의 효소 활동에 대 한 솔루션을 테스트 하 고 100 µ M gallate를 포함 하 여 활성 단백질을 포함 하는 desalted aliquots를 식별 합니다. 최고의 관찰 활동은 aliquot(s)를 사용 하 여 나머지 실험에 대 한. (단계 5.5.1 참조)
  2. O2 소비는 O2를 사용 하 여 측정 하 여 효소 반응의 속도 결정-전극 제어 장치를 통해 컴퓨터 통합 민감한 클라크-유형 전극.
    1. 각 활동 데이터에 대 한 DesB의 측정 포인트, 전극 챔버에 25mm Tris 버퍼 (pH 7.5)의 1 mL을 추가. 원하는 최종 기질 농도 (0.05-25 m m)을 달성 하기 위해 Tris 버퍼에 계산 된 양의 gallate의 25 m m 재고 솔루션을 추가 합니다.
      참고: 매일 gallate와 억제 물으로의 신선한 재고 솔루션을 준비 하 고 필요한 경우 0.1 m NaOH, m의 추가 함께 7.5 pH를 조정.
    2. 10 후 s 솔루션의 혼합 수 있도록 저 어 천천히 플런저와 챔버를 밀봉 하 고 아래로 상단 나사. 깨끗 한 조직 상공에서 난민은 과잉 액체를 흡수 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 효소 (± 0.5 µ M/min의 배경 O2 소비 속도)의 추가에 진행 하기 전에 적어도 1 분 동안 솔루션에 산소 농도의 안정적인 측정을 생산할 수 있는 equilibrate를 전극을 수 있습니다.
    3. 가스 꽉 10 µ L 주사기를 사용 하 여 플런저를 통해 전극 챔버를 효소 (약 3-7 µ M 효소)의 약 1 µ L를 추가 합니다.
      참고: 효소의 양이 증가 하거나 충분 한 수를 반응 속도 대 한 허용 하도록 특정 약 수의 관찰된 활동에 대 한 응답에서 감소 될 수 있습니다.
    4. 첫번째 30의 기울기에 따라 반응 속도 계산 선형 데이터 효소 추가 후 및 적합의 s O2 소비는 30을 사용 하 여 배경 데이터 효소 추가 직전의 s. 촉매의 비율은 O2 소비 (그림 5A)의 속도.
    5. 플라스틱 튜브를 사용 하 여 빈 포부를 통해 전극 챔버에 주어진된 기질 농도 대 한 속도 데이터의 수집, 후 측 팔 진공 플라스 크에 연결 하 고 4-6 사이클에 대 한 물으로 반복 해 서 헹 구는. 7.2.1 새로운 기질 농도 사용 하 여 단계에서 설명한 대로 전극에 솔루션을 설정 합니다.
    6. 정렬 되지 않은 방식으로 기질 농도 시간 (그림 5B)와 효소 활동에 있는 감소에 대 한 계정에 실험의 과정을 통해 복제.
      참고: 지금까지 특정 농도의 복제 실행 되는 이전 실행에 비해 속도 30% 감소 보다 더 보여줄 때에 아무 추가 분석 실험 효소의 그 배치와 함께 수행 되어야 한다. 일반적으로 30-40 실행 후 효소 활동에 30% 감소를 보여줍니다.
    7. 운동 매개 변수 k고양이 (제품 기판의 변환에 대 한 촉매 상수)와 Km (Michaelis 상수, 운영 체제는 초기 속도가 기질 농도 정의 결정 최대 속도의 절반) GraphPad Prism을 사용 하 여 Michaelis−Menten 방정식 (그림 6)를 기질 농도의 각각에서 데이터의 최소 제곱 기준으로.
  3. 4-nitrocatechol (4NC) dioxygenation 속도에 미치는 영향을 테스트 하 고 결정 저해 상수 (K나) DesB를 추가 합니다. 각 반응 조건에 대 한 재고 트리 (50mm), gallate (25 m m), 및 4NC 솔루션 (25 mM) 결합 하 고 1mm gallate와 25mm Tris 버퍼 (pH 7.5)의 2 mL 해결책을 물으로 희석 4NC의 농도 변화. 4NC 볼륨 원하는 최종 억제제 농도 (0.05-20 m m)을 달성 하기 위해 변화 했다.
    1. 10 초 후 감동 솔루션의 혼합 수 있도록, 플런저 챔버에 천천히 놓고 내려 상단 나사. 깨끗 한 조직 상공에서 난민은 과잉 액체를 흡수 하기 위해 사용할 수 있습니다. Equilibrate 및 생성 효소 (± 0.5 µ M/min의 배경 O2 소비 속도)의 추가에 진행 하기 전에 적어도 1 분 동안 솔루션에 산소 농도의 안정적인 측정 전극을 수 있습니다.
    2. 앞에서 설명한 대로 단백질 (7.2.3 단계)를 추가 하 고 반응 속도 (7.2.4 단계)를 확인 한 다음 조건에 대 한 전극 재설정.
    3. 이 일련의 실험의 일부로, 억제제의 부재에서 반응 속도 여러 번 확인 합니다. 1mm 기판으로 다양 한 억제제 농도의 산소 소비 속도 및 억제제 (v/vo)의 부재의 규격화에 의해 억제를 결정 합니다.
    4. 적합 방정식 7.3A gallate dioxygenation 그리고 방정식 그래프 프로그램 (그림 7)를 사용 하 여 7.3B 저해 데이터의 억제.
  4. 모든 운동 실행의 완료 후에 Bradford 분석 실험을 수행 하 여 각 실험에 대 한 정확한 효소 농도 결정 합니다.
    참고: 모든 속도 효소 농도 대 한 수정 했다. 이 단계 장갑 상자 또는 글러브 가방에 할 필요가 없습니다.

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결과

표시 된 개별 분수 정화 DesB-맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 퓨전 구문 (그림 3)에서 SDS 페이지 젤 분석이 이다. 젤 밝혀 단백질 순수 (MW = 91.22 kDa), DesB의 존재를 제외한 (MW = 49.22 kDa) MBP 단백질 도메인 (42 kDa) 서로 죽 습. 분수 E2 및 e 3은 농도 (4.2 단계)에 대 한 선정 됐다.

DesB 운동 분석 실험에서 재현성 결과 올바른 어셈블리, 교정, 및 실험 기법에 따라 달라 집니다. 그것은 정확한 온도 압력, 입력 하는 데 필요한 이러한 변수 분석 결과 (그림 4A) 동안 솔루션에 녹아 있을 것으로 예상 하는 O2 의 비율을 결정. 초기 신호 1800 및 2000 nm...

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토론

활성, 순화 DesB 단백질을 얻기에 있는 중요 한 단계는 형성 및 효소의 감소 Fe(II) 활성 사이트의 유지 관리를 포함 한다. 따라서, 유도, 정화, 농도, 성능 수정 하 고 염 단계는 활성 효소를 성공적으로 취득에 필수적인. Fe(II)을 DesB의 활성 사이트를 올바르게 통합 보장 1 mM 철 암모늄 황산의 단백질 발현을 유도 합니다. 이 메서드는 종종 적절 한 접는 수 있도록 성장 매체에 금속 추가 및 바인딩 사이트6,41,42 금속의 전체 인을 요구 하는 amidohydrolase metalloenzymes와 같은 연구에 의해 영감을 ,43.

혐 기성 정화와 글러브 박스에서 농도 아마도이 프로토콜의 가장 중요 하 고 기술적으로 어려운 단계...

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공개 사항

저자는 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 있다.

감사의 글

우리는 기술 지원에 대 한 웨슬리언 대학교의 박사 카밀 켈러를 감사 하 고 싶습니다. 혐 기성 단백질 정화 방법 및 O2의 사용에 관한 그들의 조언에 대 한 특별 감사 교수 린지 디 Eltis 제 나 K. Capyk 브리티시 컬럼비아의 대학에서 뿐만 아니라 오스틴에 있는 텍사스 대학에서에서 기독교 휘트먼 -민감한 전극.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노디즈골드 바이오 테크놀로지I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad161-0400
과황산암모늄Bio-Rad161-0700
30% 아크릴아미드Bio-Rad161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamineBio-Rad161-0801
아밀로스 수지 고유량New England BiolabsE8022S
BL21 (DE3) 유능한 대장균 세포New England BiolabsC2527I
L-시스테인시그마 알드리치C7352
갈산, 시그마 알드리치G7384
4-니트로카테콜시그마 알드리치N15553
철 황산 암모늄Mallinckrodt5064
나트륨 디티 오 나이트Alfa Aesar33381-22
wheaton 혈청 병Fisher Scientific06-406G
25mm Acrodisc PF 주사기 필터 (Supor MembranePall Corportation4187
400 mL Amicon 교반 세포 농축기EMD MilliporeUFSC40001
76mm Millipore Ultracel 10kDa 컷오프 재조정 셀룰로오스 멤브레인 필터EMD MilliporePLGC07610
DL-dithiothreitolGold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25 Coarse desalting gal columnGE Healthcare17-0033-01
2mL 크림프 탑 바이알Fisher Scientific03-391-38
Oxygraph Plus 전극 제어 장치Hansatech InstrumentsOXYG1 Plus
산소 일렉트로드 챔버Hansatech InstrumentsDW1
전극 디스크Hansatech InstrumentsS1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m 릴Hansatech InstrumentsS4
전극 청소 키트Hansatech InstrumentsS16
스페이서 종이지그재그모든 주유소
He-series Dri-Lab 글러브 박스진공/대기 회사
HE-493 Dri-Train진공/대기 회사
양면 마이크로 테이퍼 스테인리스 스틸 주걱Fisher Scientific21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy ColumnFisher Scientifick420400-1530
10 &뮤; L, 모델 701 N SYR, 시멘트 NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 주사기Hamilton80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy ColumnFisher ScientificK420401-1505
Emulsiflex-C5 고압 균질화Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction 시약Thermo Fisher Scientific89821
닭 달걀 흰자위의 리소자임시그마 알드리치12650-88-3
도데실황산나트륨Thermo Fisher Scientific151-21-3
암피실린시그마 알드리치7177-48-2
트립톤Fisher ScientificBP-1421-500
효모 추출물Fisher ScientificBP1422-2
염화나트륨피셔 사이언티픽S271-10
염화칼피셔 사이언티픽 P217-3
염화마그네슘피셔 사이언티픽M33-500
포도당피셔 사이언티픽D16-3
수산화나트륨피셔 사이언티픽S318-1
트리스 하이드로 클로라이드피셔 사이언티픽BP153-500
말토스피셔 사이언티픽BP684-500
글리신피셔 사이언티픽G46-500
에서 사용 가능륨

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