방법 논문

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석

DOI:

10.3791/58339

⸱

2018년 10월 22일

 ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

이 논문에서

요약

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이미징 기반 메서드를 설명 하는 S 단계를 식별 하 고 사용 하는 티 미 딘 C. 선 충 자웅 동체 생식 세포 주기 역학을 분석 하는 데 사용할 수 있는 아날로그 듀. 이 메서드와 필요 없는 transgenes immunofluorescent 얼룩과 호환 됩니다.

초록

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진핵생물의 세포 주기 분석 염색체 형태, 식 및 세포 주기의 다양 한 단계 또는 nucleoside 아날로그의 설립에 필요한 유전자 제품의 지역화에 자주 활용 합니다. S 단계, DNA polymerases 분석에 대 한 셀을 표시 하는 염색체 DNA에 듀 등 BrdU 티 미 딘 아날로그를 통합 합니다. C. 선 충는 nucleoside 아날로그 듀 일반 문화 중 벌레는 먹이 및 immunofluorescent 기술을와 호환 됩니다. C. 선 충 의 생식은 신호 경로, 줄기 세포, 감수 분열, 세포 주기 때문에 투명 하 고, 유전으로 손쉬운 meiotic 의향 및 세포 분화/gametogenesis 발생의 연구에 대 한 강력한 모델 시스템을 선형 어셈블리 같은 패션. 이러한 기능에 듀 mitotically 자전거 세포 및 생식 개발의 동적 측면을 연구 하는 훌륭한 도구를 확인 합니다. 이 프로토콜 성공적으로 듀 박테리아를 준비, 야생-타입에 피드 하는 방법에 설명 합니다 선 충 C. 광고에 나온 것, 자웅 동체 생식 해 부, DNA에 듀 설립 얼룩 얼룩 다양 한 세포 주기를 검출 하기 위하여 항 체와 고 발달 마커, 생식을 이미지 하 고 결과 분석. 프로토콜은 메서드 및 S 단계 인덱스, M-인덱스, g 2 기간, 세포 주기 기간, meiotic 항목의 위상과 meiotic 의향 진행의 속도의 측정에 대 한 분석에 있는 변이 설명합니다. 이 방법은 세포 주기 또는 다른 조직, 단계, 유전적 배경, 생리 적 조건에 셀 역사 연구에 적응 될 수 있다.

서론

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동물 개발에 수백, 수천, 수백만, 수십억, 또는 심지어 수조 세포 분열의 성인 유기 체를 형성 하기 위하여 필요 합니다. 세포 주기 G1 세포 이벤트 집합 구성 (gap), S (합성), G2 (gap), M (유사 분열) 정의 일련의 이벤트 실행 각 세포 분열. 세포 주기는 역동적이 고 실시간으로 기술적으로 어려울 수 있는 최고의 평가입니다. 이 프로토콜에 기술 단계 측정 및 스틸 이미지에서 세포 주기의 타이밍을 만드는 수 있습니다.

꼬마 선 충 (C. 선 충) 성인에서 세포 주기 역학의 연구에 S 단계를 식별 하는 금 본 위 제는 nucleoside 아날로그 deoxyuridine (듀)-5-ethynyl-2' 등 deoxyuridine (BrdU)-5-브로 모-2'로 자웅 동체 생식1,2,3,,45. 로 그들은 어떤 유전자 구조에 의존 하지 않는 거의 모든 유전적 배경에 듀와 BrdU 사용할 수 있습니다. BrdU ....

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프로토콜

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1입니다. 듀 라는 박테리아의 준비

  1. MG1693의 시 동기 문화를 성장. 대장균 (대장균) MG1693 thyA에 돌연변이 수행합니다.
    1. 조는 120mm lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배양 접시에 냉동된 글리세롤 재고에서 흔 대장균 MG1693 개 37 ° C 하룻밤에 문화입니다.
    2. 두 개의 개별 대장균 에서 접종 2로 MG1693 식민지 중복 ~ 16 h에 대 한 37 ° C에 액체 파운드 문화의 4 mL 튜브.
      참고: MG1693 파운드에 좋은 티 미 딘 thymine와 보충 없이 성장 합니다.
  2. 대장균 MG1693 듀 보충 최소 매체에 성장.
    1. 500 mL 원뿔 플라스 크 압력솥입니다.
    2. 무 균 기술을 사용 하 여 추가 20% 포도 당의 5 mL, 10 mg/mL의 티 아민, 티 미 딘 5 m m의 120 μ, 1 M MgSO4, 10 mM 듀, M9 버퍼의 100 mL 및 문화의 갓 재배 하룻밤 MG1693 4 mL 200 μ의 100 μ의 50 μ.
      참고: 듀의 최종 농도 20 ....

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결과

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때문에 DNA 종합에 듀 통합 하는 데 필요한, 하나 듀 라는 핵 듀 라벨 시간 창 동안 S 단계 수술을 가정할 수 있습니다. 하나는 핵 해 부의 때에 S 단계에서 핵으로 박테리아를 분류 하는 듀와 수 유 30 분에 라벨을 해석할 수 있습니다. 핵 실험을 먹이 더 이상 연속 듀에 레이블을 지정 하는 시간 창에 왼쪽된 S 단계부터 초기 레이블을 수 또는 듀 시간대의 후반 부분에 레이블을 수 있습니다. 듀 신호 공동 DAPI 신호와 localizes. 일부 핵에 듀 신호 다른 핵에 듀에서 신호 localizes 1-2 밝은 puncta (그림 4)를 하는 동안 모든 염색체를 다루고 있습니다. 이 puncta은 S 상13에 늦게 복제를 x 염색체.

동물 들이 여기,에 듀와 함께 지속적으로 30 분.......

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토론

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듀 라는 박테리아 (단계 1)의 준비는이 프로토콜 및 문제 해결을 위한 첫 번째 포인트에 대 한 중요 한 이다. 야생-타입 젊은 성인 광고에 나온 것 4 h 듀-펄스, 듀 라는 박테리아의 모든 새로운 배치를 위한 유용한 컨트롤 만들기에 매우 안정적으로 레이블. 또한, 소장 (입력 더 오래 된 동물 또는 특정 인 두/분쇄기 결함이 있는 돌연변이) 그대로 듀 라는 박테리아 클릭 화학 레이블 하 고 용기에 밝은 직사각형 puncta로 나타납니다. 광고에 나온 것을 라벨에 대 한 대체 기술 듀3의 높은 농도 (1 mM) "소"를 사용 합니다. 이 기술은,의 기간에 대 한 동물을 starves 하지만 고정 문제를 해결할 때 만드는 듀 라는 박테리아를 무시 하 고 화학을 클릭 하는 유용한 방법을 제공 합니다. 듀 피드 동안 듀 "적신 다" 실험 성공 하면 다음 신선한 듀 라는 박테리아를 준비 합니다. 도달 하기 위해 충분 한 세균 밀도 높은 듀 콘텐츠를 달성 하는 동안, 하나 듀와 티 미 딘 농도.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리는 MG1693;에 대 한 대장균 재고 센터에 감사 Wormbase; 프로그램에 의해 국립 연구소의 건강 사무실의 연구 인프라 (P40OD010440) 긴장;에 대 한 투자는 꼬마 유전학 센터 자크 Pincus 통계 조언; Aiping Feng 시 약;에 대 한 루크 슈나이더, 안드레아 Scharf, Sandeep 쿠마, 그리고 교육, 조언, 지원, 및 유용한 토론; 존 브 레너 그리고이 원고에 피드백 Kornfeld Schedl 실험실. 이 작품 부분 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 주식, TS R01 GM100756 [R01 AG02656106A1]와 [당선-1143954와 ZK DGE-1745038] 국립 과학 재단 predoctoral 친목. 건강의 국가 학회도 국립 과학 재단 연구, 수집, 분석, 및 데이터의 해석의 디자인에도 원고를 쓰기에 어떤 역할을 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
E. coli MG1693Coli Genetic Stock Center6411은 표준 비보충 LB
E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트Thermo Fisher ScientificC10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridineSigma900584-50MG또는 키트에 제공된 EdU를 사용하십시오
포도당시그마D9434-500GD-(+)-덱스트로오스
티아민(비타민 B1)시그마T4625-5G시약 등급
티미딘시그마T1895-1G생물시약
황산마그네슘 헵타하이드레이트시그마M1880-1KGMgSO4, 시약 등급
인산나트륨, 이염기성, 무수피셔BP332-500GNa2HPO4
인산칼륨, 일염기성 시그마P5379-500GKH2PO4
염화암모늄시그마A4514-500GNH4Cl, 시약 플러스
세균학 한천US 생물학적C13071058
염화칼슘 이수화물시그마C3881-500GCaCl
LB 육수(밀러)시그마L3522-1KG25g/L
레바미솔SigmaL9756-5G0.241g/10ml
인산염 완충 식염수Calbiochem Omnipur6506수제 PBS는 잘 작동합니다
Tween-20SigmaP1379-500ML
16% 파라포름알데히드, EM 등급 앰플전자 현미경 과학1571010ml 앰플
100% 메탄올Thermo Fisher ScientificA454-1L골드 라벨 메탄올은 특정 항체의 적절한 형태학에 매우 중요합니다
Goat SerumGibco16210-072Lot
1671330 rabbit-anti-WAPL-1Novus biologicals49300002Lot G3048-179A02, 1:2000에서 사용
mouse-anti-pH3 clone 3H10Millipore05-806Lot#2680533, 1:500
에서 사용염소-안티-토끼 IgG-conjugated Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Lot 1256147, 1:400에서 사용
염소-안티-마우스 IgG-conjugated Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Lot 1511347, 1:400에서 사용
',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)Vector Laboratories H-1200을 포함하는 Vectashield 안티페이드 마운팅 매체DAPI가 없는 장착 매체를 대신 사용할 수 있으며, 별도의 DAPI 배양
매니큐어Wet n WildDTC450B따라 모든 투명 매니큐어가 작동해야 합니다
S-medium프로토콜에 대한 다양한 wormbook.org 참조
, M9 버퍼와 다양한 동일한 레시피를 참조하지만 1.7% 한천을 추가해야 합니다
선충 성장 매체다양한프로토콜
해부 wormbook.org 시계 유리캐롤라이나 생물학42300
파라 필름 실험실 필름Pechiney 플라스틱 포장PM-9964 인치 와이드 실험실 필름
페트리 접시직경 60mm
긴 유리 파스퇴르 피펫
1ml 원심분리기 튜브MidSci Avant2926
팁
혈청학 피펫
500 mL 에를렌마이어 플라스크
알루미늄 호일
25G 5/8" 바늘BD PrecisionGlide 
5ml 유리 원심분리기 튜브Pyrex 
붕규산 유리관 1ml
유리 슬라이드
번호 1 커버 슬립 22 x 40 mm번호 1.5 작동 할 수 있습니다, 또한
37 ° C 셰이커 인큐베이터
탁상용 원심 분리기
임상 원심 분리기IEC4286 스윙 버킷 로터
미니 원심 분리기
20 ° C 인큐베이터
4 ° C 냉장고
-20 ° C freezer
Observer Z1 현미경Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 오일 액침 대물 렌즈Zeiss
Ultraview Vox 회전 디스크 컨포칼 시스템PerkinElmer Nikon 스피닝 디스크 컨포칼 시스템은 여기에 설명된 바와 같이 매우 잘 작동합니다 http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy .
4. 은 M9 버퍼, 프로토콜 M9 한천 에 대한 다양한 wormbook.org 참조.305122

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J.

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