इस प्रोटोकॉल को हटाने और फेफड़े के धमनी endothelial कोशिकाओं (PAECs) है कि हंस-Ganz कैथेटर के गुब्बारा सुझावों का पालन करते हुए वे सही दिल कैथीटेराइजेशन के दौरान फुफ्फुसीय धमनी में कील और रहने के लिए अनुयाई के शुद्धिकरण का वर्णन करता है रोगी के शरीर से हटाने के बाद गुब्बारा फुलाया ।
विकृतियों की एक किस्म फेफड़े के उच्च रक्तचाप के लिए नेतृत्व (पीएच), जो एक मतलब फुफ्फुसीय धमनी के रूप में परिभाषित किया गया है आराम पर 25 mmHg से अधिक दबाव । आगे निदान और पीएच प्रबंधन करने के लिए, रोगियों को दोहराया सही दिल catheterizations (RHC) से गुजरना जिसमें एक हंस-Ganz कैथेटर फुफ्फुसीय धमनी की एक शाखा में उन्नत है और एक गुब्बारे कैथेटर टिप कील करने के लिए फुलाया है । यह लेख एक प्रोटोकॉल जिससे फुफ्फुसीय धमनी endothelial कोशिकाओं (PAECs) को हंस के गुब्बारा युक्तियां से काटा जा सकता है-Ganz कैथेटर्स RHC के बाद, और एक विरोधी CD146 समानता कॉलम तकनीक के साथ शुद्ध ख्यात PAECs को शुद्धि को दर्शाता है । इन कोशिकाओं को फुफ्फुसीय vasculature endothelium की जैविक स्थिति के एक में सीटू स्नैपशॉट प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है hemodynamic RHC के दौरान प्राप्त माप पूरक । फसल और शुद्ध PAECs या तो सेल संस्कृति के लिए या प्रवाह cytometery के रूप में बाद में विश्लेषणात्मक परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
वर्तमान अमेरिका और यूरोपीय दिशानिर्देश फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप के निदान के लिए सही दिल कैथीटेराइजेशन की आवश्यकता होती है1. चिकित्सकों और इस रोग की इच्छा को समझने की मांग वैज्ञानिकों फुफ्फुसीय vasculature से जैविक नमूनों hemodynamic डेटा है कि RHC के दौरान इकट्ठे हुए है पूरक हैं । दुर्भाग्य से, फेफड़े संवहनी बायोप्सी के साथ जुड़े जोखिम बहुत अधिक है, और इसलिए फुफ्फुसीय vasculature के जैविक नमूने शायद ही कभी कर रहे हैं RHC के दौर से गुजर रहे रोगियों से प्राप्त की । जबकि बहुत अंतर्दृष्टि फुफ्फुसीय संवहनी cadaveric या explanted फेफड़ों से प्राप्त ऊतक से प्राप्त किया गया है, इन नमूनों पीएच रोग प्रक्रिया के जीवविज्ञान को प्रतिबिंबित करने में असमर्थ के रूप में यह एक जीवित रोगी में खुलासा हो रहा है । २०१३ में, हम पहली बार बताया कि फुफ्फुसीय धमनी endothelial कोशिकाओं (PAECs) RHC के दौरान हंस-Ganz कैथेटर के गुब्बारे टिप के साथ शारीरिक संपर्क द्वारा फुफ्फुसीय धमनी की शाखाओं से नंगा कर रहे हैं, और कैथेटर सुझावों से छोटी संख्या में बरामद किया जा सकता प्रक्रिया2के बाद ।
यह लेख हटाने और हंस के गुब्बारा युक्तियां से फेफड़े की धमनी endothelial कोशिकाओं (PAECs) के शुद्धिकरण के लिए हमारी तकनीक को दिखाता है सही दिल कैथीटेराइजेशन निंनलिखित Ganz कैथेटर्स । Heretofore, इस फसल तकनीक प्रदर्शन के लिए विधि साहित्य में अपर्याप्त विस्तार में वर्णित किया गया है प्रयोगशालाओं के बीच समान परिणाम सुनिश्चित करने के लिए तकनीक प्रदर्शन । इस अनुच्छेद के लिए इस कमी को दूर करना है, तकनीक के दृश्य प्रदर्शन की पेशकश कैथेटर युक्तियां के बेडसाइड संग्रह से शुद्ध CD146 + endothelial कोशिकाओं के अंतिम उत्पाद के लिए । इस तकनीक को पीएच के विभिंन etiologies के pathobiology में अनुसंधान को आगे बढ़ाने में सहायता, और संभवतः नए नैदानिक परख के विकास में परिणाम के लिए hemodynamic RHC के दौरान इकट्ठे हुए डेटा पूरक चाहिए ।
फुफ्फुसीय संवहनी चिकित्सा और अनुसंधान के क्षेत्र के लिए इस तकनीक का महत्व यह है कि यह सीटू में फेफड़े के endothelium के जीवविज्ञान का एक स्नैपशॉट के लिए पहुंच प्रदान करता है और इसके विपरीत में explanted या cadaveric फेफड़ों पर पहले अध्ययन, प्रतिनिधित्व नहीं करता है विषय के फेफड़ों के लिए एक समापन बिंदु । हाल ही में, हमें पता चला है कि एक विरोधी अपोप्तोटिक इन कोशिकाओं में मार्कर फेफड़े के उच्च रक्तचाप के अधिक ठीक phenotyping संबंधित किस्मों में उपयोगिता हो सकती है3। प्राप्त कोशिकाओं की उपज अपेक्षाकृत छोटा है, ~ 5000-25000 PAECs प्रति नमूना है, और इन कोशिकाओं को मुश्किल (लेकिन असंभव नहीं) संस्कृति के लिए कर रहे हैं । हमें विश्वास है कि चालाक चिकित्सकों और शोधकर्ताओं के लिए इन साथी तकनीकों के बीच तालमेल मिल जाएगा क्रम में फुफ्फुसीय संवहनी अनुसंधान, निदान और prognostics अग्रिम ।
इस लेख में वर्णित तकनीक सबसे अच्छा फुफ्फुसीय संवहनी endothelium का अध्ययन करने के लिए पिछले प्रयोगात्मक प्रतिमान के संदर्भ में सराहना की है । पिछले करने के लिए मनुष्यों से PAECs प्राप्त करने के प्रयास explanted/cadaveric5 फेफड़े और एक छोटी के लिए एक कैथेटर फुफ्फुसीय धमनी की बायोप्सी6में सक्षम विकसित करने का प्रयास करने के लिए सीमित किया गया है । के रूप में एक हाल की समीक्षा7में उल्लेख किया है, वर्तमान तकनीक फेफड़ों के ऊतकों को फसल से अपनी एक जीवित मानव से PAECs प्राप्त करने की क्षमता से प्रतिष्ठित है, और रोग की प्रगति में कई समय बिंदुओं पर ऐसा करने के लिए और/ तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक साथी तकनीक हाल ही में सूचित किया गया है जिससे प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs)4PAECs,5में transdifferentiated जा सकता है । इस तकनीक रोगी के प्रचुर मात्रा में संस्कृतियों का उत्पादन विशिष्ट PAECs और रोगी के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है, PAEC जीवविज्ञान पर विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि । इन फायदों के बावजूद ये IPSC-व्युत्पन्न PAECs स्थानीय microenvironment और रोगी-विशिष्ट आनुवांशिक पृष्ठभूमि के बीच की बातचीत के बारे में कोई जानकारी पेश नहीं कर सकते. हमारे स्वयं के समूह ने यह दृश्य प्रस्तुत किया है कि ‘ ‘ कैथ टिप ‘ ‘ और IPSC तकनीक के क्षेत्र8को आगे बढ़ाने में synergistic होने की संभावना है ।
इस वर्तमान और ऐतिहासिक संदर्भ के भीतर, इस तकनीक की सीमाओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए । सबसे पहले, यह ध्यान दें कि इस पद्धति से व्युत्पंन PAECs की पैदावार काफी भिंन हो सकते है महत्वपूर्ण है । संभवतः, रोगी-, रोग राज्य और चिकित्सक विशेष कारकों इस परिवर्तनशीलता में योगदान, के रूप में प्रोटोकॉल कदम है कि स्रोत सामग्री के प्रमुख नुकसान में परिणाम की उंमीद होगी शामिल नहीं है । 1 तालिका प्रतिनिधि CD146 + PAEC फसल की एक किस्म से दिखाता कैथेटर फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप और चिकित्सक ऑपरेटरों की एक किस्म के विभिंन रोग राज्यों के साथ रोगियों की एक किस्म से प्राप्त सुझावों का उपयोग । दूसरा, सेल पैदावार समग्र कम कर रहे हैं, और संस्कृति के लिए उनकी व्यवहार्यता हमारे हाथ में अभी तक कम साबित हो गया है । जब तक हम पहले PAECs की संस्कृतियों हो गया है1इस विधि का उपयोग कर, हम उन परिणामों के जनक कोशिकाओं का एक सबसेट के बचाव का प्रतिनिधित्व करते है मरने के नमूने के अधिकांश से दूर है और केवल रहकर हमारे हाथों में सफल । उदाहरण के लिए, यह असामांय नहीं है केवल कुछ दर्जन अनुयाई PAECs संस्कृति में सुबह एक के बाद एक फसल चढ़ाया गया है खोजने के लिए । अक्सर इन सूक्ष्म संस्कृतियों का विस्तार करने के लिए जीवित नहीं है । आगे काम करने के लिए एक तरह से है कि PAECs की व्यवहार्यता और संस्कृति में उनकी स्थिति को बनाए रखने के लिए रोगी के प्रचार-प्रसार के वांछित उद्देश्य विशेष PAEC फसल को प्राप्त करेगा में इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन की जरूरत है । अंत में, CD146 सकारात्मक चयन हम अनुकूलित किया है अंय CD146 के साथ संदूषण को बाहर नहीं कर सकते है + कोशिकाओं, जैसे endothelial कोशिकाओं4, pericytes, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और दुर्लभ CD146 + टी कोशिकाओं9,10परिचालित । फिर भी, इन कोशिकाओं को इस तरह से एकत्र नमूनों में संख्या में बहुत कुछ हो माना हैं, और CD146 इस प्रोटोकॉल के लिए काफी अधिक विशिष्ट है endothelial कोशिकाओं के अंय सेल मार्करों की तुलना में इस तरह के CD31 के रूप में (जो रक्त जनित की एक किस्म पर मौजूद है प्लेटलेट्स सहित कोशिकाओं11). किसी भी भविष्य में सुधार के उद्देश्य से सुधार उपज पर उनके संभावित नकारात्मक प्रभाव के खिलाफ संतुलित किया जाना चाहिए ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों की सुविधा है कि कई वर्षों में कैथेटर नमूने के सैकड़ों के प्रावधान के लिए उन्नत दिल की विफलता और Allegheny जनरल अस्पताल के फेफड़े के उच्च रक्तचाप सेवा के चिकित्सकों और समर्थन कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा इस पद्धति का अनुकूलन ।
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |