여기는 살아있는 세포에서 fluorometric 및 이미징 분석 통해 효율 resealing 플라즈마 멤브레인을 측정 하는 높은 처리량 형광 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 약 또는 포유류 세포에서 원형질 막 resealing 규제 대상 유전자 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
그들의 생리 적인 환경에서 포유류 세포 원형질 막 손상 기계 및 생 화 확 적인 스트레스를 자주 받게 됩니다. 이러한 손해에 대응, 복잡 한 분자 기계는 빠르게 원형질 막의 장벽 기능 복원 및 세포 생존을 유지 다시 봉인. 이 분야에 있는 연구의 60 년에 불구 하 고 우리는 여전히 기계를 resealing 셀에 대 한 철저 한 이해 부족. 세포질 구성 요소를 식별 하는 목적으로 그 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 또는 resealing, 향상 시킬 수 있는 약물 개발 했습니다 플라즈마 멤브레인 resealing 포유류 세포에 있는 효율성을 측정 하는 형광 기반의 높은 처리량 분석 결과 microplates에서 경작. 원형질 막 손상에 대 한 모델 시스템으로 서 세포 세균 기 공 형성 독 소 listeriolysin O (LLO), 큰 30 ~ 50 nm 직경 배치할 포함 하는 콜레스테롤에 숨 구멍을 형성 하에 노출 되는 세포 막. 명시 및 살아있는 세포의 형광 현미경 이미지와 함께 신속 하 고 민감한 spectrofluorometric 측정 온도 제어 멀티 모드 microplate 리더를 사용 하 여 수 있습니다. 부상 및 효율 resealing 셀의 계산을 허용 세포 인구 수준 resealing 막의 정도 반영 하는 막 impermeant 핵 산 바인딩 형광 색소에 의해 방출 되는 형광 강도의 운동 분석 . 형광 현미경 영상 constitutively 핵 단백질 히스톤 2B 잠재적인 변화 그들의 수에 대 한 계정에 미 판의 각 우물에서의 형광 키메라를 표현 하 고 결국 세포의 열거 허용 뚜렷한 세포 인구의 식별입니다. 이 높은 처리량 분석 결과 호스트 유전자에 대 한 심사를 통해 막 복구 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 확장 하는 것으로 예상 된다 또는 것 추가 하는 강력한 도구는 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 화합물 이다.
서론
포유류 세포 원형질 막 무결성의 손실의 결과로 기계, 삼 투, 및 생 화 확 적인 스트레스를 받습니다. 신속 하 고 효율적인 resealing 없이 손상 된 세포는 신속 하 게 프로그램 또는 회 저 성 죽음에 굴복 하 고. 1960 년대 이후, 노력 과정 resealing 플라즈마 멤브레인을 이해 하는 엄청난 결과 장애와 관련 된 동기가 있다. 실제로, 사지 띠 근 위축 증, 당뇨병, 및 Chediak-히가시 증후군 같은 질병 돌연변이 유전자 인코딩 dysferlin, 고급 glycation 엔드 제품의 생산에서 및 결함 결핍 플라즈마 막 복구에 연결 되었습니다. lysosomal 밀매 레 귤 레이 터 CHS1, 각각1,2,,34,,56. 그러나, 날짜, 막의 우리의 이해를 resealing은 여전히 제한7입니다. 초기 연구는 세포 외 캘리포니아2 + 원형질 막 손상 된
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프로토콜
1입니다. 준비
- 셀 도금
참고: 인간 자 궁 경부 상피 세포, 헬러와 히스톤 2B-GFP (H2B-GFP), 표현 헬러가이 프로토콜에서 사용 되었다 그러나이 분석 결과 다른 포유류 세포19에 적용할 수 있습니다.- 0.25% Trypsin EDTA의 2 mL와 함께 셀을 세척 하 여 75 cm는2 셀은 문화 플라스 크에서 부착 세포를 분리 합니다. 사용 된 트립 신을 2 mL 신선한 트립 신-EDTA 0.25%의 바꿉니다.
- 세포는 둥글게 하 고 플라스 크에서 분리 될 때까지 5 분 동안 37 ˚C에서 세포를 품 어.
- 성장 매체 (DMEM 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 100 U/mL 페니실린 그리고 100 µ g/mL 스)의 8 ml 셀 resuspend
- hemocytometer 세포 현 탁 액의 10 µ L을 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다.
- 2.5 x 105 셀/mL의 농도에 성장 매체에 셀을 희석.
- 피 펫 멸 균 분 지에 세포 현 탁 액을 부 어 하 고 철저 하 게 현 탁 액 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 혼합.
- 12-멀티 ....
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결과
셀 계산 정확도: 헬러 세포 막 복구 메커니즘을 탐구 모델 포유류 세포 선으로 자주 사용 됩니다. 세포 인구 수준에서 막 복구를 평가할 때는 적절 한 데이터 해석에 대 한 모든 우물에 같은 농도에서 판 세포에 중요 하다. 그것은 또한 웰 스에서 핸드폰 번호는 해당 시험의 시간에 확인 해야 합니다. 헬러 세포 constitutively 히스톤 2B GFP (H2B-GFP) 융합을 표현 하는이 분석 결과를 자동으로 그들의 형광 핵의 탐지를 기반으로 하는 셀 열거에 도입 되었다. 셀 열거형에 정확도 확립, 헬러 H2B GFP 셀의 두 가지 직렬 희석 triplicate 96 잘 접시에서에 4 h에 대 한 교양 도금 했다. 이 정도의 시간 셀 첨부 파일에 대 한 충분 한 이며 제한 된 세포 분열을 제공 합니다. 전체 웰 스 전송된 빛 (TL) 아래 몇 군데 했다 그리고 GFP 형광 조명 및 셀 GFP 형광 (그림 2A 와
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토론
이 분석 결과 막 셀 인구 수준 높은 처리량 용량 resealing의 효율성을 측정 합니다. 그것은 사용 될 수 있다 세포 구성 요소 또는 막 복구에 영향을 미칠 수 있는 약물 라이브러리에 대 한 화면으로. 기술된 분석 결과 96 잘 접시 형식을 사용 하지만 높은 처리량에 대 한 384-잘 접시를 적응 시킬 수 있다. 이 분석 결과의 장점은 과도 한 셀 셀 분리, 고정, 또는 형광 라벨 후 고정 등 처리에 대 한 필요 없이 실시간으로 부착 살아있는 세포 형광 측정을 얻을 하는 기능입니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 것과 같은 다중 플레이트 독자 최저 30 시간 간격 빠른 spectrofluorometric 측정에 대 한 충분 한 감도 있다 96 잘 접시에 대 한 s. 형광 이미지 인수 셀 열거, 최종 변경 셀 형태, 그리고 뚜렷한 세포 인구의 잠재적인 id 등의 추가 정보를 제공 합니다. 현재 분석 결과 플라즈마 멤브레인 resealing 단일 세포 수준에서의 활동을 설정 하지 않습니다 하지만 영향을 미칠 수, 긍정적으로 또는 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 친절 하 게 우리 일부 예비 실험에 대 한 그의 멀티 모드 검색 플랫폼을 사용 하 수 있도록 박사 제시 Kwiek (오하이오 주립 대학)를 인정 합니다. 이 문서에서 보고 하는 연구는 알레르기 국립 연구소와 전염병의 스테파니 Seveau에 보너스 번호 RO1AI107250에서 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| SpectraMax i3x 다중 모드 마이크로플레이트 리더 | 분자 장치 | i3x | |
| MiniMax 300 이미징 세포분석기 | 분자 장치 | 5024062 | |
| TO-PRO-3 | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| 프로피듐 요오드 | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| HeLa | ATCC | CCL2 | |
| HeLa H2B-GFP | Millipore | SCC117 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| 96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plated | Corning | 3603 | |
| Hanks' Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| EGTA | ISC BioExpress | 0732-100G | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-(+)-포도당, HybriMax | 시그마-알드리치 | G5146-1KG |
참고문헌
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
- Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597(2011).
- Howa....
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재인쇄 및 허가
