Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

요약

여기, 두 세포 외 기 격리 프로토콜, 한 원심 분리 및 밀도 그라데이션 원심 분리, extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 액체 샘플에서 분리 된 ultracentrifugation 설명 합니다. 두 방법으로 murine bronchoalveolar 게 액체에서 파생 된 세포 외 소포는 계량 하 고 특징.

초록

Extracellular 소포 (EVs)는 많은 생물학 기능 생리 및 병리학 상태 동안 신호에 중요 한 역할을 하는 새로 발견된 된 subcellular 요소입니다. EVs의 각 기법에 기본 제한으로 인해이 분야에서 주요 도전 되 고 있습니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 방법으로 차동 ultracentrifugation 일반적으로 사용 되는 방식 이며, EV 격리에 대 한 표준 절차로 간주 됩니다. 그러나,이 절차 시간이, 노동 집약, 그리고 일반적으로 bronchoalveolar 게 액체 같은 작은 볼륨 샘플에 적합 하지 않을 수 있습니다 낮은 확장성에서 결과. 한 원심 분리 방법 간단 하 고 시간 및 노동 효율 아직 제공 높은 복구 수율 및 순도 설명 합니다. 우리는이 격리 방법 EV 격리, 작은 볼륨 생물학 견본을 위해 특히 적합 한 대체 접근 될 수 있는 제안 합니다.

서론

Exosomes는 EVs, 50-200 nm 직경에서의 작은 하위 집합 그리고 신호 처리^1,2,3,,45의 다양 한 배열을 통해 여러 생물 학적 기능을가지고. 그들은 주로 지질, 단백질 및 핵 산^{6,,78,9 등 화물 분자 세포 통신을 촉진 하 여 세포와 조직의 항상성 적용} . EV 연구에서 하나의 중요 한 단계는 격리 프로세스입니다. 차동 ultracentrifugation (UC), 또는 밀도 그라데이션 원심 (DGC) 없이 황금 표준 접근 방식으로 간주 됩니다 하지만이 방법은 비효율적 EV 복구 속도 낮은 확장성¹⁰ 를 포함 하 여 주요 제한 사항 ^{, 11 , 12}, 그 큰 볼륨 샘플, 셀 문화 표면에 뜨는 또는 높은 exosome 생산 표본 등의 최고의 사용률을 제한합니다. 적용 또는 크로마토그래피, immunoaffinity 격리 구슬 또는 열 및 마이크로, 크기 배제 같은 다른 방법의 장단점은 잘 설명 하 고 현대 보충 절차 개발 되었습니다. 극복 하 고 각 접근^{11,12,13,,1415}에 기술적 한계를 최소화 합니다. 다른 필터 단위에서 성공 막으로 한 원심 (UFC) UC 방법^16,,1718에 비해 순도 제공 하는 대체 기법입니다 나타났습니다. 이 기술은 다른 절연 방법 중 하나로 간주 될 수 있습니다.

Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 들어 EVs를 다양 한 호흡기 조건^19,20,,2122에서 다양 한 생물 학적 기능을가지고 있습니다. 공부 BALF 파생 EVs 임무 인 인간, 상계 절차로 제한 된 양의 게 유체 복구의 침입으로 인해 몇 가지 도전. 쥐 같은 작은 실험실 동물에 몇 밀리 리터 정상적인 폐 조건에서 복구할 수 있습니다, 그리고 염증 또는 거리 폐²³에 덜도. 따라서, EV 격리에 대 한 충분 한 양의 BALF 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 차동 ultracentrifugation에 의해 수집 수 있습니다 실현. 그러나, 올바른 EV 인구 격리 EV 생물 학적 기능을 공부에 대 한 중요 한 요소 이다. 효율성과 효능 사이의 미묘한 균형 잘 설립 EV 격리 방법에 도전 하 고 있습니다.

현재이 연구는 100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) nanomembrane 필터 단위를 활용 하 여 원심 외 접근 BALF 같은 작은 볼륨 생물 표본 적합은 보여 줍니다. 이 기술은 간단 하 고 효율적으로, 그리고 높은 순도 BALF 파생 EVs의 연구를 지 원하는 확장성을 제공 합니다.

프로토콜

동물의 활용 및 모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터 (CSMC)에 의해 승인 되었다.

1. murine Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 수집 및 준비

1. BALF 컬렉션
   1. 케 타 민 (300 mg/kg) 및 자 궁 경부 전위 뒤 복 루트를 통해 xylazine (30 mg/kg)의 칵테일 쥐 안락사
   2. 기도에 22 G angiocatheter를 삽입 합니다. 얼음 처럼 차가운 살 균 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)의 1 mL (mL)을 포함 하는 인슐린 주사기를 연결 하 고는 angiocatheter 통해 양쪽 폐로 DBPS의 1 mL를 주입.
   3. 천천히 BALF 검색 하 여 50 mL 원뿔 튜브로는 BALF 분배 주사기 플런저를 철회 한다. 얼음에 BALF 유지.
   4. 1.1.2, 1.1.3 단계를 반복 3 배 (4 배 총 각 마우스에).
      참고: 약 0.8 mL 주입의 밀리 리터 당 일반적으로 검색 됩니다. 또한, 개별 마우스 (즉, 3 mL의 BALF), 다음 단계를 수행할 수 있습니다 하지만 여러 BALF 샘플 풀링 다운스트림 실험에 일관성에 대 한 EVs의 큰 배치의 절연을 허용할 것 이다.
2. BALF 준비
   1. 25 마우스에서 BALF 수영장 하 고 동등한 두 (약 수 당 ~ 35 mL)으로 나눕니다.
   2. 세포와 다른 세포 파편을 제거 하는 상쾌한 수집에서 5 분, 4 ° C에 400 x g BALF 원심.
   3. 세포 파편을 제거 하려면 10 분, 4 ° C에서 1500 x g에서 상쾌한 원심. 상쾌한을 수집 하 고 EV 격리 단계를 진행 합니다.

2. 세포 외 소포 Murine Bronchoalveolar 게 액체에서의 격리

참고:이 연구에서 두 개의 EV 격리 기술, 즉 UFC와 부 력과 ultracentrifugation 사용 BALF에서 EVs를 분리. 각 방법의 상세한 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다.

1. 한 원심 (UFC) 농축 방법
   참고:이 메서드는 앞에서 설명한 프로토콜¹⁰에서 수정 되었습니다.
   1. 1.2.3 단계별로 0.2 μ m 무 균 주사기 필터에서 상쾌한 필터링 하 고 얼음에 필터링된 BALF 유지.
      참고: 이것은 이다 크기 제외 단계 그것에 의하여만 200 보다 작은 소포 nm 수집 됩니다.
   2. 폐기는 DPBS 10 분 4 ° C에서 10 분 원심 1500 x g에서 원심 단위에 대 한 살 균 DPBS와 100 kDa MWCO 원심 필터 단위를 equilibrate.
      주의: 필터 장치에 막 DPBS와 equilibrated는, 일단 막 유지 해야 젖은 장치가 사용 될 때까지 모든 시간에.
   3. 2.1.1 단계에서 BALF 샘플의 15 mL로 필터 단위를 작성 하 신 4 ° c.에 30 분 동안 3000 x g에서 원심 분리기 흐름을 통해 BALF는 삭제 또는 별도 정식 관으로 수집 고 나중에 사용-80 ° C에 저장 될 수 있습니다.
   4. 나머지 0.2 µ m 필터링 BALF에 대해 2.1.3 단계를 반복 합니다.
      참고: 그것은 충분히 35 mL의 원래 시작 볼륨에서 BALF EVs를 집중 하는 centrifugations의 3 개의 반복 했다. 이 retentate의 1-1.5 mL 귀착되는.
   5. 살 균 DPBS의 14 mL와 retentate는 부드럽게 pipetting 반복적으로 세척. 원심에서 30 분, 4 ° C에서 3000 x g 필터 단위는 DPBS 제거 하 고 EV retentate 집중.
   6. 필터 장치 하단에는 pipettor를 삽입 하 고 철수 총 복구 되도록 사이드-투-사이드 연소 모션을 사용 하 여 샘플 필터 장치에서 집중된 BALF 파생 EVs를 수집 합니다.
   7. 약 BALF 파생 EVs 수-80 ° C 더 입자 정량화 및 특성화 (3 단계 참조)에서 그들을 저장 하 고.
2. 부 력 밀도 그라데이션 원심 (DGC)와 Ultracentrifugation (UC)
   참고: 다음 프로토콜은 앞에서 설명한 프로토콜²⁴에서 수정 되었습니다.
   1. 37 mL ultracentrifuge 튜브에는 상쾌한 2.1.1 단계에서 전송 하 고 ultracentrifuge를 사용 하 여 4 ° C에서 30 분 동안 10000 x g에서 샘플 원심. 상쾌한 고 60 분 동안 4 ° C에서 100000 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다. EV 펠 릿 centrifuged는 하는 동안 단계 2.2.3 부 력 밀도 그라데이션 버퍼 (표 1)의 다른 농도 준비 합니다.
   2. 삭제는 상쾌한 고 DPBS의 200 μ에 EV 펠 릿 resuspend.
   3. 50 %iodixanol 작업 솔루션 (표 1)의 300 μ와 EV 현 탁 액을 혼합 하 고 15 mL ultracentrifuge 관에 그것을 전송. 50% iodixanol EV 혼합물 정지 위에 순차적으로 가기 하단에서 순서로 다음 버퍼 솔루션 레이어: 30 %iodixanol (4.5 mL), iodixanol (3 mL), 15 %iodixanol (2.5 mL), 및 5 %iodixanol (6 mL)의 25%. 230 분 4 ° C에서 100000 x g에서 원심 분리기.
      참고: 부 력 밀도 그라데이션 iodixanol 하단 상단에 최저 농도 (5%)에 가장 높은 농도 (50%)와 확장의 비율에 근거한 다. Iodixanol의 다양 한 농도 생성 하려면 균질 매체 (표 1) 다양 한 양의 작업 솔루션 (50 %iodixanol)와 혼합 했다.
   4. 15%와 25% 분수를 수집 하 고 볼륨을 15 mL를 무 균 DPBS에 그들을 희석. 새로운 작은 ultracentrifuge 튜브와 60 분 동안 4 ° C에서 100000 x g에서 원심 분리기에 그들을 전송.
   5. 상쾌한 삭제 하 고 추가 특성에 대 한 살 균 DPBS의 50 μ에 EV 펠 릿 resuspend.

3. 세포 외 기 정량화

참고: BALF 파생 EVs 복구 수익률 두 통계 quantitated입니다.

1. 나노 측정 분석 (NTA)를 추적
   1. 1: 200에서 EV 샘플 희석-DPBS 및 부하는 인슐린 주사기에 샘플의 1 mL에 1: 500. 주사기 펌프 샘플 주사기를 연결 하 고 ( 재료의 표참조) 입자 숫자와 크기를 측정 하기 시작.
   2. 모든 샘플 측정 1 카메라 수준 14와 검출 임계값에 설정 합니다. 1500 프레임 30에 5 반복 측정의 20의 지연 각 샘플에 대 한 기록 된 읽기 사이 s. 결합 하 고 최종 농도 및 크기 보고서에 대 한 데이터를 평균.
      참고: 모든 입자의 정확한 캡처에 대 한 모든 입자를 시각화 하 고 비슷한 설정을 사용 하 여 각 실험에서 모든 샘플 측정에 적합 한 카메라 수준을 조정 합니다.
2. 단백질 정량화
   참고: bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 BALF 파생 EVs의 단백질 농도 측정 하기 위해 사용 되었다.
   1. 1 x 세포의 용 해 버퍼에서 EV 샘플 solubilize
   2. BCA 표준 프로토콜 색도계 탐지 560에서 흡 광도 측정 하 여 당 BALF 파생 EVs에 있는 단백질의 양을 계량 접시 리더에 nm.

4. 세포 외 소포 BALF 파생의 탐지

참고: 일반적으로 알려진된 exosome 표면 마커 단백질 (TSG101, CD63, CD81, 및 CD9) EV 복구 확인 하 SDS 페이지 및 immunoblotting 흐름 cytometry 분석에 의해 사용 되었다.

1. SDS 페이지 및 immunoblotting
   1. 버퍼 (리튬 라우릴 황산 염) 및 1.6 mL 튜브에서 50 m m dithiothreitol (DTT) 로드 blotting으로 각 샘플의 EV 단백질의 동일한 금액을 디졸브. 10 분 동안 70 ° C에서 샘플을 열.
   2. 4-12% 두번째-트리 스 플러스 아크릴 아 미드 젤으로 4.1.1 단계에서 샘플을 로드 하 고 실행할 전기 이동 법 (150 볼트, 35 mA) 35 분.
   3. 건조 전송 방법을 사용 하 여 니트로 막 단백질을 전송 합니다.
   4. 60 분, 실 온 (RT)에서 락 5% 무 지방 우유와 함께 막을 차단 합니다.
   5. 5 %BSA Tris 버퍼 염 분 트윈 20 (TBST) 하룻밤 락 4 ° c에서 1: 500 희석에는 EV 표면 단백질 마커, 종양 민감성 유전자 101 (TSG101)에 항 체를 막 품 어.
   6. 다음 날, 씻고 막 3 x, 10 분 각 TBST 버퍼에서 세척 하 고 안티-토끼 IgG, HRP 연결 된 항 체, 실시간에서 60 분에 대 한 1:5,000 희석에와 그것을 품 어
   7. 3 막 씻고 x, 각 세척, TBST 버퍼에서 10 분. Chemiluminescent HRP 항 체 탐지 시 약 및 이미지 (이미징 시스템에 대 한 재료의 표 참조)와 막 개발.
2. Cytometry
   1. PEB 버퍼 (PBS + 5 mM EDTA + 0.5 %BSA, 0.1 μ m 주사기 필터 멤브레인 통해 필터링) 얼룩의 49 μ BALF 파생 EVs를 희석.
   2. 각 개별 샘플으로 다음 항 체의 각 추가: 1) 쥐 반대로 마우스 PE CD63 항 체 (100 반응 당 ng); 2) 쥐 반대로 마우스 PE CD81 (500 ng); 3) 쥐 반대로 마우스 FITC CD9 (200 ng). 어둠 속에서 60 분 락 4 ° C에서 품 어.
   3. 멤브레인 필터 PEB 버퍼 얼룩의 450 μ와 샘플을 희석 하 고 교류 cytometry 분석 하는 샘플 제목 ( 재료의 표참조)²⁵.
   4. 다음과 같이 교류 cytometer 설정을 조정: 1) 하이퍼 로그 (hlog);에 모든 채널 설정 2) 4;에 SSC에 트리거 설정 3) 보조 트리거 해제 합니다. 낮은 속도 설정에서 샘플을 실행 하 고 각 샘플에 적어도 10000 이벤트를 확보.
   5. 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플에 낮은 cytometry 데이터 분석 수행 ( 재료의 표참조).

결과

마우스 BALF에서에서 EV 격리를 수행 하는 우리 같은 날에 UFC와 UC DGC 격리 방법을 사용 하 여. 반면에 UC DGC 기술 필요한 처리 시간의 8 h UFC 메서드 약 2.5-3 h, 필요 합니다. 이 버퍼 및 시 약 준비 시간을 포함 하지 않았다. 그것은 긴 원심 기간 동안 다른 작업을 수행할 수는 주목 한다. 그럼에도 불구 하 고, 전체 절차는 거의 하루 종일 UC DGC 격리 기술에 대 한 지속.

정상적인 쥐 UFC 메서드에서 고립에서 EVs BALF 파생 표시 작은 크기와 UC DGC EVs (176.7 ± 7.8 nM, 그림 1B)에 비해 더 균일 한 크기 분포 (148.8 ± 1.1 nM, 그림 1A). UFC 기술 심오한 했다 65-...

토론

지난 몇 년간, 과학자는 세포 항상성에서 EVs의 significances unraveled는. 더 중요 한 것은, EVs 역할 주요 많은 질병 과정에 그들의 생리 화물 분자^{1,21,22,,2627} 를 통해 이웃과 먼 셀을 변조 하 여 ^{, 28 , 29 , 30}. 미래 개발 및 발전이 분야에서 깊이 의존 신뢰할 수 있는 그리고 효율적인 방법 뿐만 아니라 식별 하 고 별도 EV 인구의 하위 집합을 수정 하지만 또한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들의 생...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Material
Amicon Ultra-15 원심 필터 Ultracel-100K	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Corning Cellgro, Manassas, VA	21-031-CV
Sucrose	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	EMD8550
HEPES	Research Products International, Prospect, IL	75277-39-3
EDTA	Corning Cellgro, Manassas, VA	46-034-CI
염화나트륨	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	S3014-1KG
OptiPrep	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	MKCD9753	밀도 구배 매체
케타민	VetOne, Boise, ID	13985-702-10
Xylazine	Akorn Animal Health, Lake Forest, IL	59399-110-20
주사기 1mL	BD 주사기, Franklin Lakes, NJ	309656
Angiocatheter 20 G	BD 주사기, Franklin Lakes, NJ	381703
원심분리기 튜브 15 mL	VWR, Radnor, PA	89039-666
원심분리기 튜브 50 mL	Corning Cellgro, Manassas, VA	430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay	Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL	23235
Rabbit anti-mouse TSG101 항체	AbCam, Cambridge, MA	AB125011
쥐 anti-mouse PE-CD63 항체	Biolegend, San Diego, CA	143904
CD81
CD9
항토끼 IgG, HRP 결합 항체	세포 신호 기술, Danvers, MA	7074S
4x LDS
10x 환원제(볼트)
10x 용해 버퍼(볼트)	세포 신호 기술, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 아크릴아미드 겔	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	NW04120
iBlot 2 니트로셀룰로오스 미니 스택	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	IB23002
화학발광 HRP 항체 검출 시약 HyGLO	Denville Scientific, Holliston, MA	E2400
초원심분리기 튜브 17 mL	Beckman Coulter, Pasadena, CA	337986
초원심분리기 튜브 38.5 mL	Beckman Coulter, Pasadena, CA	326823
코닝 SFCA 주사기 필터 0.2 &마이크로; m pore	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	09-754-13
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg,
	Beckman Coulter, Pasadena,	CA-Nanosight
(NS300)	Malvern, Worcestershire, UK-		입자 크기 분포를 측정하고 입자 농도
MACSQuant Analyzer 10 유세포 분석기	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,	Germany-iBlot
Transfer Apparatus		Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP 이미징 시스템	Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10			분석 소프트웨어