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방법 논문

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석

11.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58339

⸱

2018년 10월 22일

 ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

이 논문에서

요약

이미징 기반 메서드를 설명 하는 S 단계를 식별 하 고 사용 하는 티 미 딘 C. 선 충 자웅 동체 생식 세포 주기 역학을 분석 하는 데 사용할 수 있는 아날로그 듀. 이 메서드와 필요 없는 transgenes immunofluorescent 얼룩과 호환 됩니다.

초록

진핵생물의 세포 주기 분석 염색체 형태, 식 및 세포 주기의 다양 한 단계 또는 nucleoside 아날로그의 설립에 필요한 유전자 제품의 지역화에 자주 활용 합니다. S 단계, DNA polymerases 분석에 대 한 셀을 표시 하는 염색체 DNA에 듀 등 BrdU 티 미 딘 아날로그를 통합 합니다. C. 선 충는 nucleoside 아날로그 듀 일반 문화 중 벌레는 먹이 및 immunofluorescent 기술을와 호환 됩니다. C. 선 충 의 생식은 신호 경로, 줄기 세포, 감수 분열, 세포 주기 때문에 투명 하 고, 유전으로 손쉬운 meiotic 의향 및 세포 분화/gametogenesis 발생의 연구에 대 한 강력한 모델 시스템을 선형 어셈블리 같은 패션. 이러한 기능에 듀 mitotically 자전거 세포 및 생식 개발의 동적 측면을 연구 하는 훌륭한 도구를 확인 합니다. 이 프로토콜 성공적으로 듀 박테리아를 준비, 야생-타입에 피드 하는 방법에 설명 합니다 선 충 C. 광고에 나온 것, 자웅 동체 생식 해 부, DNA에 듀 설립 얼룩 얼룩 다양 한 세포 주기를 검출 하기 위하여 항 체와 고 발달 마커, 생식을 이미지 하 고 결과 분석. 프로토콜은 메서드 및 S 단계 인덱스, M-인덱스, g 2 기간, 세포 주기 기간, meiotic 항목의 위상과 meiotic 의향 진행의 속도의 측정에 대 한 분석에 있는 변이 설명합니다. 이 방법은 세포 주기 또는 다른 조직, 단계, 유전적 배경, 생리 적 조건에 셀 역사 연구에 적응 될 수 있다.

서론

동물 개발에 수백, 수천, 수백만, 수십억, 또는 심지어 수조 세포 분열의 성인 유기 체를 형성 하기 위하여 필요 합니다. 세포 주기 G1 세포 이벤트 집합 구성 (gap), S (합성), G2 (gap), M (유사 분열) 정의 일련의 이벤트 실행 각 세포 분열. 세포 주기는 역동적이 고 실시간으로 기술적으로 어려울 수 있는 최고의 평가입니다. 이 프로토콜에 기술 단계 측정 및 스틸 이미지에서 세포 주기의 타이밍을 만드는 수 있습니다.

꼬마 선 충 (C. 선 충) 성인에서 세포 주기 역학의 연구에 S 단계를 식별 하는 금 본 위 제는 nucleoside 아날로그 deoxyuridine (듀)-5-ethynyl-2' 등 deoxyuridine (BrdU)-5-브로 모-2'로 자웅 동체 생식1,2,3,,45. 로 그들은 어떤 유전자 구조에 의존 하지 않는 거의 모든 유전적 배경에 듀와 BrdU 사용할 수 있습니다. BrdU 시각화 안티 BrdU 항 체 얼룩이 지기은 종종 다른 세포 마커 추가 항 체와 공동 얼룩에 의해 시각의 평가와 호환에 대 한 항 원 노출에 가혹한 화학 치료를 필요 합니다. 대조적으로, 듀 시각화 클릭 화학 가벼운 조건에 의해 발생 하 고 따라서 공동6,7을 얼룩이 지는 항 체와 호환 됩니다.

라벨의 특이성은 분명, 이후 핵만 포함 티 미 딘 (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 유사 체 DNA로 S 단계. 시각화는 고정된 조직에서 일어난다. 듀 라벨 보이지 않으면 저절로 아 지 드를 포함 하는 염료까지 또는 fluorophore 클릭 구리 촉매 화학8듀에 alkyne covalently 반응. 듀 라벨에 핵은 S-위상, 라벨의 짧은 펄스를 사용 하 여 즉각적인 정보를 제공할 수 있습니다. 듀도 정보를 제공할 수 동적, 펄스-체이스 또는 연속 라벨;를 사용 하 여 예를 들어 펄스-체이스 실험 레이블이 각 세포 분열에서 희석 또는 개발을 통해 서 nondividing 세포 진행을 전파.

C. 선 충 자웅 동체 생식 통로, 줄기 세포, 감수 분열, 세포 주기 신호의 연구에 대 한 강력한 모델 시스템입니다. 성인 생식 줄기 세포 항목 및 meiotic 의향, 더 proximally gametogenesis 단계 조정 (그림 1)를 통해 진행 하는 원심 끝에 편광된 조립 라인입니다. 근 위 끝에 oocytes 성숙, ovulated는 수정 고 자 궁9,,1011에 embryogenesis 시작. Meiotic 의향에 mitotically 자전거 생식 줄기, 뿌리 세포와 meiotic S 단계 세포 하지만 되지 셀을 포함 하는 원심 끝 셀 근처 ~ 20 셀-직경 긴 지역 이라고 조상 영역2,4 , 9 , 12. 세포 막 원심 생식에서 핵 사이 불완전 한 분리를 제공 하지만 조상 영역 셀 mitotic 세포 주로 독립적으로 자전거를 받 다. 젊은 성인 광고에 나온 것에 생식 조상 영역 셀의 메디아 mitotic 세포 주기 기간은 ~6.5 h; G 1 단계는 간단한 결 석, 또는 정지1,,213관찰 하지는. 생식 줄기 세포 분화 본질적으로 직접 차별화를 통해 발생 하 고 따라서 부족 교통 증폭 사단4. Pachytene 단계에서 차별화, 동안 약 4 5 점 만점 핵 oocytes를 형성 하지 않습니다 하지만 대신 apoptosis, 세포질 내용을 개발 oocyte12,14 에 기부 하 여 간호사 셀 역할을 받 다 , 15.

Nucleoside 아날로그와 S 단계에서 레이블 셀, 뿐만 아니라 하나의 유사 분열, 감수 분열이 항 체는 얼룩이 지를 사용 하 여 셀을 식별할 수 있습니다. 유사 분열에서 핵은 안티-인-히스톤 H3를 immunoreactive (Ser10) 항 체 (pH3 라고)7,16. 감수 분열에서 핵은 안티-그-3 항 체 (meiotic 염색체 축 단백질)17에 immunoreactive. 조상 영역에서 핵 그-3, nucleoplasmic REC-818의 존재 나 WAPL-119의 존재에 의해 확인할 수 있습니다. WAPL-1 강도 이며 조상 영역에서 높은 체세포 생식에 높은 낮은 초기 meiotic prophases19동안. 여러 가지 세포 주기 측정 프로토콜에 몇 가지 변형 가능 하다: 나) S 단계에서 핵을 식별 하 고 측정 하는 S 단계 인덱스; II) M 단계에서 핵을 식별 하 고 측정 M 단계 인덱스; III) 핵 mitotic 또는 meiotic S 단계;에 있던 여부를 결정합니다 4) g 2;의 기간을 측정 V) 측정 g 2 + M + G1 단계; duartion VI) meiotic 항목;의 속도 측정 VII) meiotic 진행의 속도 추정 합니다.

하나는 몇 가지 유형의 젖은 실험실 실험에서 여러 세포 주기 측정을 만들 수 있습니다. 프로토콜 아래 듀 박테리아와 공동 레이블 M 단계 셀 이라고 표시 된 안티-pH3 항 체와 조상 영역 셀 안티-WAPL-1 항 체와 얼룩에 의해 얼룩이와 선 충 C. 성인 광고에 나온 것을 먹이로 라벨 30 분 펄스에 설명 합니다. 듀 피드 (2.5 단계), 항 체의 종류 기간에 유일한 변화 고용 (5 단계), 그리고 분석 (단계 8.3) 추가 측정을 위해 필요 합니다.

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프로토콜

1입니다. 듀 라는 박테리아의 준비

  1. MG1693의 시 동기 문화를 성장. 대장균 (대장균) MG1693 thyA에 돌연변이 수행합니다.
    1. 조는 120mm lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배양 접시에 냉동된 글리세롤 재고에서 흔 대장균 MG1693 개 37 ° C 하룻밤에 문화입니다.
    2. 두 개의 개별 대장균 에서 접종 2로 MG1693 식민지 중복 ~ 16 h에 대 한 37 ° C에 액체 파운드 문화의 4 mL 튜브.
      참고: MG1693 파운드에 좋은 티 미 딘 thymine와 보충 없이 성장 합니다.
  2. 대장균 MG1693 듀 보충 최소 매체에 성장.
    1. 500 mL 원뿔 플라스 크 압력솥입니다.
    2. 무 균 기술을 사용 하 여 추가 20% 포도 당의 5 mL, 10 mg/mL의 티 아민, 티 미 딘 5 m m의 120 μ, 1 M MgSO4, 10 mM 듀, M9 버퍼의 100 mL 및 문화의 갓 재배 하룻밤 MG1693 4 mL 200 μ의 100 μ의 50 μ.
      참고: 듀의 최종 농도 20 μ M이 문화1,7. 이 농도 문화20에 포유류 세포에 직접 적용 하는 경우 DNA 손상 및 세포 주기 검거에 지도 한다. 그러나,이 듀의 일부 분 일 뿐인 따라서 C. 선 충수와 대장균 에 통합 됩니다. 젊은 성인 광고에 나온 것의 듀 치료 후 세포 주기 검거의 증거와 조상 영역 또는 M-단계 인덱스의 크기에서 변화입니다.
    3. 하룻밤 사이, 하지만 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 24 시간 보다 더 이상 문화.
  3. 듀 라는 대장균 을 집중 하 고 M9 한 천 배양 접시에 적용.
    1. 4 ° c 탁상 원심 분리기를 미리 냉각
    2. 메 마른 기술을 사용 하 여 2-4 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 문화를 전송.
    3. 듀 라는 대장균작은 30 분 4 ° C에서 3000 x g 에서 문화 원심
      참고: 로컬 및 기관 지침에 따라 상쾌한 듀를 포함 하는 삭제 합니다.
    4. 신선한 M9 4 mL와 펠 릿 resuspend 사용 하 여 살 균 1 mL 피펫으로 팁 또는 살 균 5 mL 혈 청 학적인 피펫으로. Resuspending 알 약 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
    5. 동일한 피펫으로 적용 및 확산 resuspended 듀 표시 된 대장균 의 ~ 8 방울을 사용 하 여 실내 온도 60 mm M9 한 천 배양 접시의 센터 MG1693. 하나의 일괄 처리 ~ 16 요리를 생성합니다.
    6. 몇 시간 동안 건조 또는 실 온에서 하룻밤 후 인감 실험실 필름 스트립 각 접시 요리를 하실 수 있습니다. 와 ~ 2 개월에 4 ° C에서 15 ° C ~ 2 주 동안에 요리를 저장할 수 있습니다. 듀 요리의 동일한 일괄 처리를 사용 하 여 실험의 각 세트에 대 한.

2. C. 선 충 에 듀 먹이

  1. 콜레스테롤, S 매체에 해칭 또는21의 적절 한 단계 선택 하 여 다음 초과 달걀 누워, 알칼리 성 차 아 염소 산 처리에 의해 인구를 동기화 합니다. 원하는 단계 (여기, 24 h 포스트-L4) 20 ° c.에 대장균 OP50와 시드 선 충 류 성장 매체에 동물 성장
    참고: 준비 실험 당 50-100 동물 일부, 해 부 하지 않을 수 있습니다 그리고 다른 사람 세척 하 고 전송 과정에서 손실 됩니다.
  2. 20 ° C (또는 실험에 필요한 온도) 따뜻한 듀 요리를 하실 수 있습니다.
  3. 1.5 mL 튜브에 M9 또는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 사용 하 여 NGM 요리에서 동물을 씻어. 중력 또는 간단한 스핀은 microcentrifuge에 의해 짧게 정착을 동물 허용.
  4. 상쾌한을 제거 하 고 세척 시간 1-2와 M9 또는 PBS의 ~ 1 mL 동물. 제거는 상쾌한.
  5. 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 전송 듀 잔디밭의 센터에 M9 또는 PBS의 작은 방울에 동물. 액체를 흡수, 그때 (역사 S 위상의 측정)를 20 ° C (직접 S 위상 측정)에 대 일 분 이상에서 품 어에 대 일 분, 필요에 따라.
    참고: 듀 신호는1수 유 듀의 15 분 만큼 적게 후 생식 핵에서 감지.
  6. 요리를 해 부하는 유리에 M9 또는 PBS의 ~ 2 mL와 듀 접시에 벌레 씻어.

3. 해 부 및 선 충 C. 생식의 고정

주: 해 부, 고정, 및 C. 선 충 자웅 동체 생식의 얼룩이 지는 항 체에 대 한이 프로토콜 사용 하는 제외 하 고는 속도 1 mL 유리 튜브를 centrifuged 수 (2016)22, 댁과 Arur에 의해 출판 세척 단계 및 그려진 아웃 유리 파스퇴르 피 펫 1 mL 유리 튜브에서 액체를 효과적으로 제거를 사용할 수 있습니다.

  1. 워시와 C. 선 충 germlines 해 부.
    1. 해 접시, 센터에서 동물을 수집 하는 소용돌이의 바닥에 침전 하는 동물을 허용 하 고 긴 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 PBS를 제거. 1-2 시간 ~ 2 mL PBS로 세척.
    2. PBS의 2 mL와 4 μ 동물 무력화를 100 mM levamisole의 추가 합니다. 접시를 접시의 중앙에 동물을 수집를 다시 소용돌이 친다.
      참고: 동원 정지 사이 몇 초, 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 완전 한 동원 정지 성공 해 부에 대 한 필요 하지 않습니다. 어떤 사람들은 더 나은 성공을 때 동물을 움직일 불완전 해 부.
    3. (약 2 인 두 전구) 사이 절단 하 여 25G 5/8"바늘의 한 쌍으로 동물을 해 부 또는 꼬리. 알아서 하지는 생식의 루프를 잘라. 장과 생식 "밖으로" 내부 압력, 신체 구멍의 팝업 해야 하지만 연결 된 남아 있다. 이 프로토콜은 이전에 게시 댁 및 Arur 비슷합니다 (2016)22.
      참고:-~ 5 분 해 부 시간 유지, 확실히 더 이상 15 분 이상 해 부 시간 항 체 얼룩 신호 (Sudhir 월, 개인 통신)의 손실이 발생할 수 없습니다 하 고 PBS에 기아 동물의 생리학에 영향을 미칠 수 없습니다. 신속 하 고 정확 하 게 해 부를 학습 하는 것은 연습이 걸릴 수 있습니다.
    4. 필요한 경우, 소용돌이, 센터에서 해 부 동물을 수집 하 고 긴 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 가능한 많은 PBS를 제거.
  2. 수정 하 고 조직을 탈수합니다
    1. PBS 솔루션에서 3 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL를 추가 합니다. 실험 영화와 저장소 또는 10 분 서랍 벤치에 느슨하게 접시 커버.
      참고: 해 동 37 ° C에서 PFA 솔루션 목욕 물 및 다음 germlines를 해 부 하기 전에 실내 온도에 냉각.
      주의: PFA 솔루션은 알맞게 독성 발암 가능성이 있고 기형 발생 물질. Paraformaldehyde 솔루션에서 방출 증기는 가연성. 니트 릴 장갑 착용. 화학 증기 두건에서 3%에서 16 %PFA 희석. 증기 두건 밖에 서 작업 하는 경우 모든 컨테이너 덮여 유지.
    2. 깨끗 한 5 mL 유리 원심 분리기 튜브에는 생식 기를 신중 하 게 전송.
    3. PBSTw ~ 3 mL를 추가 (0.1 %PBS 트윈-20) 나머지 생식 선 검색 고 PFA 솔루션을 희석 하는 생식 기를 포함 하는 접시.
    4. ~ 1 분 젊은 대 870 x g 에서 임상 분리기에 아래로 회전 또는 작은 동물 이전 또는 큰 동물 보다 더 긴 회전 시간을 필요합니다.
    5. 긴 유리 피 펫을 사용 하 여, 화학 후드에 원치 않는 소재 병에서 최종 폐기에 대 한 원치 않는 소재 비 커는 상쾌한 전송.
    6. -20 ° c.에 미리 냉장 고급 메탄올의 2 개 mL를 추가 원심 분리기 튜브 실험실 영화와 긴밀 하 게 커버.
      참고: 신선한 고급 "골드 라벨" 메탄올의 사용은 특정 항 체와 적절 한 형태에 대 한 필수적입니다.
      주의: 메탄올 가연성 액체 이며 독성 증기, 삼 킨 경우, 흡입 또는 피부에 연결할 수 있습니다. 장갑 및 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 냉장고가 작은 볼륨에 대 한 적절 한 사용 합니다.
    7. -20 ° C 1 시간, 심지어 하룻밤 냉장고에서 저장소 또는 심지어 몇 개월.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

4. rehydrate Germlines

  1. 메탄올을 희석 하는 생식 기를 rehydrate PBSTw로 가기로 유리 원심 분리기 튜브를 채우십시오. ~ 1 분 동안 870 x g 에서 임상 원심 분리기에 아래로 회전 합니다.
  2. Using 긴 유리 파스퇴르 피 펫, 화학 후드에 원치 않는 소재 병에서 최종 폐기에 대 한 원치 않는 소재 비 커는 상쾌한 전송.
  3. 3 번 ~ 5 mL ~ 1 분 동안 870 x g 에서 임상 원심 분리기에서 각 시간 아래로 회전 하는 PBSTw 사용 하 여 생식 기를 씻어. 제거는 상쾌한.
  4. 작은 1 mL 붕 규 산 유리 관 및 긴 유리 PBSTw와 파스퇴르 피펫으로 린스.
  5. PBSTw의 ~ 700 μ를 추가 하 고 긴 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 작은 튜브에는 생식 기를 전송. PBSTw의 몇 가지 추가 상품을 사용 하 여 모든 생식 선 전송 됩니다 확인.
  6. ~ 1 분 그려진 아웃 긴 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여에 대 한 870 x g 에서 임상 원심 분리기에 스핀 다운,는 생식 기를 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거. 더 이상 50 μ를 남겨 주세요.
    참고: 항 체 검출, 필요 하지 않은 경우 단계 6으로 건너뜁니다.

5. 항 체와 항 원 검출

  1. PBS에서 30% 세럼에 주 항 체 희석. 현재 예제에서는 안티-WAPL-1 항 체 희석된 1:2,000 이며 안티-pH3 항 체는 희석된 1: 500. 갓 해 동된 혈 청에는 미 립 자 제거 하 4 ° C에서 20000 x g microfuge에서 10 분 원심 4 ° C에 며칠 동안 저장 될 수 있는 상쾌한을 사용 합니다. 적절 한 혈 청을 사용 하 여 일치 하는 2 차 항 체 (혈 청 염소는 여기)의 호스트 유기 체. 단계를 차단 하는 선택적 기본 항 체의 추가 하기 전에 추가할 수 있습니다.
  2. 각 작은 유리 튜브에 희석된 주 항 체의 100 μ를 적용 됩니다. 4 h에 대 한 실 온에서 품 어.
    참고: 항 체에 의해 부 화 시간은 다릅니다. 일부 항 체에 대 한 실 온에서 2 h은 충분 합니다. 더 이상 외피 (예., 하룻밤) 가능 하지만 배경 증가 시킬 수 있습니다.
  3. PBSTw 위로 아래로 ~ 1 분 동안 870 x g 에서 임상 원심 분리기에서 회전 하는 튜브를 입력 합니다.
  4. 3 번 사용 하 여 PBSTw 품 ~ 1 mL 세척 당 ~ 5 분에 대 한 세척으로 확산 초과 1 차 항 체는 생식 기를 씻어. 그려진 아웃을 사용 하 여 긴 유리 파스퇴르 피 펫는 생식 기를 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거 합니다. 더 이상 50 μ를 남겨 주세요.
  5. PBS에서 30% 염소 혈 청에서 2 차 항 체 희석. 현재 예제에서는 염소-안티-토끼-594와 염소-안티-마우스-647는 각각 희석 1:400에서.
    참고: 보조 항 체 염료는 염료에 듀 키트에서 다는 것을 확인 하는 신중 하 게 선택 합니다. 현재 예제에 듀 키트 포함 488 nm 여기 염료.
  6. 각 작은 유리 튜브에 희석된 이차 항 체의 100 μ를 적용 됩니다. 실내 온도 2 h에 어둠 속에서 품 어.
    참고: 항 체에 의해 부 화 시간은 다릅니다. 일부 2 차 항 체에 대 한 실 온에서 1 h은 충분 합니다. 더 이상 외피 (예., 하룻밤) 가능 하지만 배경 증가 시킬 수 있습니다.
  7. 3 번 사용 하 여 PBSTw 품 ~ 1 mL 세척 당 ~ 5 분에 대 한 세척으로 확산 초과 이차 항 체는 생식 기를 씻어. 그려진 아웃을 사용 하 여 긴 유리 파스퇴르 피 펫는 생식 기를 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거 합니다. 더 이상 50 μ를 남겨 주세요.
    참고: 생식 선 저장할 수 있습니다 PBS의 100 μ에이 단계 이후에 필요한 경우, 비록이 신호를 줄일 수 있습니다. 진행 하기 전에 PBS를 제거 합니다.

6. 수행 감지 듀에 듀 클릭 반응

참고: 수행에 듀 (수행 전에 5 단계 6 단계) 단계를 얼룩이 지는 항 체 전에 클릭 반응 항 체 사용7에 따라 가능 하다. 그러나, 클릭 시 약 특정 항 원을 방해할 수 있습니다 (예., REC-8 항 체는 고정와 permeabilization). 여기에 제시 된 순서 대로 REC-8, 얼룩 밝은 항 체 생성 WAPL-1, 그 3, pH3, 깃발, 및 CYE-1 항 체 사용, 다른 사람의 사이에서.

  1. 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 다음을 추가 하 여 클릭 듀 칵테일8 신선한를 준비 합니다. 추가의 순서는 중요 하다. 빛에서 보호 하 고 유지 하는 얼음에 모든 시 약. 이 제조 법 생성 충분 한 샘플 (100 μ); 필요에 따라 제조 법을 곱하면 됩니다.
    1. 누적 버퍼를 초순의 2 개 mL를 추가 합니다. 이것은 버퍼 첨가제, 1 x 희석 해야 합니다 x 10을 즉시 사용 하기 전에 합니다.
    2. 초순의 76.5 μ에 10 x 버퍼의 8.5 μ를 추가 합니다. 잘 믹스.
    3. 100mm CuSO4 (부품 E로 분류 될 수 있습니다)의 4 μ를 추가 합니다. 잘 믹스.
    4. 488 nm 염료 아 지 드의 0.25 μ를 추가 합니다. 그것은 4 ° c.에서 고체의 용 매, 디 메 틸 sulfoxide로 실내 온도에, 해빙 해야 합니다. 잘 혼합 하 고 빛 으로부터 보호.
    5. 초순의 믹스 9 μ와 버퍼 튜브의 캡에 첨가제의 1 μ 피펫으로 나머지 칵테일에 추가 하 여 아래로 pipetting으로 잘 혼합 모자에서.
  2. 에 듀 클릭 반응을 수행 합니다.
    1. 작은 튜브에 생식 기를 클릭 듀 칵테일의 ~ 100 μ를 추가 합니다. 실험 영화와 함께 커버 하 고 실 온에서 30-60 분 동안 품 어.
    2. 한 번 씻어 반응 린스 버퍼의 100 μ.
    3. 4 번 사용 하 여 PBSTw 품 ~ 1 mL 당 세척 ~ 15 분 초과 듀 칵테일 구성 요소 세척으로 확산 하는 생식 기를 씻어. 그려진 아웃을 사용 하 여 긴 유리 파스퇴르 피 펫는 생식 기를 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거 합니다. 더 이상 50 μ를 남겨 주세요.

7. DNA 얼룩 및 슬라이드 준비

  1. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, DNA를 시각화 하는 데 사용)와 antifade 장착 매체의 1 방울 (~ 25 μ)는 생식 기를 추가 합니다. 정착 하는 생식 기 혼합 수 있습니다 몇 분 정도 기다립니다.
    참고: 또는, 1:1,000 희석 (0.1 mg/mL 재고)에서 PBS에 DAPI 적용할 수 있습니다 20 μ 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] 옥 탄 (DABCO) 90% 글리세롤, 또는 다른 antifade 장착 매체의 다음 5 분 동안.
  2. 큰 2.5 %agarose 패드 표준 유리 현미경 활 주에 준비 합니다.
  3. 새로운 깨끗 한 먼지-무료 사용 긴 유리 agarose 패드는 생식 선 전송 파스퇴르 피 펫. 모든 액체와 생식 기 생식 기의 손실을 최소화 하기 위해 피 펫의 좁은 바닥에서 계속.
    참고: 생식 선 작은 유리 튜브에 붙어 또는 긴 유리에 파스퇴르 피 펫 구출 될 수 있다"" PBSTw와 rinsing, 해 접시에 액체를 수집 하 고 속눈썹과 슬라이드에 개별 동물 따기 여.
  4. 속눈썹을 사용 (또는 얇은 머리의 루프) agarose 패드는 생식 기를 배포 하 고 먼지 입자를 제거 하는 이쑤시개에 붙어.
  5. 직사각형 유리 coverslip을 적용 됩니다. 공기 방울을 피하기 위해 한쪽에서 천천히 낮은. 티슈를 사용 하 여 자유롭게 이동에서 방지는 coverslip 초과 솔루션을 제거 하려면.
    참고: 사용 될 것 이다 현미경에 일치 하는 coverslips를 선택 합니다. # 1과 #1.5 coverslips 잘 작동합니다.
  6. 정착 하 고 실내 온도 또는 4 ° C에서 약간 하룻밤 건조 슬라이드를 허용 이 생식 기를 약간 평평 하 게 도움이 됩니다. 4 ° c.에 슬라이드를 저장 한다
  7. 선택 사항: 매니큐어, 또는 다른 슬라이드 마감재와 슬라이드의 가장자리를 밀봉 하십시오. 씰링 모서리를 먼저, 다음 측면, 이동에서 coverslip을 방지 합니다.

8. confocal 영상 및 분석

  1. 이미지 회전 디스크 공초점 형광 현미경 원심 생식 높은 에너지 광원, 계획 apochromatic 목표 및 고효율 현미경 카메라를 갖추고 있습니다. 1 μ m 또는 엄격한 간격 z 스택 이미지를 캡처하십시오. 모든 채널에 대 한 레이저 전원, 감도 및 노출 시간을 기록해 둡니다.
    1. 다음을 사용 하 여: 405 nm 레이저 라인 485 nm (W60) 방출 필터 DAPI에 대 한, 여기 488 nm 레이저 라인 여기 527 nm (W55) 방출 필터와 듀, WAPL-1, 615 nm (W70) 방출 필터와 640 nm 레이저 라인 excita 561 nm 레이저 라인 여기에 대 한 705 nm (W90) 방출 필터 pH3에 대 한 기.
      참고: 신호 강도와 배경 강도 달라 집니다. 마찬가지로, 필요한 노출 시간 달라 집니다 가능성을 10 배.
  2. 피지24,25 에서23 셀 카운터 플러그인 사용 하 여 수동으로 각 핵 계산. 존재와 부재 pH3, 듀와 WAPL-1의 각 개별 핵 레이블. 표 1 과 그림 2에서 설명 하는 핵의 클래스를 사용 하 여로이 모두 아래에 설명 된 계산을 촉진 한다.
    참고: 숙련 된 experimentalists 정확 하 게 믿을 수 3D 이미지에 있는 모든 핵 이중 계산 또는 어떤 핵을 누락 없이. 또는, 하나 모든 z-평면에서 모든 핵을 계산 수 있습니다 그리고 마크 셀 R 스크립트3 곱하기 계산 핵 제거를 사용할 수 있습니다.
  3. 세포 수와 세포 주기 측정 필요의 유형에 따라 위의 계산에서 주파수를 계산 합니다. 핵의 종류는 표 1과 그림 2에 정의 됩니다. 계산 표 2에 요약 되어 있습니다.
    1. (변화 나) S 단계에서 핵을 식별 하려면 30 분 듀 동물 먹이. 어떤 핵 듀 레이블 표시는 S 단계 핵입니다. 를 계산 하려면 sum A와 C 핵을가지고 표 1 과 그림 2를 참조 하십시오.
      참고: 30 분 야생-타입 성인 광고에 나온 것에 듀 펄스, 핵 표시 모든 듀 공동 조상 영역 마커1레이블이 있습니다.
    2. 조상 영역을 측정 하는 REC-8 또는 WAPL-1 항 체와 같은 조상 영역 표시와 함께 얼룩. 조상 영역 정의 모든 nucleoplasmic REC-818 또는 WAPL-1 immunoreactive 생식 핵 여기. 를 계산 하려면 합계 모든 WAPL-1 immunoreactive 핵 (A + B + C + D, 표 1 및 그림 2참조).
      참고: DTC 및 체세포 생식 핵 계산 서는 안 될 WAPL-1는 또한 라벨. 체세포 핵은 매우 강렬한 WAPL-1 신호, 생식, 그리고 핵의 "튀긴 달걀" 형태 밖에 약간 위치에 의해 식별 하기 쉽습니다.
    3. S 단계 인덱스를 측정 30 분 듀 실험을 수행 하 고 REC-8 또는 WAPL-1 항 체 공동 레이블. S 단계 인덱스 S 단계에 있는 조상 영역의 비율으로 정의 됩니다. 계산 하려면, 모든 S 상 핵, 계산 하 고 다음 조상 영역 핵의 총 수로 나누면 (A + C / A + B + C + D, 표 1 및 그림 2참조).
    4. (변형 II) 핵 M-단계에서를 식별 하려면 pH3 항 체와 얼룩. 어떤 pH3 immunoreactive 핵 M-단계 핵 있습니다. 이 피드 듀의 기간에 관계 없이 작동 합니다. 받아 A의 합계를 계산 하려면 B 핵, 표 1 과 그림 2를 참조 하십시오.
      참고: DTC 및 체세포 생식 핵 계산 서는 안 될 WAPL-1는 또한 라벨. 체세포 핵은 매우 강렬한 WAPL-1 신호, 생식, 그리고 핵의 "튀긴 달걀" 형태 밖에 약간 위치에 의해 식별 하기 쉽습니다.
    5. M 단계 인덱스를 측정 하기 위해 공동 pH3와 REC-8 또는 WAPL-1 항 체와 레이블을 지정 합니다. M 단계 인덱스 M 단계에 있는 조상 영역의 비율으로 정의 됩니다. 계산 하려면, 모든 M-단계 핵, 계산 하 고 다음 조상 영역 핵의 총 수로 나누면 (A + B / A + B + C + D, 표 1 및 그림 2참조).
    6. (변형 III) 핵 mitotic meiotic S 단계에서 둘 다 듀와 레이블을 지정합니다. 떨어져 두 개의 인구에 게, S 상 감수 분열 또는 유사 분열에 의해 선행 되었다 여부를 결정 합니다. 있는지 여부를 확인 핵 mitotic 또는 meiotic S 단계, 4 h 및 공동 레이블인 pH3 듀 피드 (M 단계 마커)와 항 체 얼룩이 지기에 의해 그-3 (meiotic 염색체 축 단백질). 듀와 pH3 핵 기록 (A를 입력, 표 1 및 그림 2참조) 단계로 mitotic S-핵 듀 그 3를 모두 표시 하는 동안 (e, 표 1 및 그림 2참조) meiotic S 단계로.
    7. (변형 IV) G 2 단계 기간을 계산 합니다.
      참고: G2 단계 M 단계에서 S 단계를 분리합니다. 비록 아무 표식 라벨 g 2에 선 충 C. 생식 보고 되었습니다, 하나 M-위상 (해 부 시) 및 S (시작 하기 전에 h 여러 레이블을 여러 실험에서 데이터를 결합 하 여 g 2 단계 기간을 계산할 수 있습니다. 해 부)입니다. M 단계 및 S 상 마커 표시 하는 셀 실험 과정 중 g 2 단계를 완료. M 단계 마커만 및 하지 S 상 마커 표시 하는 셀 실험 기간 동안 S 단계에서 되지 않았습니다.
      1. G 2 단계 기간을 계산 하려면 듀 2 h 및 pH3 항 체와 공동 레이블에 대 한 피드. 듀 (이들은 S 단계에서 절 개 전에 2 h 듀 레이블 중)의 존재에 대 한 (이 M-단계 해 부의 시간에 있는) 하는 pH3 레이블 유일한 핵을 검사 합니다. G 2 단계를 완료 하는 M 단계 핵의 분수를 계산 (A / A + B, 표 1 및 그림 2참조).
      2. 3 h 듀 라벨와 함께 다시 4 h 듀 레이블 (및 선택적으로 5 h 듀 라벨)이이 실험을 반복 합니다. 그림 3A와 같이 긍정적인 y에 듀는 pH3 긍정적인 핵의 %와 x 축에 듀 라벨의 기간을 플롯 합니다.
      3. 그래프에서 점을 연결 그림 3A와 같이 라인 50%를 교차 하는 곳을 확인 하 여 g 2 단계의 중간 기간을 계산 합니다.
      4. 그래프에서 점을 연결 그림 3A와 같이 선 99%를 교차 하는 곳을 확인 하 여 g 2 단계의 최대 기간을 계산 합니다.
    8. (변형 V) G 1 g 2 + M +의 duraion를 계산 합니다.
      참고: 선 충 C. 생식에 g 1 단계는 비정상적으로 짧은. 아무 표식 C. 선 충 의 생식에 g 1을 보고 되었습니다, 비록 하나 G2, M, 및 g 1 단계 합 기간을 추정 하 고 위에서 설명한 G2 단계 시간을이 시간을 비교할 수 있습니다. G 1 g 2 + M +의 최대 기간 듀 라벨 몇 시간 동안 후 듀 네거티브 (S 단계를 받아야 하지 않았다)에 남아 있는 모든 조상 영역 핵 (WAPL-1 immunoreactive)의 비율에서 추정 된다.
      1. G 2 + M + g 1의 기간을 계산 하려면 듀 2 h와 REC-8 또는 WAPL-1 항 체와 공동 레이블에 대 한 피드. 이 시간 동안에 S 단계를 겪었다 뿌리 영역의 일부분 결정 (A + C / A + B + C + D, 표 1 및 그림 2참조).
      2. 3 h 듀 라벨와 함께 다시 4 h 듀 레이블 (및 선택적으로 5 h 듀 라벨)이이 실험을 반복 합니다. 그림 3B와 같이 REC-8 또는 긍정적인 y에 듀는 WAPL-1 긍정적인 핵의 %와 x 축에 듀 라벨의 기간을 플롯 합니다.
      3. 그래프에 포인트를 연결 하 고 선 99%를 교차 하는 곳을 찾는 그림 3B와 같이 g 1 g 2 + M +의 최대 기간을 계산 합니다.
        참고: 마우스-안티-pH3와 토끼-안티-WAPL-1 항 체와 라벨 공동 실험 2, 3, 4, 단일 집합으로 g 2와 g 2 + M + g 1의 기간을 결정 하 고 5 h 듀 실험 수행 가능 하다.
    9. (변형 VI) 조상 영역에서 복제 핵을 식별 하지만 입력된 감수 분열 이후, REC-8 또는 WAPL-1 항 체 10 h와 공동 레이블 듀 동물 먹이. 어떤 핵 듀 레이블 표시 그 10 h 동안 S 단계에 있었다. Nucleoplasmic REC-8 또는 WAPL-1 얼룩을 표시 하지 않는 어떤 핵 감수 분열에 있었다. 단순히 계산 조상 영역 표시로 표시 되지 않는 듀 라벨와 핵 (E, 표 1참조).
      참고: 반대로, 생식 선은 안티-그-3 항 체와 meiotic 의향 마커 그-3 대 한 스테인드, 수 핵을 라벨에 듀와 함께 수 있다면 또한 그-3에 대 한 긍정적인.
    10. Meiotic 항목의 비율을 계산 하려면 듀 5 h, 10 h, 및 15 h 레이블이 위의 실험을 수행 합니다. 그림 3C와 같이 y 축과 x 축에 듀 라벨의 기간에 감수 분열을 입력 하는 핵의 수를 플롯 합니다. 다음 사용 하 여 단순 선형 회귀 기울기 (h 당 입력 핵 감수 분열)을 계산 하에서 y = mx + b.
      참고:를 사용 하 여 선형 회귀 계산 meiotic 항목의 긴요 하다. 그것은 단순히 y-절편 0이 아닌 때문에 듀 라벨의 기간으로 감수 분열을 입력 하는 핵의 수를 분할 하는 것 잘못 될 것 이다.
    11. (변형 7 세) Meiotic 진행의 속도 측정 합니다.
      참고: 듀 covalently DNA에 통합 되어, 이후 그것은 사용할 수 있습니다 추적 차별화를 통해 세포의 인구를. 그들은 감수 분열, 감수 분열, 진행에 입력 하 고 받을 oogenesis 조상 영역에서 S 상 받았다 셀 듀 레이블을 유지 합니다. 듀와 펄스-체이스 실험 meiotic 진행의 속도 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
      1. 4 h ("맥 박")에 대 한 동물에 듀 라는 박테리아를 피드. 48 h ("체이스")에 대 한 레이블이 OP50 박테리아 동물 전송 다음 해 부 및 원하는 경우 REC-8 또는 WAPL 1 등 조상 영역 마커 (또는 meiotic 의향 마커 그-3 등)와 함께 공동 레이블.
      2. 이미징, 가장 근 듀 표시 된 핵의 위치를 찾습니다. Meiotic 진행의 속도 거리 (原 영역의 끝에서 셀 직경) 48 h 체이스 중 핵 표시 가장 인접 듀에 의해 여행.

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결과

때문에 DNA 종합에 듀 통합 하는 데 필요한, 하나 듀 라는 핵 듀 라벨 시간 창 동안 S 단계 수술을 가정할 수 있습니다. 하나는 핵 해 부의 때에 S 단계에서 핵으로 박테리아를 분류 하는 듀와 수 유 30 분에 라벨을 해석할 수 있습니다. 핵 실험을 먹이 더 이상 연속 듀에 레이블을 지정 하는 시간 창에 왼쪽된 S 단계부터 초기 레이블을 수 또는 듀 시간대의 후반 부분에 레이블을 수 있습니다. 듀 신호 공동 DAPI 신호와 localizes. 일부 핵에 듀 신호 다른 핵에 듀에서 신호 localizes 1-2 밝은 puncta (그림 4)를 하는 동안 모든 염색체를 다루고 있습니다. 이 puncta은 S 상13에 늦게 복제를 x 염색체.

동물 들이 여기,에 듀와 함께 지속적으로 30 분...

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토론

듀 라는 박테리아 (단계 1)의 준비는이 프로토콜 및 문제 해결을 위한 첫 번째 포인트에 대 한 중요 한 이다. 야생-타입 젊은 성인 광고에 나온 것 4 h 듀-펄스, 듀 라는 박테리아의 모든 새로운 배치를 위한 유용한 컨트롤 만들기에 매우 안정적으로 레이블. 또한, 소장 (입력 더 오래 된 동물 또는 특정 인 두/분쇄기 결함이 있는 돌연변이) 그대로 듀 라는 박테리아 클릭 화학 레이블 하 고 용기에 밝은 직사각형 puncta로 나타납니다. 광고에 나온 것을 라벨에 대 한 대체 기술 듀3의 높은 농도 (1 mM) "소"를 사용 합니다. 이 기술은,의 기간에 대 한 동물을 starves 하지만 고정 문제를 해결할 때 만드는 듀 라는 박테리아를 무시 하 고 화학을 클릭 하는 유용한 방법을 제공 합니다. 듀 피드 동안 듀 "적신 다" 실험 성공 하면 다음 신선한 듀 라는 박테리아를 준비 합니다. 도달 하기 위해 충분 한 세균 밀도 높은 듀 콘텐츠를 달성 하는 동안, 하나 듀와 티 미 딘 농도...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 MG1693;에 대 한 대장균 재고 센터에 감사 Wormbase; 프로그램에 의해 국립 연구소의 건강 사무실의 연구 인프라 (P40OD010440) 긴장;에 대 한 투자는 꼬마 유전학 센터 자크 Pincus 통계 조언; Aiping Feng 시 약;에 대 한 루크 슈나이더, 안드레아 Scharf, Sandeep 쿠마, 그리고 교육, 조언, 지원, 및 유용한 토론; 존 브 레너 그리고이 원고에 피드백 Kornfeld Schedl 실험실. 이 작품 부분 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 주식, TS R01 GM100756 [R01 AG02656106A1]와 [당선-1143954와 ZK DGE-1745038] 국립 과학 재단 predoctoral 친목. 건강의 국가 학회도 국립 과학 재단 연구, 수집, 분석, 및 데이터의 해석의 디자인에도 원고를 쓰기에 어떤 역할을 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
E. coli MG1693Coli Genetic Stock Center6411은 표준 비보충 LB
E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트Thermo Fisher ScientificC10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridineSigma900584-50MG또는 키트에 제공된 EdU를 사용하십시오
포도당시그마D9434-500GD-(+)-덱스트로오스
티아민(비타민 B1)시그마T4625-5G시약 등급
티미딘시그마T1895-1G생물시약
황산마그네슘 헵타하이드레이트시그마M1880-1KGMgSO4, 시약 등급
인산나트륨, 이염기성, 무수피셔BP332-500GNa2HPO4
인산칼륨, 일염기성 시그마P5379-500GKH2PO4
염화암모늄시그마A4514-500GNH4Cl, 시약 플러스
세균학 한천US 생물학적C13071058
염화칼슘 이수화물시그마C3881-500GCaCl
LB 육수(밀러)시그마L3522-1KG25g/L
레바미솔SigmaL9756-5G0.241g/10ml
인산염 완충 식염수Calbiochem Omnipur6506수제 PBS는 잘 작동합니다
Tween-20SigmaP1379-500ML
16% 파라포름알데히드, EM 등급 앰플전자 현미경 과학1571010ml 앰플
100% 메탄올Thermo Fisher ScientificA454-1L골드 라벨 메탄올은 특정 항체의 적절한 형태학에 매우 중요합니다
Goat SerumGibco16210-072Lot
1671330 rabbit-anti-WAPL-1Novus biologicals49300002Lot G3048-179A02, 1:2000에서 사용
mouse-anti-pH3 clone 3H10Millipore05-806Lot#2680533, 1:500
에서 사용염소-안티-토끼 IgG-conjugated Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Lot 1256147, 1:400에서 사용
염소-안티-마우스 IgG-conjugated Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Lot 1511347, 1:400에서 사용
',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)Vector Laboratories H-1200을 포함하는 Vectashield 안티페이드 마운팅 매체DAPI가 없는 장착 매체를 대신 사용할 수 있으며, 별도의 DAPI 배양
매니큐어Wet n WildDTC450B따라 모든 투명 매니큐어가 작동해야 합니다
S-medium프로토콜에 대한 다양한 wormbook.org 참조
, M9 버퍼와 다양한 동일한 레시피를 참조하지만 1.7% 한천을 추가해야 합니다
선충 성장 매체다양한프로토콜
해부 wormbook.org 시계 유리캐롤라이나 생물학42300
파라 필름 실험실 필름Pechiney 플라스틱 포장PM-9964 인치 와이드 실험실 필름
페트리 접시직경 60mm
긴 유리 파스퇴르 피펫
1ml 원심분리기 튜브MidSci Avant2926
팁
혈청학 피펫
500 mL 에를렌마이어 플라스크
알루미늄 호일
25G 5/8" 바늘BD PrecisionGlide 
5ml 유리 원심분리기 튜브Pyrex 
붕규산 유리관 1ml
유리 슬라이드
번호 1 커버 슬립 22 x 40 mm번호 1.5 작동 할 수 있습니다, 또한
37 ° C 셰이커 인큐베이터
탁상용 원심 분리기
임상 원심 분리기IEC4286 스윙 버킷 로터
미니 원심 분리기
20 ° C 인큐베이터
4 ° C 냉장고
-20 ° C freezer
Observer Z1 현미경Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 오일 액침 대물 렌즈Zeiss
Ultraview Vox 회전 디스크 컨포칼 시스템PerkinElmer Nikon 스피닝 디스크 컨포칼 시스템은 여기에 설명된 바와 같이 매우 잘 작동합니다 http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy .
4. 은 M9 버퍼, 프로토콜 M9 한천 에 대한 다양한 wormbook.org 참조.305122

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