Pubertal 발병을 확인 하 고 쥐 및 쥐에 다 산 분석 결과 수행 하 여 생식 능력의 결정

요약

많은 치료 및 유전자 변이 성적 성숙과 다 산의 타이밍에 영향을. 이 프로토콜 pubertal 발병 쥐 및 쥐에 성적으로 성숙한 동물 불 임 연구를 설정 하는 이전에 평가 하는 비-침략 적 방법을 설명 합니다.

초록

생식 능력의 평가 치료 또는 또한 불린 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 생식 축에 유전자 조작의 영향을 이해 하는 데 중요 하다. 생식 축 다 산 재생산에 유리한 조건에 적응 하는 환경 및 내부 입력의 주요 통합 이다. 쥐 및 쥐에 불 임 연구에 착수, 이전 성적 성숙 평가 제외 가능성 관찰된 생식 고기에 의해 발생 하는 지연 또는 pubertal 발병 결 석. 이 프로토콜 pubertal 발병 preputial 분리의 결정을 통해 남성 및 질 및 첫 발 정기를 통해 여성을 평가 하는 비-침략 적 접근 방식을 설명 합니다. 사춘기의 성적 성숙의 공적 및 확인 후 불 임 연구를 시작할 수 있습니다. 절차는 쥐와 쥐, 불 임 연구를 설정 하는 방법 및 어떤 매개 변수를 평가 하 고 치료 또는 유전자 삭제 다 산에의 영향을에 있는지 확인에 대 한 최적의 번 식 조건을 설명 합니다.

서론

사춘기를 통해 전환 성적 성숙 및 생식 능력을 달성 하기 위해 필요 합니다. Pubertal 전환 및 성인에서 비 옥의 정비 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 (그림 1) 불리는 생식 축에 의해 통제 된다. Pubertal 개시의 타이밍 및 비 옥의 정비 단단히 자손과 부모^1,2의 생존의 기회를 높이기 위해 내부 뿐만 아니라 환경 요인에 의해 통제 된다. 이 프로토콜에는 생쥐와 쥐 생식 능력을 평가 하는 불 임 연구를 설정 하기 전에 성적 성숙 확인 pubertal 발병을 확인 하는 비-침략 적 접근 방식을 제공 합니다.

불 임 연구는 성적으로 성숙한 동물에서 수행 되 고 동물 사춘기를 통해 간 후에 시작 될 수 있다. Pubertal 발병 전에 생식 축, 이며 사춘기 (그림 1)를 시작에 부족 금액에 뇌 하 수 체에 성적인 성숙, 생식 샘 자극 호르몬-방출 호르몬 (GnRH)의의 핵심 드라이버 릴리스입니다. Pubertal 발병 증가 GnRH 릴리스 중간 예 하에서 발생 하는 복잡 한 프로세스입니다. GnRH 황 호르몬 (LH)과 여 포 자극 호르몬 (FSH) 분 비 뇌 하 수 체에서 2 개의 호르몬 gonadal 성숙 및 생식 기능 (그림 1)^3,,45 에 대 한 필수적인 촉진 .

생식 축에 모욕 감소 다 산 되며 또한 사전 또는 지연 pubertal 발병 할 수 있다. Pubertal 발병과 생식 능력의 타이밍에 영향을 알려진 조건 포함 화학^6,7, 증가/감소 몸 무게^1,8에 변화를 방해 하는 내 분 비에 노출 날 길이^2,9 그리고 유전자 변이^{10,11,12,13,,1415}.

성적인 성숙의 개시 다 산 분석 결과를 설정 하기 전에 완료 해야 할 중요 한 단계 이다. Preputial 분리, 질 및 첫 발 정기를 통해 pubertal 개시 결정의 장점은 이러한 절차의 비-침략 적 특성으로 혈액 또는 동물^16, 의 희생을 요구 하지 않기 ¹⁷.

Pubertal 개시 결정 후 불 임 연구를 제대로 설정 생식 축의 무결성에 대 한 중요 한 정보를 제공 합니다 있으며 일반적으로 생성 하는 추가 연구 (수정)에 대 한 실험 동물의 두 번째 장점은 ¹⁸.이 프로토콜에서 설명 하는 불 임 연구 설치 남성과 여성 생식 능력에서 미성년자와 주요 적자를 검색할 수 있습니다. 키 매개 변수 계산 포함 1) 첫 번째 쓰레기, 2) 주어진된 시간 프레임 및 3) 담가 크기에서 생성 하는 새끼의 수를 시간. 마지막으로, 후속 불 임 장애의 원인을 파악 하기 위해 실시 수 있는 연구의 유형에 대 한 권장 사항이 포함 되어 있습니다.

유전자 변형 쥐에 일을 반영 하는 대표적인 데이터 및 설명된 프로토콜 마우스를 말합니다. 그러나, 모든 포함된 프로토콜은 쥐에서 동등 하 게 유효 합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드를 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 미시간 주립 대학에 의해 승인 하 고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 실시 되었습니다.

1. 확인할 Pubertal 발병

1. 의류, 최소한 기관 지침에 따라, 그것은 깨끗 한 실험실 외 투 및 깨끗 한 장갑을 착용 하는 데 필요한. 항상 깨끗 한 장갑을 착용 하는 마우스를 처리 합니다.
2. 테이블에 패드를 배치 하 여 작업 영역을 준비 합니다.
   1. 패드를 위쪽으로 향하게 하는 그리드와 깨끗 한 마우스 케이지 상단을 놓습니다.
   2. 작업 영역에서 규모를 설정 합니다. 규모와 자체에 깨끗 한 500-1000 mL 비 커를 배치 합니다.
   3. 기록의 몸 무게와 preputial 분리, 질 또는 첫 번째 발 정기 작업 영역 옆에 있는 시트를 놓습니다.
3. 연구에 대 한 마우스를 식별 합니다. 사춘기에 도달할 때까지 pubertal 발병에 대 한 일상적인 검사를 수행 합니다. 연구를 통해 하루 중 같은 시간에 검사를 수행 합니다. 그러나 Pubertal 발병 빠르면 생 후 11-12 일¹⁹, 발생할 수 있습니다, 가장 실험적인 셋업에서 pubertal 발병 모니터링 시작 ~ 22 일.
4. 작업 영역 (단계 1.2)에 마우스 케이지를 놓습니다. 새 장을 열고 테이블에 뚜껑, 물병, 음식 홀더를 배치 합니다.
5. 남성 쥐에서 preputial 분리 결정.
   1. 마우스 꼬리를 잡고 있는 동안 단계의 1.2.1 깨끗 한 마우스 케이지 위에 놓습니다. 부드럽게 꼬리에 잡고, 마우스 ~ 5에 대 한 감 금 소의 그리드를 탐험 하자 s.
   2. 살짝 꼬리를 뒤로; 당겨 일반적으로 그것의 앞 다리와 눈금 들고 앞으로 이동 하는 동물 발생 합니다. 피부에 접근 다른 손으로 목과 귀를 닫습니다.
   3. 어깨와 목 엄지와 집게손가락 사이 느슨한 피부를 파악. 그것은 피부, 좋은 잡아 중요 하다 마우스 무의 머리 주위를 선회에서 되지 것입니다.
   4. 나머지 손가락으로 뒤에 피부를 잡아을 눌러 손에 대 한. 호흡, 혈액 흐름, 또는 손상 뼈, 근육 또는 피부를 방해 하지 않고 단단히 잡으십시오. 손의 손바닥 안에서 마우스의 뒷면을 지 원하는 하는 동안 마우스의 배꼽 노출 손을 설정 합니다.
   5. 자유 손으로 가볍게 눌러 다시 음 경 주위 피부를 강요 하지 않고. Preputial 분리에서 preputial 피부 슬라이드 뒤로 노출 귀 두 남 근 (그림 2A, 화살표 preputial 분리를 보여주는). Preputial 분리의 유무를 기록 합니다.
   6. 부드럽게 단계 1.2.2에서에서 500-1000 mL 비 커에 그것을 배치 하 여 마우스 무게 고 무게를 기록 합니다.
   7. 케이지 바닥에 비 커 0-2 cm를 개최 하 여 주택 장에 마우스를 다시 하 고 천천히 마우스를 허용 하는 비 커를 자체적으로 종료 팁. 물과 순 한 세제로 비 커를 깨끗 하 고 규모에 그것을 반환 하 고 규모를 taring 하기 전에 그것을 건조.
6. 여성 쥐에 질 구는 결정.
   1. 작업 영역 (단계 1.2)에 목화 공, 비 커와 메 마른 물 한 병을 놓습니다. 비 커에 물을 붓으십시오. 메 마른 물으로 목화 공을 축이다를 단계 1.2.1에서에서 케이지 상단 옆 넣습니다.
   2. 마우스 케이지를 작업 영역 (단계 1.2)에 놓고 꼬리의 기지에서 개최 하 여 케이지 상단 (1.2.1 단계)에 자사의 홈 장에서 마우스를 전송 합니다. 부드럽게 마우스의 앞으로 움직임을 장려 하기 위해 꼬리를 뒤로 잡아 당기십시오.
   3. 무료 손가락으로 엉덩이 지원 하면서 꼬리를 들어올립니다. 케이지의 상단와 접촉을 유지 하기 위해 hindlimbs를 허용 한다. 마우스를 너무 많이 이동, 단계 1.5.1-1.5.4에 설명 된 대로 손에 잡으십시오.
   4. 부드럽게 단계 1.6.1에서에서 물 습도 목화 공을 외 음부를 청소. 각 마우스에 대 한 깨끗 한 습도 면봉을 사용 합니다. 결정 질, 외 음부 검사 및 질은 완전히 오픈 여부 확인 (그림 2A, 여성 질 개통).
   5. 질 발생 한 경우 기록 합니다. 마우스 무게 고 단계 1.5.6-1.5.7에 설명 된 대로 홈 케이지를 반환 합니다.
7. 첫 번째 발 정기 첫 배 란의 지표로
   1. 작업 영역 (단계 1.2)에 살 균 물, 레이블이 지정 된 유리 슬라이드와 깨끗 한 팁 200 µ L 피펫으로 비 커를 배치 합니다.
   2. 1.6.2-1.6.3 단계에에서 설명 된 대로 여성을 잡아. 질에 살 균 물 ~ 50 µ L을 포함 하는 피 펫의 끝을 놓습니다.
   3. 부드럽게 소개 하 고 reabsorbing ~ 50 µ L의 물 2-4 회 하 여 질 벽에서 세포를 플러시. 레이블이 지정 된 유리 현미경 슬라이드에 피 펫 팁에서 콘텐츠 얼룩.
   4. 똑똑히 관찰 하는 10 배 또는 20 X 목표를 사용 하 여 명시 야 현미경에 세포 형태학 또는 얼룩 airdry ~ 1 h 시키고 다음 0.1% 메 틸 렌 블루 솔루션 (ddH₂O에에서 용 해)와 counterstain (그림 2B). Counterstain를 위한 0.1% 메 틸 렌 블루 솔루션으로 말린된 슬라이드 찍어 ~ 30 s. 슬라이드 어 1 h 동안 건조 하자.
   5. 10 X 20 X에서 밝은 분야 현미경에 1.7.4 단계에서 슬라이드를 확인 합니다. Estrous 주기 (그림 2B)의 4 가지 단계를 구분할 수 있는 세포 형태를 관찰 하 여 estrous 주기 (그림 2B)²⁰ 의 단계를 설정 합니다.
      참고: Metestrus 백혈구와 nucleated 상피 세포, 그리고 cornified 상피 세포 (그림 2B)에 의해 발 정기의 혼합물에 의해 cornified 편평 상피 세포와 백혈구, 백혈구에 의해 diestrus, proestrus의 혼합물에 의해 특징입니다. ²⁰.
   6. 몸 무게를 기록 하 고 단계 1.5.6-1.5.7에 설명 된 대로 그것의 가정 케이지를 마우스를 반환 합니다. 얼룩 질 날 때 마우스는 그것의 첫 번째 발 정기 (그림 2B)에 종료 됩니다.

2입니다. 바람직한 사육 실 조건

1. 사육 실 ~ 20-24의 온도 ° C, 습도 55 ± 10%, 그리고 균질 성 방 ~ 300-400의 강도의 빛 럭²¹바닥 위에서 약 1 m. 이 빛의 강도를 25-80 럭 스의 바람직한 중간 케이지 광도를 수 있습니다. 빛의 강도 테스트 하려면 빛 미터를 사용 합니다.
2. 실험을 통해 조명의 적절 한 타이밍을 위해 사육 방에 조명을 제어 하는 자동된 시스템을 사용 합니다. 빛과 10 h 어둠 (LD14:10)²¹14 h "여름 같은" 조건에 12 h 하루 (12 h 빛과 12 h 어둠, LD12:12)에서 설치류 범위에서 다 산을 평가 하기 위해 최적의 날 길이 조건.
3. 사육 케이지를 준비 합니다.
   1. 뚜껑, 물, 음식, 침구 및 번 식 쌍 당 중첩 깨끗 한 마우스 케이지를 준비 합니다.
   2. 섹스를 포함 하 여 모든 필요한 정보를 케이지 카드 작성의 출생, 마우스, 긴장과 때 짝짓기 설정 날짜 날짜.

3. 불 임 연구

1. 불 임 연구에 사용 될 동물을 식별 합니다. 동물 성적 성숙 (1 단계) 인지 확인 합니다. 마우스에 있는 불 임 연구를 설정 하려면 일반적으로 사용 되 나이 범위는 연령, 어디 성적 성숙 완료 된 가장 실험 조건에 나이 10-16 주.
2. 깨끗 한 테이블에서 단계 2.3에서 준비 사육 케이지를 놓습니다.
3. 캐치 마우스를 누르고 있습니다.
   1. 천천히 마우스 케이지에 gloved 손을 소개 합니다. 마우스의 장갑과 손 냄새에 적응을 허용 (~ 5-30 s), 시간의 짧은 기간에 대 한 감 금 소에 손을 두십시오. 바쁜와 육 포의 움직임을 피하십시오.
   2. 감 금 소의 바닥에 가까운 cupped 손에 낮은 고 천천히 쥐에 접근. 그들은 도망 됩니다. 그들은 손을 통해 실행, 엄지와 검지 손가락 사이 한 마우스의 꼬리를 함정.
   3. 2-3에 대 한 꼬리에 의해 마우스를 들어올립니다. 마우스를 더 이상 개최 하는 경우 꼬리를 지키고 고 꼬리에 보류를 유지 cupped 손에 마우스를 놓습니다.
4. 1 남자 및 그 후 여성 1 번 식으로 꼬리 (단계 3.3)으로 유지 함으로써 전송. 다 산 분석 결과를 설정할 때 암컷 같은 estrous 단계 인지 확인 합니다. 1.7 단계에에서 설명 된 대로 질 세 포진 검사를 수행 하 여 여성의 estrous 단계를 결정 합니다.
5. 케이지, 닫고 쥐 음식, 물, 중첩 물자를 갖도록 합니다. 케이지 카드 케이지 케이지 카드 홀더를 연결 합니다.
6. 주택 선반에 사육 케이지를 놓습니다. 다 산 연구의 전체 기간 동안 사육 케이지를 최대한 그대로 두고. 30 일 동안 불 임 연구를 실시 합니다. 각 breeding 쌍에 대 한 자세한 기록을 유지 하 고 1) 짝짓기를 설정 날짜, 2) 새끼 태어난 날짜 및 3) 새끼, 죽은 및 라이브 새끼를 포함 하 여 수 합니다. 연구를 통해 매일 쓰레기 검사를 수행 합니다.
7. 다 산 연장 30-60 일 더 없는 경우 또는 다 산에 약한 영향에 대 한 연구 단계 3.6에서 설정 됩니다.

결과

발표 결과 녹음 방송 요인 복 부 앞쪽 homeobox 1 (Vax1) 여기 라고도 heterozygote 쥐 (HET)¹³또는 Vax1 1 개의 대립 유전자에 몸 전체에서 삭제 된 두 개의 서로 다른 유전자 변형 마우스 모델에서 조건에 따라 GnRH 신경 세포²², 여기 조건부 코 (cKO)를 되 나 이내 삭제 되었습니다. 불 임 연구를 설정 하기 전에 모든 쥐에 pubertal 발병을 확인 하는 것이 중요입니다.

첫째, 하루와 질 및 preputial 분리에 무게는 설치 되었다. HET 마우스 질 및 preputial 분리 동일한 나이 및 무게 컨트롤 마우스에서 발생 (그림 3A 와

토론

쥐의 전반적인 복지²¹성공적인 불 임 분석 결과 대 한 중요 하다. 다 산 분석 결과 수행할 때 육체적으로 확인 하는 쥐에 매일이 스트레스를 일으킬 수로 중요 하다. 이들은 스트레스도 더 자주 케이지 변경을 하지 마십시오. 이상적으로 케이지 변화는 주당 1-2 회 더 이상 해질 것 이다. 어두운 단계 빛 노출 야행성 설치류에 번 식에 부정적인 영향을 미칩니다. 어두운 시간 동안 사육 방에 조명을 설정 하지 않습니다. 방에 항목 어두운 시간 동안 필요한 경우에, 희미 한 붉은 빛 조명을 사용 합니다. 또 다른 스트레스의 과도 한 냄새, 진동 또는 소음 연구의 일부 또는 전체에 대 한 물고기에 존재입니다. 스트레스를 완화 하 고 마우스 복지와 번 식을 개선 하기 위해, 소재 또는 다른 유형의 농축 중첩 마우스를 제공 합니다. 둥지 건물 마우스에서 중요 한 문제 이며 번 식 성공 증가. 둥지도 쥐를 숨기고 재생 장소를 수 있습니다. 잘 건강 하 고 잘 길 러 진 동물 품종, 따라서 그것은 높...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
멸균 면봉	피셔	22456885
표면 보호기	피셔	1420637
라이트 미터	VWR	21800-014
메틸렌 블루	Sigma-Aldrich	M9140
현미경 슬라이드	Genesee Scientific	29-101
옵티마우스 랙 케이지 포함	AnimalCare 시스템	C89100
물병 바구니	AnimalCare 시스템	C61011
필터 케이지 탑	AnimalCare 시스템	C78210
옵티미스 표준 피더	AnimalCare 시스템	C40100SG
케이지 카드 홀더	AnimalCare 시스템	C43251
케이지 카드	AnimalCare 시스템	M52010
병 Assambley	AnimalCare 시스템
침대 R'Nest Nesting	The Andersons	BRN4WSR
1/8" 옥수수 코브 침구	The Andersons	8B
표준 마우스 차우	Teklad	7904 (7004)
스케일	VWR	10205-004
폴리 프로필렌 비커	피셔	14-955-111F