여기, 두 세포 외 기 격리 프로토콜, 한 원심 분리 및 밀도 그라데이션 원심 분리, extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 액체 샘플에서 분리 된 ultracentrifugation 설명 합니다. 두 방법으로 murine bronchoalveolar 게 액체에서 파생 된 세포 외 소포는 계량 하 고 특징.
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방법 논문
Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리
이 논문에서
요약
초록
Extracellular 소포 (EVs)는 많은 생물학 기능 생리 및 병리학 상태 동안 신호에 중요 한 역할을 하는 새로 발견된 된 subcellular 요소입니다. EVs의 각 기법에 기본 제한으로 인해이 분야에서 주요 도전 되 고 있습니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 방법으로 차동 ultracentrifugation 일반적으로 사용 되는 방식 이며, EV 격리에 대 한 표준 절차로 간주 됩니다. 그러나,이 절차 시간이, 노동 집약, 그리고 일반적으로 bronchoalveolar 게 액체 같은 작은 볼륨 샘플에 적합 하지 않을 수 있습니다 낮은 확장성에서 결과. 한 원심 분리 방법 간단 하 고 시간 및 노동 효율 아직 제공 높은 복구 수율 및 순도 설명 합니다. 우리는이 격리 방법 EV 격리, 작은 볼륨 생물학 견본을 위해 특히 적합 한 대체 접근 될 수 있는 제안 합니다.
서론
Exosomes는 EVs, 50-200 nm 직경에서의 작은 하위 집합 그리고 신호 처리1,2,3,,45의 다양 한 배열을 통해 여러 생물 학적 기능을가지고. 그들은 주로 지질, 단백질 및 핵 산6,,78,9 등 화물 분자 세포 통신을 촉진 하 여 세포와 조직의 항상성 적용 . EV 연구에서 하나의 중요 한 단계는 격리 프로세스입니다. 차동 ultracentrifugation (UC), 또는 밀도 그라데이션 원심 (DGC) 없이 황금 표준 접근 방식으로 간주 됩니다 하지만이 방법은 비효율적 EV 복구 속도 낮은 확장성10 를 포함 하 여 주요 제한 사항 , 11 ,....
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프로토콜
동물의 활용 및 모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터 (CSMC)에 의해 승인 되었다.
1. murine Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 수집 및 준비
- BALF 컬렉션
- 케 타 민 (300 mg/kg) 및 자 궁 경부 전위 뒤 복 루트를 통해 xylazine (30 mg/kg)의 칵테일 쥐 안락사
- 기도에 22 G angiocatheter를 삽입 합니다. 얼음 처럼 차가운 살 균 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)의 1 mL (mL)을 포함 하는 인슐린 주사기를 연결 하 고는 angiocatheter 통해 양쪽 폐로 DBPS의 1 mL를 주입.
- 천천히 BALF 검색 하 여 50 mL 원뿔 튜브로는 BALF 분배 주사기 플런저를 철회 한다. 얼음에 BALF 유지.
- 1.1.2, 1.1.3 단계를 반복 3 배 (4 배 총 각 마우스에).
참고: 약 0.8 mL 주입의 밀리 리터 당 일반적으로 검색 됩니다. 또한, 개별 마우스 (즉, 3 mL의 BALF), 다음 단계를 수행할 수 있습니다 하지만 여러 BALF 샘플 풀링 다운스트림 실험에 일관성에 대 한 ....
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결과
마우스 BALF에서에서 EV 격리를 수행 하는 우리 같은 날에 UFC와 UC DGC 격리 방법을 사용 하 여. 반면에 UC DGC 기술 필요한 처리 시간의 8 h UFC 메서드 약 2.5-3 h, 필요 합니다. 이 버퍼 및 시 약 준비 시간을 포함 하지 않았다. 그것은 긴 원심 기간 동안 다른 작업을 수행할 수는 주목 한다. 그럼에도 불구 하 고, 전체 절차는 거의 하루 종일 UC DGC 격리 기술에 대 한 지속.
정상적인 쥐 UFC 메서드에서 고립에서 EVs BALF 파생 표시 작은 크기와 UC DGC EVs (176.7 ± 7.8 nM, 그림 1B)에 비해 더 균일 한 크기 분포 (148.8 ± 1.1 nM, 그림 1A). UFC 기술 심오한 했다 65-.......
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토론
지난 몇 년간, 과학자는 세포 항상성에서 EVs의 significances unraveled는. 더 중요 한 것은, EVs 역할 주요 많은 질병 과정에 그들의 생리 화물 분자1,21,22,,2627 를 통해 이웃과 먼 셀을 변조 하 여 , 28 , 29 , 30. 미래 개발 및 발전이 분야에서 깊이 의존 신뢰할 수 있는 그리고 효율적인 방법 뿐만 아니라 식별 하 고 별도 EV 인구의 하위 집합을 수정 하지만 또한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들의 생.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
작품은 NHLBI/NIH 교부 금 HL103868 (컴퓨터)에 및 HL137076 (시공)를, (PC)를 미국 심장 협회 선진적인 및 Samuel Oschin 포괄적인 암 연구소 (솟) 폐 암 연구 상 (컴퓨터)에 의해 지원 됩니다. 우리는 우리에 게 EV 나노 분석 추적에 대 한 Nanosight 기계를 제공 하는 삼목 시 나이 의료 센터에 Smidt 심장 연구소에 우리의 큰 감사를 표현 하 고 싶습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 원심 필터 Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| 염화나트륨 | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | 밀도 구배 매체 |
| 케타민 | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| 주사기 1mL | BD 주사기, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD 주사기, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| 원심분리기 튜브 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 원심분리기 튜브 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 항체 | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| 쥐 anti-mouse PE-CD63 항체 | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| 항토끼 IgG, HRP 결합 항체 | 세포 신호 기술, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x 환원제(볼트) | |||
| 10x 용해 버퍼(볼트) | 세포 신호 기술, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 아크릴아미드 겔 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 니트로셀룰로오스 미니 스택 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| 화학발광 HRP 항체 검출 시약 HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| 초원심분리기 튜브 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| 초원심분리기 튜브 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| 코닝 SFCA 주사기 필터 0.2 &마이크로; m pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, | ||
| Beckman Coulter, Pasadena, | CA-Nanosight | ||
| (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK- | 입자 크기 분포를 측정하고 입자 농도 | |
| MACSQuant Analyzer 10 유세포 분석기 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, | Germany-iBlot | |
| Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad | ||
| ChemiDoc MP 이미징 시스템 | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | 분석 소프트웨어 |
참고문헌
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of B....
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재인쇄 및 허가
