방법 논문

수은 카드뮴의 검출에 대 한 혐 기성 바이오 센서 분석 결과

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DOI:

10.3791/58324

⸱

2018년 12월 17일

 ,  , 
1Department of Biology, University of Ottawa

이 논문에서

요약

여기, 우리가 어떻게 다른 환경 변수를 평가 하는 혐 기성 전체 셀 미생물 바이오 센서를 사용 하는 프로토콜을 제시 무산 소 환경에서 박테리아를 Hg와 Cd의 bioavailability에 영향을 미칠.

초록

미생물을 수은 (Hg) bioavailability 식품 웹에서 독성 Hg biomagnification에 중요 한 단계 이다. 카드뮴 (Cd) 변환 및 박테리아 bioavailability 주식 작물에 축적 됩니다 금액을 제어 합니다. 이러한 금속의 bioavailability 솔루션, 하지만 Hg 독성 monomethylmercury (MeHg)에 갠 및 Cd는 rhizosphere에서 지속 무산 소 조건에서 특히 그들의 종 형성에 따라 달라 집니다. 전체 셀 미생물 바이오 센서는 금속은 cytosol 들어가고 따라서 유용한 도구 금속 bioavailability를 평가 하는 때 같지는 신호를 줄. 불행히도, 대부분 바이오 센 싱 노력 까지는 산소가 없을 경우에는 함수에 기존 기자 단백질의 제한 된 능력으로 인해 oxic 환경 제한 되어 있다. 이 연구에서 우리는 우리의 노력을 개발 하 고 전체 셀 바이오 센서 분석 결과 작동 수 있는 최적화 anaerobically 준 진짜 시간에서 및 시간 무산 소 조건 하에서 금속을 감지할 수를 제시. 우리는 어떻게는 바이오 센서 평가 어떻게 화학 변수 관련 금속 영향의 환경 자전거 그들의 bioavailability을 도울 수 설명 합니다. (1) Hg를 준비 하는 방법을 포함 하는 다음 프로토콜 및 무산 소 조건, (2) Cd 표준 산소, (3) 디자인의 부재에 바이오 센서를 준비 하 고 Hg 또는 Cd bioavailability, 및 (4)에 미치는 일련의 변수를 확인 하는 실험을 실행 계량 하려면 바이오 센서 데이터를 해석. 우리는 바이오 센서의 선형 범위를 표시 하 고 금속을 유도할 수 있는 및 제정 종자를 이용 하 여 금속 bioavailability와 독성 사이 구별 하는 메서드의 기능을 보여 주는 예제를 제공 합니다.

서론

수은 (Hg) 글로벌 오염 물질 이며 Hg 미생물 methylating에 그것의 bioavailability 음식 거미줄 인간에서 가능한 신경 효과 및 야생 동물1통해 자사의 biomagnification 향한 첫 번째 단계입니다. 그것은 현재 그 미생물 Hg 메 틸 화는 요구 하는 세포내 과정 생각: i) Hg bioavailable2,3,,45,6,7 수의 종 ii) Hg8,,910methylating의 순수 수 셀. 하지만 유기 체, 카드뮴 (Cd) bioaccumulates foodwebs에 biomagnifies 하지 않으며 사람과 환경11일반적으로 급성 노출 시키는 산업 및 상업 공정에 널리 사용 됩니다. 미생물 핵심 역활을 여러 환경에서 Hg의 운명에, 비록 Cd 지구 화학 및 ecotoxicology에 대부분의 연구는 미생물 진핵생물12에 초점. 농업 작물 (예를 들어, 쌀)의 소비는 카드뮴;에 직접 노출의 주요 소스 이 경우에 rhizosphere의 미생물을 Cd의 bioavailability 직접 금액을 영향 식물13누적 될 수 있습니다.

Hg 전송 경로 복잡 하 고 가능 하 게 활성 전송 단계14를 포함 한다. 전송 관련 최근 작품 HgII 는 Zn을 사용 하 여 제안II 또는 미네소타II 전송7,15,,1617. 반면 CdII 실수로 수송 가설 (특히 미네소타II 또는 ZnII) divalent 금속 전송 경로 통해 cytosol로 CdII 의 메커니즘 셀 유지 하는 내부 전송 투기, 그리고 더 Cd 전용 전송 경로 확인 된13,18되었습니다. 관련 된 전송기의 자연에 3 개의 기계적 요인 궁극적으로 셀 입력 금속 수 결정: 솔루션2,6,15, i) 금속 종 형성 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii)는 세포 막17,,2425,26,27,28,29의 biophysiochemical 속성 ,,3031및 iii) 전송 사이트7,32액세스할 수 금속에 대 한 능력. Cd 및 Hg 또는 되지 않습니다 때문에 그들의 높은 선호도 대 한 해산 유기 물질 (DOM), 미생물 생리학 관련 조건 하에서 자유로운 이온으로 존재 하는 것 (예를 들어, EDTA), 오염 물질을 킬레이트 화 황 moieties33, 감소 34,35 (CdII 는 무료 이온 또는 양식 이온-쌍이이 ligands의 휴무에서 존재할 수 있습니다). 어떻게 이러한 금속 종은 환경에 그들의 운명에 관련 된 조건 bioavailable 결정에 효율적인 방법의 부족이 이다. 예를 들어, Hg 혐 기성 조건14, 아래 갠 고 카드뮴과 Hg는 부드러운 금속 (또는 클래스 B 양이온), 감소 된 유황 그룹의 무결성을 유지 하는 조건 하에서 그들의 종 분화를 조사 요구.

미생물 바이오 센서는 금속,이 경우 Hg 또는 Cd의 세포내 농도에 대응 가능한 신호를 방출 하는 세균성 세포 이다. 이와 같이, 그들은 이상적인 도구 노출 조건에 대 한 신중 하 게 제어 됩니다 어떻게 금속 입력 셀36를 이해 하. Hg 바이오 센서는 일반적으로 메 르의 규제 회로 사이 유전자 융해를 포함-오 페론 (연산자 및 발기인으로는 오 페론의 전사 레 귤 레이 터 MerRas에 대 한 인코딩을 포함 하 여 유전자), 및 유전자 보고 (예: 럭 스, gfp, 락 유전자). 수은 세포질에 존재 하는 때 그것 MerR, 후속 신호 생산19,37고 보고 유전자의 녹음 방송에 있는 결과에 바인딩합니다. 특정 Cd 바이오 센서는 일반적으로 cadC를 사용 하 여 설계 cadAC, zntA 또는 zntR 인코딩 전사 레 귤 레이 터38, 하지만 MerR Cd5, 아직 같지는 선호도 지적 가치가 있다. 대부분의 에어로빅 제한 일반적으로 사용 또는 형광 발광 기자 단백질, 최근 미생물 바이오 센서는 생물학적 무산 소 조건 하에서 금속에 대 한 통찰력을 제공 하 없는 남아 때까지. 이것은 금속 bioavailability의 혐 기성 검출 매우 어려운 조건의 범위에 걸쳐 redox 민감한 ligands (예를 들어, 황화와 thiols)4, 의 특히 환경 그들의 운명에 관련 5 , 39.

완화의 방법론 장애물 라이브 이미징 Drepper 외. 산소의 부재에 (2007) 플 라빈 기반 형광 단백질 (FbFp)를 개발, P. putida에서 SB2 단백질의 가벼운 산소 전압 도메인에 따라. 이 단백질 가족은 산소40의 부재에서 형광을 수 있다. Drepper 외의 일에 건물, 연구소 설계 Hg bioavailability oxic 무산 소 조건 하에서 및 넓은 범위의 염 분 17의 연구에 대 한 허용 하는 혐 기성 바이오 센서. 현재 신문에서 우리 준비는 바이오 센서를 사용 하 여 환경 변수 Hg 또는 Cd bioavailability에 영향을 테스트 하는 방법을 설명 합니다. 우리가 HgII는 바이오 센서 개발, 우리는 바이오 센서는 또한 공동 환경에서 발생 하는 여러 스트레스 응답할 사실에 독자의 관심을 끌기 위해 수단으로 CdII 와 실험을 수행 하기로 행렬; 이 경우 CdII MerR5transcriptional 레 귤 레이 터에 바인딩할 알려져 있기 때문에 조사 되었다. 여기, 우리 대표 교정 및 중 금속 기준 기능 선형 범위를 보여줍니다. 우리는 또한 줄 예를 들어 바이오 센서의 결과 결정적인 (MgII 와II Hg bioavailability에 Mn) 및 불확실 (ZnII Hg bioavailability에).

프로토콜

1. 성장 매체 및 노출 미디어 준비

  1. 성장 매체의 250 mL 수 있도록:
    참고: 추적 요소 #1 솔루션 및 추적 요소 #2 솔루션 준비가 이미, 1.1.5 단계로 건너뜁니다.
    1. 1.5 x 10-3 M 총2MoO4, 6.5 x 10-4 M 나2서4, 5 x 10-3 M H3보의 마지막 molarities를 포함 하는 깨끗 한 부피 측정 플라스 크 (200 mL)에서 추적 요소 #1 솔루션 을 준비합니다 3, 그리고 0.1 M NaOH입니다.
      주의: 강한 기초 (NaOH)은 부식성. 확실히 때 최종 몰 나타내는 주요 성분; 되도록 시 약 무게 확인 모, Se, 및 b.
    2. 살 균 분야에서 필터 청소/살 균 플라스틱/소계 (PTFE) 병에서 0.22 μ m polyethersulfone 주사기 필터를 사용 하 여 소독.
    3. 깨끗 한 부피 측정 플라스 크 (200 mL) 0.01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3.25 x 10-3 M CoCl의2, 마지막 molarities를 포함 하에서 추적 요소 #2 솔루션 준비 6.25 x 10-3 M NiCl 2, 0.1 m M H2이렇게4.
      주의: 강한 산 (H2이렇게4) 부식성이 있다. 확실히 때 최종 몰 나타내는 주요 성분; 되도록 시 약 무게 확인 Mn, Zn, Co, 그리고 Ni입니다.
    4. 살 균 분야에서 필터 깨끗 한 유리병에는 0.22 μ m polyethersulfone 주사기 필터를 사용 하 여 소독.
    5. 청소/살 균 유리 병 (250 mL 최소); 불 임 분야에서 냉동된 (-20 ˚C) 약 수, 4 M 나노3 의 1.25 mL에서에서 200 mL 초순, M9 최소한의 소금 (5 x, 참조 테이블의 재료)의 42.5 mL, 2 M 포도 당, 2 M MgSO4의 125 µ L, 0.6 M 티 아민 HCl의 1200 µ L의 2.5 mL을 추가 0.075 M L-신의 770 µ L / L-이소류신 valine 솔루션, 250 µ L 추적 요소 #1, 250 µ L의 추적 요소 # 2의, 그리고 250 µ L 0.01 M EDTA 나트륨 소금 /.
      참고: 사전 및 0.22 μ m polyethersulfone 주사기 필터를 사용 하 여 살 균 필터 단계 1.1.5에서에서 모든 시 약 준비 되어야 한다. 초순 수는 압력솥을 사용 하 여 멸 균 수 있습니다.
    6. 지금 단계 1.1.5에서에서 솔루션을 포함 하는 유리 병., 느슨하게 모자 하 고 혐 기성 챔버 공기 잠금 순환.
    7. 혐 기성 챔버에4병을 단단히, 모자 및 모든 백색 침전 사라질 때까지 흔들어 그래서 0.225 M FeSO4 0.2 M H2의 15 µ L를 추가 합니다.
      참고: 사전 및 0.22 μ m polyethersulfone 주사기 필터를 사용 하 여 살 균 필터 단계 1.1.7에서에서 모든 시 약 준비 되어야 한다. 그래서 0.2 M H20.225 M FeSO4 저장 혐 기성 챔버에4 .
    8. 병에서 뚜껑을 제거 하 고 교환, 병, 뚜껑을 대체 하는 공기에 대 일 분을 기다려 다음 적극적으로 악수. 일단이 단계를 반복 합니다.
    9. 병에 뚜껑을 단단히 고정 하 고 혐 기성 챔버에서 제거 사용까지 냉장고 (4 ˚C)에서 병을 저장 합니다.
    10. 성장 매체 1.1.5 1.1.9 단계를 반복 하 여 일주일에 한 번 만들어 합니다.
  2. 있도록 노출 매체 의 100 mL 2 x 50 ml에서 원뿔 멸 균 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브:
    그러나 참고: 좋습니다 그 노출 매체 그것은 사전에 만들어질 수 있다 오염, 위험을 최소화 하기 위해 노출 시험 당일 준비 하 고 냉장고에 저장 될.
    1. 혐 기성 챔버에 각 50 mL를 원심 분리기 튜브 추가 혐 기성 초순의 42 mL, 1의 350 µ L M 나트륨 베타-Gylcerophosphate 냉동된 (-20 ˚C) 약 수, 1 M의 2 개 mL에서에서 MOPS 그래서 산, 50 μ 1 M (NH4)2의 무료4 포도 당 2 분의 125 μ, 2.5 M 코의 300 μ와 2.5 M NaOH의 200 μ.
      참고: 사전 및 0.22 μ m polyethersulfone 주사기 필터를 사용 하 여 살 균 필터 단계 1.2.1에서에서 모든 시 약 준비 되어야 한다. 초순 소독 압력솥을 사용 하 여 열 수 있습니다. 2.5 M NaOH와 2.5 M NaOH 플라스틱/PTFE 병에 저장 해야 합니다. 나열 된 모든 시 약은 혐 기성 챔버 를 제외 하 고 나트륨 베타-Gylcerophosphate, (˚C-20) 냉동 고에 저장 하는에 저장 되어야 합니다. 일반적으로, 그것은 산소의 흔적 그대로 혐 기성 챔버에 몇 일 동안 모든 플라스틱 또는 유리 부품, 컨테이너를 떠날 것이 좋습니다.
    2. 50 mL 원심 분리기 튜브 캡, 잘, 흔들 하 고 pH를 측정 하기 위해 약 10 mL 수를 제거 합니다. 이 노출 미디어의 측정 된 pH 7.00 ± 0.02 25 ˚C에서측정 항상 해야 합니다. 이 범위는 pH 측정 하지 않습니다, 경우 추가 2.5 M이 해결 하기 위해 코의 볼륨 조정.
      참고: 절대 pH 프로브와 pH에 대 한 해결 하기 위해 솔루션을 적정 하십시오. pH 프로브 오염 노출 매체에 대 한 소스를 나타냅니다. 항상 pH 단계 1.2.1에서에서 추가 된 시 약의 제품 이어야 합니다.
  3. 5-10 m m 나노3 재고 솔루션을 준비 하 고 혐 기성 챔버 노출 분석 결과의 시간 동안 사용할 수에.
    참고: 그것은 5-10 m m 나노3 기본 표준 만들기에 반대는 더 집중된 기본 나노3 표준 희석 쉽습니다.

2입니다. 수 및 카드뮴 표준의 준비입니다.

  1. 0.2 M H2에서 4-8 µ M Mercuric (HgII) 솔루션 준비 등4.
    1. 0.2 M H2에 millimolar (1-10 m m) HgCl2, HgNO3 또는 HgSO4 솔루션을 함으로써 Hg2 + 표준 준비 등4.
      주의: 수은 매우 독성이 고 H24 부식성 이므로. 필요한 모든 개인 보호 장비와 증기 두건에서 작동 합니다.
    2. PTFE 병에서 2.1.1에서 표준 희석. 0.2 M H2에 4-8 µ M Hg2 +의 범위 내에서 농도를 등4 .
      참고: 사용 하는 산 해야 분석 급료 H2이렇게4.
    3. 2.1.2에서 Hg 농도 수은 분석기를 사용 하 여 확인 합니다 ( 테이블의 자료를 참조).
      참고: Hg 농도 유효성 검사를 위한 다른 방법은 사용할 수 있습니다.
  2. 10 µ M Cd를 준비II 솔루션 10 m m H2이렇게4.
    1. 준비 CdCl2 (분말의 정확한 무게에 대 한 10-50 m m 범위)의 기본 표준 0.1 M H2이렇게4.
    2. 씻어 서 깨끗 한 산 20 mL에 직렬 희석의 시리즈에서 ptfe 검정 페 놀 나사 모자 붕 규 산 유리 튜브 고무 라이너 직면, 10 µ M Cd2 +2.2.1에서 표준 희석. 4 모든 후속 직렬 희석에 남아 10 m m H2의 농도 확인 합니다.

3. 혐 기성 노출 분석 결과 바이오 센서의 준비

  1. -80 ˚C cryostock Lysogeny 수프 접시 포함 120 ug/mL 암 피 실린에에서 수은 유도할 수 있는 바이오 센서 (E. 콜라가 NEB5α PUC57merR-PpFbFp를 은닉)와 constitutively 표현된 바이오 센서 (E. 콜라가 NEB5α PUC19Balch-PpFbFp를 은닉) 접시. 이러한 바이오 센서17의 생산에 대 한 자세한 내용은 우리의 이전에 게시 작업을 참조 하십시오.
  2. 에 4시 30분-오후 5 시, 문화 파운드 (+ 앰프) 10 mL에 접종 하 고 하룻밤 성장 한다.
    참고: 노출 분석 결과 대 한 혐 기성 문화를 준비 일 걸립니다 접시에서 출발 그것은 (즉, 문화는 월요일 오후 (4시 30분-오후 5 시)에 시작 준비가 될 것입니다 수요일에 정오 주변에 노출 분석 결과 대 한). 다음 단계는 필요한 미생물 기술이 노출 분석 결과의 날에 문화를 준비 하는 데 필요한 있습니다.
    1. 플레이트 문화에서 한 식민지 고 10 ml 암 피 실린 나트륨 소금 (최종 농도 210 ug/mL 앰프) 메 마른 문화 관에서 100 mg/mL 재고 솔루션의 21 µ L 로 Lysogeny 국물 (파운드) 추가.
    2. 인큐베이터/쉐이 커에 문화를 놓고 하룻밤 220 rpm에서 떨고와 +37 ˚C에서 성장 합니다.
  3. 9-10 am 다음날 아침 문화 resuspend 하 고 anaerobically (20 %inoculum) 하루 종일 성장.
    1. 혐 기성 챔버에 인큐베이터 (단계 3.2.1)에서 문화 그리고 성장 매체 (1.1.9 단계)를가지고.
    2. 무 균 발 츠 튜브로 신선한 성장 매체 와 암 피 실린 (210 μ g/mL)의 8 mL를 추가 합니다.
    3. 2 mL Microcentrifuge 튜브에 하룻밤 성장된 문화 및 전송의 2 개 mL를 수집 합니다. 90 초 동안 10000 RCF 단계에서 centrifuge 상쾌한 덤프 하 고, 2 mL 신선한 성장 매체의 resuspend. 신선한 성장 매체 와 암 피 실린의 8 mL를 포함 하는 발 츠 튜브를 resuspended 문화를 추가 합니다.
    4. 신중 하 게 무 균 기술을 사용 하 여, 발 츠 튜브에 고무 마 개를 놓습니다. 혐 기성 챔버 에서 제거 하는 인큐베이터/쉐이 커에 고 성장 anaerobically까지 3-5 오후 +37 ˚C에서 220 rpm에서 떨고.
  4. 3 오후 5 시 사이, 신선한 성장 매체 에 1% 혐 기성 inoculum을 수행 하 고 밤새 껏 성장.
    1. 성장 매체와 함께 혐 기성 챔버 로 발 츠 튜브 (3.3.4 단계)를가지고. 무 균 발 츠 튜브에서 앰프 (210 ug/mL 앰프)와 신선한 성장 매체 (1 %inoculum)의 10 mL를 100 µ L 의 문화를 추가 합니다.
    2. 신중 하 게 무 균 기술을 사용 하 여, 발 츠 튜브에 고무 마 개를 놓습니다. 혐 기성 챔버에서 제거 하 고 인큐베이터/통에 하룻밤 220 rpm에서 떨고와 +37 ˚C에서 성장.
  5. 9 오전 10 사이, resuspend anaerobically (20 %inoculum) 하루 내내 성장 하는 문화.
    1. 혐 기성 챔버에 인큐베이터 (3.4.1 단계)에서 문화 그리고 성장 매체 (1.1.9 단계)를가지고.
    2. 무 균 발 츠 튜브에 성장 매체 및 암 피 실린 (210 ug/mL 앰프)의 8 mL를 추가 합니다.
    3. 2 mL Microcentrifuge 튜브에 하룻밤 성장된 문화 및 전송의 2 m를 수집 합니다. 90 초 동안 10000 x g에서 centrifuge, 상쾌한, 덤프 및 2 mL 신선한 성장 매체의 resuspend. 신선한 성장 매체 와 암 피 실린의 8 mL를 포함 하는 발 츠 튜브를 resuspended 문화를 추가 합니다.
    4. 신중 하 게 무 균 기술을 사용 하 여, 발 츠 튜브에 고무 마 개를 놓습니다. 약 실에서 제거 하는 인큐베이터/쉐이 커에 고 anaerobically +37 ˚C 220 rpm에서 떨고 함께 성장.
  6. (단계 3.5.4) 분 광 광도 계를 사용 하 여 문화의 성장 모니터링 0.6의 OD600 에를 때까지. 반드시 읽고 각 세 전에 소용돌이 문화.
    참고:이 단계는 3-4 시간, 및 노출 분석 결과 (4.1 단계) 뿐 아니라이 시간 동안 노출 매체 (1.2 단계)를 준비 한다.
  7. 문화는 0.6 (0.1)의 OD600 (3-4 시간 예상 성장)에 도달 하면 성장을 중지 합니다.
    1. 2 x 2 mL Microcentrifuge 튜브로 혐 기성 챔버 (단계 3.6)에 튜브와 전송 문화를 가져와. 90 초 동안 10000 x g에서 centrifuge 상쾌한, 덤프 하 고, 2 x 2 mL 신선한 매체 노출의resuspend.
    2. 3.7.1 세척 단계를 반복 합니다. 성장 매체의 모든 추적을 제거 하려면 한 번.
  8. 세포 배양 (단계 3.7)의 두 microcentrifuge 튜브를 결합 하 여 바이오 센서 재고 노출 시험 (4 단계)에서 사용할 수를 얻기 위해 7 mL PTFE 표준 유리병에.
    참고: 사용 하기 전에 철저 하 게 아직 부드럽게 앞뒤로 pipetting으로 바이오 센서 소재 를 혼합 해야 합니다. 메서드 수 있습니다 한 시간에 대 한 여기 일시에 정지 됩니다.

4. 노출 분석 결과

  1. 플레이트 레이아웃을 디자인합니다.
    참고: 모든 pipetting 값 계산 및 주식 시작 하기 전에 준비 해야 합니다 노출 분석 결과. 어떻게 제대로 디자인 실험 및 컨트롤을 포함 하는 텍스트에 상세한입니다. 또한, 혐 기성 모니터에 표시 된 혐 기성 챔버 산소 경우 실험 시작 하지 한다.
    1. 96 잘 서식 파일에 따라 접시 레이아웃을 디자인 합니다. 3의 기술 복제에 실험을 실행 하려면 이렇게 하면 32 다른 치료에 대 한 최고의 튜브 ( 그림 1참조)를 설정 하는 4 x 8 눈금으로 표시 되는 있습니다.

figure-protocol-1
그림 1:는 96 잘 접시 (왼쪽)와 해당 4 x 8 그리드 PTFE를 포함 하는 접시에 전송 (오른쪽) 리 바이 알. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

참고: 수은 유도할 수 있는 바이오 센서; 2 치료 Hg 글귀에 변수의 역할에 대 한 테스트 해야 하는 경우 각 변수에 대 한: 빈 치료 및 치료 (바이오 센서 Hg 변수 + + 질 산) (바이오 센서 + 변수 + 질 산)입니다. 셀의 생리학에 변수의 역할에 대 한 테스트를 할 때 제정 바이오 센서 를 사용 하 여 2 개의 처리는 각 변수에 대 한 필요: 치료 (바이오 센서 Hg 변수 + + 질 산)와 치료 빈 ( 바이오 센서 + 변수 + Hg)입니다. 수은 카드뮴 대체 될 수 있습니다. Hg 또는 Cd 보정 곡선을 수행할 때 변수 될 것입니다. 제정 하 고 유도할 수 있는 바이오 센서 (같은 접시 레이아웃)에서 동시에 실행 될 필요가 없습니다. 플레이트 레이아웃 및 마그네슘 (변수)의 농도 범위를 테스트 하는 경우 해당 4 x 8 격자에 대 한 서식 파일 예제에에서 제공 됩니다 표 1).

123456789101112
는바이오 센서 + Hg + 질 산 + 0 mM Mg Hg 유도바이오 센서 + 질 산 + 0 mM Mg Hg 유도0 mM Mg + 질 산 + Hg, 제정 바이오 센서제정 바이오 센서 + Hg + 0 mM Mg
b바이오 센서 + Hg + 질 산 + 0.1 mM Mg Hg 유도바이오 센서 + 질 산 + 0.1 mM Mg Hg 유도제정 바이오 센서 + Hg + 질 산 + 0.1 mM Mg제정 바이오 센서 + Hg + 0.1 mM Mg
c바이오 센서 + Hg + 질 산 1 mM Mg Hg 유도바이오 센서 + 질 + 1 mM Mg Hg 유도1mm Mg + 질 산 + Hg, 제정 바이오 센서제정 바이오 센서 + Hg + 1 mM Mg
dHg 유도 10 mM Mg + 질 산 + Hg, 바이오 센서바이오 센서 + 질 산 + 10 mM Mg Hg 유도10 mM Mg + 질 산 + Hg, 제정 바이오 센서제정 바이오 센서 + Hg + 10 mM Mg
e

표 1: 한 예 판 레이아웃 Hg bioavailability를 테스트 하는 바이오 센서를 사용 하 여 (5 nM) 마그네슘 (0-10 m m)의 그라데이션 위로

  1. 분석 결과 플레이트 레이아웃에 따라 4 x 8 격자를 설정 합니다.
    1. 트레이에 7 mL PTFE 표준 튜브를 배치 합니다.
      참고: PTFE 튜브 산 세척/열 사용 전에 소독 해야 합니다. 튜브만 유리병의 외부를 조작 하 여 처리 합니다.
    2. 각 유리병에 각 치료에 해당 하는 노출 매체 볼륨을 추가 합니다.
      참고: 2000 µ L (2 mL)의 총 볼륨 노출, 노출 매체 추가 될 것입니다: 노출 매체 µ L 2000 µ L- 치료 (빈) µ L. = (예를 들어, 노출 매체 µ L 2000-100 µ L (바이오 센서)-40 µ L (질산염)-100 µ L (Hg = )-100 µ L (변수 (예: MgSO4)) = 1660 µ L). 테스트 변수 추가 볼륨 최종 볼륨의 5% (100 µ L)를 초과 하지 않도록 해야 합니다.
    3. 각 유리병에 화학 변수 접시 레이아웃에 따라 테스트를 솔루션의 해당 볼륨을 추가 합니다.
    4. 최종 농도 200 µ M (40-80 µ L) 1.3 단계에서 각 유리병에 질산염을 추가 합니다. 제정 바이오 센서 치료 공백에 대해이 단계를 제외 합니다.
    5. 단계 2.1 또는 2.2에서에서 추가 Hg (5 nM 변수에 대 한 테스트를 할 때) 또는 Cd (300 nM 변수에 대 한 테스트) 접시 레이아웃에 따라 튜브를. 머큐리 유도할 수 있는 바이오 센서 치료 공백에 대해이 단계를 제외 합니다.
      1. Hg를 사용 하면 4-8 µ M 재고 하 고 잘 흔들어. 100-250 nM 작업 Hg 솔루션을 만들기 위해 7 mL PTFE 유리병에 노출 매체 에 솔루션을 희석. 이 작업 솔루션에서 필요한 튜브를 Hg를 추가 합니다. 이 경우에 0에서 12.5 까지의 Hg의 보정 곡선 nM.
        참고: Hg 또는 Cd bioavailability에 변수의 영향에 대 한 테스트, 확인 [Hg] 또는 [Cd] 일정 하 게 유지 모든 치료에서. Hg 또는 Cd에 추가할 때 한 피 펫 팁을 사용 하지만 결코 튜브에 노출 매체를 터치 해야 합니다.
  2. 흔들어 궤도 동의에서 수동으로.
    참고: 실험 수 있습니다 수 일시 중지 지금 Hg 또는 Cd에 솔루션에 speciate 필요한 시간에 따라. 한 시간 이상에 대 한 왼쪽, 증발/오염을 방지 하기 위해 PTFE 튜브에 PTFE 모자를 장소.
  3. 부드럽게 플라스틱 바이오 센서 재고 와 동질성을 확인. 각 유리병에 바이오 센서 재고 100 µ L를 추가 합니다. 수동으로 orbitally 흔들.
  4. 다음 기준으로 읽을 워밍업 플레이트 리더 준비: 37˚C, 키네틱 읽기 궤도 동요와 함께 2.5-5 분 마다 10 시간 사이 읽기에 대 한 실행에 로 형광 측정 온도 형광 여기 440의 nm 및 500의 방출 nm.
  5. 4 x 8 표에 각 PTFE 튜브에서 200 µ L 96 잘 접시의 해당 우물에 플라스틱 (블랙, 96-잘 클리어-하단 양측이 표면 Microplates). 각 200 µ L을 전송 하기 전에 뒤로 앞 5 번 플라스틱.
    참고: 피 펫 팁, 삭제 하는 대신 pipetting 진행 상황을 추적할 PTFE 유리병에 피 펫 팁을 둡니다.
  6. 플레이트 리더의 트레이 96 잘 접시를 넣습니다 다음 뚜껑 96 잘 접시에 놓고 분석 결과 시작 합니다.

5. 측정 데이터

  1. 각 시간 지점에서 각각의 치료 의 형광 각 개별 잘 잡음에 대 한 수정 되어야 하며 연결 하는 치료 빈.
    1. 각 치료 (T)의 각 시간 지점 (t)에 대 한 형광 포인트의 각, 다음 3 치료 전체 평균 복제 (r1-r3 처음의 초기 형광 (t0)에 대 한 계정에 변환 해야 합니다. ). 이 치료 평균 평균 빈 치료 (결핵) 같은 방식으로 (공식 1) 번역 다음 숨겨집니다 해야 합니다.

형광 (t) = 평균(Tr 1(t) - Tr 1(t0), Tr 2(t) - T r 2 (t0), Tr 3(t) -( Tr 3t0))- 평균(TB r1 (t) - t Br 1(t0), TBr2(t)- TBr2( t0 ), T Br 3(t) - TBr3(t0)) (1)

참고:이 여야 한다 스프레드시트 기능으로. 오류 적절 한 전파 각 시간 지점에도 계산 한다.

  1. 그래프 시간의 기능으로 각각의 치료 의 수정 된 형광

figure-protocol-2
그림 2: 시간의 기능으로 형광 데이터 수정. 형광 측정 단위로 상대 형광 (RFU) 대장균 NEB5α에 의해 방출 된 HgII 의 추가 함께 시간이 지남에 pUC57merR 페이지 (유도할 수 있는 변형)을 품고 (0-12.5 nM) 혐 기성 조건 하에서. 형광 기술 3의 평균 37 ˚C에서 복제 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

참고: 값이 없는 0 nM Hg 그래프, 그리고 다른 모든 Hg 농도 0 연결 되어 있다 nM 빈 치료로 Hg. 따라서, 0 nM Hg 나타내는 x 축과 어떤 긍정적인 형광 형광을 Hg 주어진 모든 변수에서에서 나타냅니다. 그것은 하지 빈 이와, 형광을 선택 하지만 테스트 변수가 배경 형광 형광 곡선 오해의 소지가 형광 곡선 줄 것 이다 (즉, 유기 물질을 용 해 자체 형광 것 이며 만약 아무 그냥 셀 및 용 존된 유기 물, 용 존된 유기 물 농도 증가 포함 된 빈 치료 증가 형광 신호).

  1. 형광 피크를 계량. 같지는 형광 피크 일반적으로 터미널 전자 수락자로 모든 200 µ M 질 산의 소비에서 소비 하는 에너지를 나타내는 2.5-4 시간 후에 발생 합니다. 이 피크 계량 해야 하 고 그 구체적인 치료의 최종 형광 값을 나타냅니다.
    참고: 이벤트에 아무 형광 피크는 관찰 (즉, 아무 Hg bioavailability), 컨트롤의 형광 피크 시간 시점에서 치료 의 형광 (즉, 아무 추가 변수 또는 5nM Hg) 계량 한다. 또는, 치료, 형광 유도 하지만 형광 잘 정의 된 피크를 생산 하지 않는, O2 와 같은 높은 선호도 전자 수락자의 가능성이 오염 이며의 흔적을 제거 하려면 조치를 취해야 한다 모든 솔루션 및 실험에서 산소는 다시 수행 해야 합니다.

결과

형광 봉우리 단계 5.3에 따라 계량 되어 있다, 일단 그 변수 Hg 또는 Cd의 상대 생체 이용률에 미치는 영향을 보여주는 변수 농도 따라 형광 봉우리의 결과 그래프로 수 있습니다. 예를 들어 그림 2 에서 [HgII] 이상 형광의 보정 곡선은 그림 3A에서 제시 하는 유도할 수 있는 데이터를 얻을 것입니다. HgII 에 대 한 보정, 커브는 항상 Hg를 유도할 수 있는 스트레인;에 대 한 3 요소를 포함 약의 임계값 응답 형광 신호 생산 하기 전에 1-2 nM HgII 는 선형 비례 [HgII], 하 선형 범위 어디 5 nM Hg2 항상 안정적으로 그 범위와 고원의 중심에 있을 것입니다 어디 [HgII] 증가 하는 것은 더 이상 형광 신호를 증가 합니다. 제정 스트레인에 신호 생산에서 변화 [HgII]에서 독성 신호 생산에는 영향을 미치지 않습니다 보여줍니다. 그림 3B에서II Cd, 거기는 항상 유도할 수 있는 스트레인; 2 구성 요소 선형 범위 200-300 nM CdII 의 선형 범위와 고원 중앙에 안정적으로 항상 있을 것입니다. 형광 신호 [CdII] 증가 함께 감소가 보여줍니다 높은 Cd 농도 세포에 독성 1000 nM CdII에 고원 후 유도할 수 있는 형광 생산에 있는 감소를 설명할 수 있다. 따라서, 환경 변수 관련 Hg 또는 Cd bioavailability를 테스트할 때는 우리 것이 좋습니다 사용 하 여 5 Hg에 대 한 nMII 및 300 nM cdII.

어떤 경우에, 신호 생산 제대로 기 인할 수 있다 Hg 또는 Cd bioavailability를 하지만 다른 경우에, 신호 생산 바이오 센서 셀 호스트의 생리 적 상태에 있는 변화에 의해 영향을 받을 수 (예: 관심의 금속 또는 환경 테스트 조건은 독성)입니다. 그림 4A, 5 nM Hg bioavailability Zn의 그라디언트를 통해 테스트 되었습니다 (0-10 µ M). Hg를 유도할 수 있는와 제정 긴장, Zn 농도 증가 함께 신호에서 유사한 감소가입니다. 따라서, 하나의 신호 낮춘된 bioavailability에서 결과 또는 Zn 독성의 결과 이다 차별 수 없습니다. 그림 4B 및 4c, 5nM Hg bioavailability Mg의 그라디언트를 통해 테스트II (0-10 m m) 및 미네소타II (0-10 µ M). Mg 증가II 와 MnII 농도 감소를 유도할 수 있는 긴장의 형광 신호. 다른 한편으로, 제정 스트레인 형광 Mg 증가 함께 감소 보여주지 않았다II 와 MnII 농도 (MgII 와 MnII 는 셀 FbFp의 생산에 대 한 유익한 여 형광 신호에 증가)입니다. 이 세포가 가능한 Hg를 유도할 수 있는 긴장의 형광 감소 Hg bioavailability 감소에서 결과 보여 줍니다. 이 데이터 얼마나 중요 한지 그것은 또한 전체 셀 휘트니스의 구성 적인 측정을 제공 하기 위해 모든 바이오 센서 분석 실험에 대 한 강조.

figure-results-1
그림 3: 수은과 카드뮴 바이오 센서의 선형 범위. 최대 형광 측정 상대 형광 단위 (RFU) ± 1 표준 편차 대장균 NEB5α 방출 pUC57merR 페이지 (Hg를 유도할 수 있는)와 pUC19Balch-Pp (Constitutive)의 추가 함께 품고 A) HgII (0-15 nM) 그리고 B) CdII (0-1000 nM) 혐 기성 조건 하에서. 형광 기술 3의 평균 37 ˚C에서 복제 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2
그림 4: 아연 결정적이 아니는 결과 마그네슘과 망간 결정적인 결과의 예. 최대 형광 측정 상대 형광 단위 (RFU) ± 1 표준 편차 대장균 NEB5α 방출 pUC57merR 페이지 (Hg를 유도할 수 있는)와 pUC19Balch-Pp (Constitutive)의 추가 함께 품고 A) ZnII (0-10 µ M), B) MgII (0-10 m m), 및 C) 미네소타II (0-10 µ M) 혐 기성 조건 하에서. [HgII]을 5로 설정 된 모든 및 형광에 대 한 nM 37 ˚C에서 3 기술 복제의 평균 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

미생물 바이오 센서는 금속 미생물와 상호 작용 하는 메커니즘을 식별 하기 위해 유용한 도구입니다. 여기, 우리 anaerobically Hg를 계량 수 있습니다 방법을 설명II 및 CdII bioavailability 그람 음성 호스트 셀 (대장균) 하 게 같지는 결과 몇 시간. 이 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 강력한 바인딩 ligands 또는 금속 강수량으로 이어질 수 있습니다 구성 요소를 피 함으로써 금속 종 형성의 한 광범위 한 제어 노출 매체에 수는입니다. 그러나 금속 종 형성 모델 되었고 PHREEQC17를 사용 하 여이 노출 매체에 테스트 다른 금속 종 형성 소프트웨어를 배포할 수 있습니다. 아니 추가 ligands, Hg speciation 97% Hg(OH)2 와 3 %Hg (NH3)22 +, 있을 것으로 예상 된다 경우 Cd speciation 됩니다 59 %Cd-β-Glycerophosphate, 25 %Cd2 +및 16% CdSO4로 제시. 단순한 열역학적 모델링 소프트웨어를 사용 하 여 사용자 수 노출 미디어 디자인과 관심의 금속의 생체 이용률에 대 한 테스트. 또한, 바이오 센서 호스트 셀 (대장균 NEB5α) 끝났습니다 가능한 다양 한 pH (5-8.5)와 NaCl 농도 (0-0.55 M)17.

Hg 메 틸은 혐 기성 과정, 그리고이 연구에 제시 된 프로토콜 산소, 금속 bioavailability에 혐 기성 물질 대사의 더 정확한 설명에 대 한 허용에 대 한 요구 사항이 적용 되지 않습니다. 이것은 중요 하기 때문에 산소의 존재 유전자 식 프로필48,49 를 따라서, 잠재적인 전송 경로; 따라서이 메서드는 현재 exising 에어로빅 대안 이점을 선물 한다. 여기에 제시 된 바이오 센 싱 구조 수은 메 틸 화 (예를 들어, Geobacter, Desulfovibrio), 하지만 아마도 더 많은 관련이 있을 수 있습니다 다른 혐 기성 호스트와 함께 사용 될 대장균보다 적게 온순한. 여기에 제시 된 접근의 한 현재 한계는 탐지의 우리의 한계는 하지 아직 수준에 도달 오후, 기존의 에어로빅 시스템4,,1937반대입니다. 그러나 그것은이 낮은 검출 한계를 달성 하는 중요 한 몇 가지 단계를 수행 해야44: 나) 리간드 추가 Hg 솔루션에 남아 (Hg 돌이킬 수 없는 바인딩 될 것입니다 미생물 세포 벽에 흡착 되지 않습니다 있도록 필요 세포 표면 thiols의 bioavailability25,27; 방지를 그림 3A에서 Hg에 대 한 임계값 응답 참조) ii) 셀 밀도, 또는 iii에 대 한 수정) 메 르의 수송 단백질을 포함 하도록 유전자 구조를 수정-오 페론 (즉 merT 와 merP), 증가 Hg 플럭스 셀50,51내부. 이러한 수정, Hg의 낮은 농도 검출에 유용 하지만 반드시 이상적인 환경 관련 상황을 평가할 때 것. 반면 이전 카드뮴 바이오 센서는 주로 원리의 "증거"로 존재, 그들은 speciation bioavailability41,42, 의 역할을 평가 하기 위해 조사를 허용 하지 않는 복잡 한 미디어에서 설계 되었다 43 , 44.

바이오 센서는 금속 종은 bioavailable 메커니즘을 결정 한 매우 유용한 도구입니다. 때문에 호스트 유기 체 Hg methylator 아니다는 어떻게 Hg 입력할 수 있습니다 그램 음성 박테리아와 확실 한 근거 하지 Hg methylators Hg를 취득 하는 방법에 대 한 모델을 개발 하는 것만 사용할 수 있습니다. 다른 방법 존재 이해의 결과 또는는 질량 균형 접근10,15,20,,4546의 사용으로 메 틸 화, 같은 Hg bioavailability를 결정 합니다. 그 말했다 하 고, 여기에 제시 하는 방법 가능한 셀에 준 실시간으로 bioavailability 데이터의 이점을 제공 합니다. 우리는 환경 매트릭스에서 총 Hg 또는 Cd 수준의 척도를이 메서드를 사용 권장 하지 않습니다. 36환경 금속 농도 결정 하기 위해 바이오 센서의 제안 된 사용에도 불구 하 고 많은 더 쉽게 사용할 수 있는 표준 방법을 ICP-MS, FAAS (Cd 분석)에 대 한 등 냉 증기 원자 흡수 분광학 (Hg에 대 한 사용할 수 있습니다. 분석)입니다. 그러나 바이오 센서는 수 있는 주어진된 환경 매트릭스에 강화 하거나 bioavailability; 방해 가능성이 있는지 확인 하는 데 사용 이것은 표준 추가 수행 하 여 달성.

노출 매체의 pH 변경 될 수 있습니다를 어디서 나 5와 8.5의 범위 내에서 적절 한 pKa와 버퍼의 대체 무료 산 MOPS 자유로운 산 (버퍼) 교환 제공 (목록을 참조 하십시오 적절 한 버퍼 (페 레이 외. (2015) 47) 노출 매체를 만들 때 적절 한 pH에 코와 함께 조정. 또한, 메서드 Hg, Cd에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 전사 레 귤 레이 터를 사용 하 여 다른 금속을 확장할 수 있습니다.

Hg 또는 Cd bioavailability에 O2 와 포 등 다른 전자 수락자의 영향을 탐구 하는 노출 분석 결과 수정할 수 있습니다. 전자 수락자로 O2 와 포를 활용 하는 방법에 대 한 사소한 수정 요청 시 사용할 수 있습니다.

요약 우리가 다음 포인트를 강조 하 고 싶습니다: 나) 는 바이오 센서를 보정 하는 데 사용할 것입니다 이러한 Cd 또는 Hg 주식의 농도 2 단계에서 알려져 있습니다 필수적입니다. II) 노출 하루에 셀의 성장 0.6 (± 0.1)의 OD600 에서 중지 해야 합니다 하 고 그는 주의이 셀 밀도 보정은 셀 문화는 바이오 센서로 서 resuspending 때. III) 마지막으로, 그것은 중요 한 노출 매체 노출 날에 꼼꼼하게 만든. 프로토콜의 성공을 위해 동시에 (우회 하 성장 실패의 가능성) 여러 문화를 성장 하 고 성장 매체 (미디어 및 가능한 오염 metastability 우회)를 매주 만들어 해야 합니다. 또한 생물 복제 (여러 셀 문화)에 가변성 표현 신호 생산에 관해서 주목 한다. 형광 응답 문화에서 문화에 다를 수 있습니다, 비록 주어진 변수에 응답 형광 동향 수많은 생물 복제에 걸쳐 동일한 있어야 합니다.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 혐 기성 바이오 센서의 개발에 통찰력이 토론 Poulain 실험실의 잘 멤버로 두 익명 검토자의 의견을 감사 하 고 싶습니다. 온타리오 주 및 검색 부여에서 초기 연구원 수상 및 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다에서 A.J.P.는 가속기 보충이이 연구 자금.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
7ml 표준 바이알, 둥근 내부Delta Scientific200-007-2034
권장 바이알 트레이, 21mm 개구부Delta Scientific730-20014 for (4 x 8 grid)
24 mm 클로저Delta Scientific600-024-0132 권장
뚜껑 코너 노치 BLK STR CS/50CorningCorning 3931
코닝 96- 우물 투명 바닥 비 바인딩 표면 마이크로 플레이트코닝코닝 3651
혐기성 챔버 (글로브 박스)혐기성 챔버의 공기는 (97 % N2 < / sub>± 2 % 및 3 % H 2 < / sub> ± 2 %)
팔라듐 촉매이어야합니다.혐기성 챔버에서 O2 를 H2O로 변환합니다. 필수는 아니지만 권장됩니다.
마이크로플레이트 리더
450 (± 10) 마이크로플레이트 리더
(± 10) 마이크로플레이트 리더
혐기성 배양 바이알(발치 튜브) + 고무 마개
분광 광도계혐기성 배양 튜브용으로 수정
MA-3000(수은 분석기),
pH 프로브, 모든 pH 프로브는
50mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리 튜브
0.22 & 마이크로; m 폴리 에테르 설폰 주사기 필터 + 주사기
멸균 / 세척 유리 병성장 배지 및 표준
멸균 / 세척 플라스틱 또는 PTFE 병알칼리 용액 (NaOH / KOH)
용 시약 분말 : Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, 암피실린 나트륨 염, Difco M9 최소 염, 포도당, MgSO4, 티아민 HCl, NaNO3, l-류신, l-이소류신 발린, EDTA 나트륨 염, FeSO4, 나트륨 베타 - 길세로 인산염, 걸레 유리 산, (NH4) 2SO4, Hg (NO3) 2, CdCl2
멸균 Milli-Q 물오토 클레이브 또는 필터 멸균은 괜찮습니다.
용원 육수
분석 등급 H2SO4
(500)용 nM 필터용 nM 필터: : 됨, 로 작동합니다.

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