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방법 논문

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

7.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58355

⸱

2018년 8월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Sciences, Institute for Research in Biomedicine, Università della Svizzera italiana (USI), 2Graduate School of Cellular and Molecular Sciences, Faculty of Medicine, University of Bern, 3Institute of Computational Science, Università della Svizzera italiana (USI)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구에서는 선물이 인플루엔자 바이러스 감염 후 murine tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 이미징 및 세포 상호 작용 분석을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 호흡기 감염 시 면역 세포 역학을 공부 하는 연구자와 관련이 있을 것입니다.

초록

셀 또는 셀-병원 체 상호 작용에서 생체 내에서 의 분석 감염에 면역 반응의 역학을 이해 하는 중요 한 도구입니다. 2 광자 intravital 현미경 검사 법 (2 P-IVM) 이미지 수집 중에 생성 된 photobleaching를 최소화 하면서 생체, 깊은 조직에 세포 상호 작용의 관측을 허용 한다. 날짜 하려면, 다른 모델 2 P-IVM 림프 및 비 림프 기관에 대 한 설명 되었습니다. 그러나, 호흡 기관의 이미지는 동물의 호흡 주기와 관련 된 운동으로 인해 도전 남아 있습니다.

여기, 우리 2 P IVM를 사용 하 여 인플루엔자 바이러스에 감염 된 쥐의 면역 세포 상호 기도에 vivo에서 시각화 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 목적에 우리 외과 노출 및 호 중구 및 점 막 상피에서 수지상 세포 (DC)의 동적 이미지의 취득 다음, 기도의 삽 관 법을 포함 하는 사용자 지정 이미지 플랫폼을 개발 했다. 또한, 우리 인플루엔자 intranasal 감염 및 흐름 cytometric 분석 면역 세포의 기도에 수행 하기 위해 필요한 단계 자세한. 마지막으로, 우리 분석 neutrophil DC 운동 뿐만 아니라 그들의 상호 작용 영화의 과정. 이 프로토콜은 기도에서 세포 세포 상호 작용의 평가에 필요한 안정적이 고 밝은 4 D 이미지의 생성에 대 한 있습니다.

서론

두 광자 intravital 현미경 검사 법 (2 P-IVM) 실시간 이미징 세포 세포 상호 작용의 그들의 자연 환경1에서 발생에 대 한 효과적인 기술입니다. 이 방법의 주요 장점 중 하나는 다른 전통적인 이미징 기술을2에 비해 더 큰 견본 깊이 (1 m m 500 µ m)에서 세포질 과정의 학문을 허용 한다. 같은 시간에 두 광자 레이저에 의해 생성 된 두 개의 낮은 에너지 광자를 사용 하 여 일반적으로 이미지 수집 과정2와 관련 된 조직 사진 손상 최소화 합니다. 지난 10 년 동안 2 P IVM 여러 분야3,,45에서 세포 세포 상호 작용의 다른 유형을 공부에 적용 되었습니다. 이 연구는 특히 면역 세포, 그들의 높은 역동성과 다른 세포와 환경에 의해 발생 하는 신호에 따라 눈에 띄는 연락처의 형성에 의해 특징 조사에 관련 된 되었습니다. 2 P-IVM 또한 병원 체 및 호스트6간의 상호 작용을 공부에 적용 되었습니다. 실제로, 그것은 이전 표시 되었습니다 일부 병원 체 종류와 면역 세포, 방해, 결과적으로 면역 반응7사이의 연락처의 기간을 변경할 수 있습니다.

기도 점 막 첫 번째 사이트는 공 수 병원 체에 대하여 면역 반응을 생성8입니다. 따라서, vivo에서 이 조직에서 호스트 병원 체 상호 작용의 분석은 감염 시 호스트 방어 메커니즘의 개시를 이해 하는 것 중요 합니다. 그러나, 기도의 2 P IVM 이미지 수집의 과정을 타협 하는 동물의 호흡 사이클을 제작한 유물 때문에 주로 도전 이다. 최근, 다른 외과 모델 이미징 murine 기관9,10,,1112 및 폐13,14,15, 설명 되었습니다. 16. Tracheal 2 P-IVM 모델 폐 포 2 P IVM 모델은 더 적당 한 감염의 늦은 단계를 공부 하는 동안 위의 기도에 면역 반응의 초기 단계를 시각화 하는 우수한 설치를 나타냅니다. 개발된 폐 모델 제시는 레이저의 광 침투를 제한 하 고 intrapulmonary 기도의 점 막 층을 vivo에서 17 이미징에 대 한 액세스할 수 있도록 공기 채워진 폐 포의 존재와 관련 된 제한 . 반대로, 연속 상피에 의해 형성 된 기관지의 구조는 이미지 수집을 촉진 한다.

여기, 우리가 현재 인플루엔자 감염, 동물, 수술 준비와 기도의 2 P IVM 수행 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 포함 하는 프로토콜. 또한, 우리는 호 중구 및 모 수석 세포 (DC), 인플루엔자 바이러스18,19에 대 한 방어 메커니즘의 중재자로 중요 한 역할을 재생 하는 두 개의 면역 세포 유형의 시각화에 대 한 특정 실험 설정 설명 . 마지막으로, 우리는 neutrophil DC 상호 작용을 분석 하는 절차를 설명 합니다. 이 연락처 DC 활성화 변조 표시 되었습니다 및, 그 후, 병원 균20에 대 한 면역 반응에 영향을 미칠.

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프로토콜

모든 동물 절차 관련 된 마우스 스위스 연방 수의 관리 지침 및 동물 프로토콜 수행 된 현지 수 의사 당국에 의해 승인 되었다.

1. 인플루엔자 감염 CD11c YFP 마우스의

  1. Biosafety
    참고: (PR8) A/Puerto 토 리코/8/34 H1N1 인플루엔자의 마우스 적응 변형 수정 된 난 자에서 성장, 정화 되었고 앞에서 설명한21로 적정. 모든 감염된 한 동물 또는 생물 학적 샘플 단계 실시 biosafety biosafety 수준 (BSL)에 따라 캐비닛 아래 2 조건.
    1. 감염 절차 전후 70% 에탄올 솔루션 biosafety 내각을 청소.
    2. 적절 한 누가 biosafety 지침 (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf)에 따라이 절차 동안 생산 하는 모든 폐기물을 폐기. 멸 쓰레기통에 고체 폐기물 및 비닐 봉지 가득 70% 에탄올 솔루션 또는 의료 살 균에에서 오염 된 액체를 삭제 합니다.
  2. 인플루엔자 intranasal 감염
    참고: B6. Cg-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c YFP)22 C57BL/6J 배경에이 연구에 사용 되었다. 마우스는 특정 병원 체-무료 시설에서 연구를 위한 학회에 의학에서 유지 되었다.
    1. 감 금 소 당 최대 5 나이 및 성별-일치 (6 8 주 오래 된에) CD11c YFP 마우스를 놓습니다. 최소한 이틀 전에 감염 절차 주택 조건에 쥐 새 환경 순응에 대 한 기다립니다.
    2. PR8 주식에 서 리 없애다 30 µ L. 계속 바이러스 희석에서 감기 1 x Dulbecco의 인산 염 버퍼 수정 염화 칼슘과 염화 마그네슘 (PBS) 200 플 라크 형성 단위 (PFU)의 최종 농도를 사용 하 여 해당 희석을 준비 하 고 에 모든 절차 동안 얼음.
      참고: 그것의 사용 이전에 인플루엔자 바이러스의 모든 배치의 적정 정확한 감염 복용량 되도록 것이 좋습니다.
    3. Intraperitoneally 케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복용량을 주사 (i.p.) 26 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여.
    4. 마우스는 완전히 마 취 (righting와 페달 철수 반사의 완전 한 손실) 될 때까지 기다립니다. 아니 완전히 마 취 쥐 제비 것 또는 변화 감염 복용량에 선도 바이러스 inoculum을 추방 이후 깊은 마 취는 최적의 감염, 필요 합니다.
    5. 부정사 위치에 마 취 마우스를 놓습니다. 바이러스 inoculum의 15 µ L를 수집 합니다. 마우스 왼쪽된 콧구멍에 가까운 피 펫 팁 놓고 바이러스 inoculum 드롭 하 여 분배 합니다. 방울을 흡입 해야 합니다로 할 하지 플라스틱 그들 직접 캐비티 내부에 코.
    6. 2-5 분을 기다려 하 고 오른쪽 콧구멍에서 바이러스 inoculum의 나머지 15 µ L을 포함 하는 피 펫 팁을 배치.
      참고: 질 식 하지 않으려면, 약 20 s 간격에 작은 크기의 방울을 분배.
    7. 마우스 올바르게 호흡을 확인 하 고 옆 decubitus에 감 금 소에 배치. 마우스 호흡 마 취 회복 (유도 후 약 60 분)를 모니터링 합니다.
      참고: 그것은 동시에 1 이상의 마우스를 감염 수 있습니다. 이 경우 시퀀스에 있는 모든 쥐의 왼쪽된 콧구멍에서 바이러스 inoculum을 관리 하 고 2-5 분을 기다리는 다음 오른쪽 콧구멍에서 바이러스 관리. 개인 사이 가변성을 방지 하려면 동시에 더 이상 3 쥐를 감염.
    8. 동물의 건강 상태와 체중 감량을 매일 모니터링 합니다.
    9. 기관 지침에 의해 결정 하는 인간적 끝점에 따라 마우스를 안락사 안락사 방법은 동물 실험 기관에 의해 승인을 받아야 하며, 현지 윤리 규정을 존중해 야 합니다. 2 광자 실험 후 케 타 민/xylazine 뒤에 자 궁 경부 전위의 과다 복용의 행정에 의해 마우스를 안락사. 모든 다른 실험에서 CO2 흡입 안락사에 대 한 방법으로 사용 합니다.
      참고: 감염 된 기관, 50% 조직 문화 감염 복용량 (TCID50) 분석 결과 또는 실시간 중 합 효소 연쇄 반응의 바이러스 titers 측정 하 (RT-PCR) 분석 결과 앞에서 설명한23으로 수행할 수 있습니다.
  3. Cytometry에 의해 기관지에서 호 중구 채용의 평가
    참고: 프로토콜의이 부분은 선택 사항입니다. 그것은 인플루엔자 감염 다음 tracheal 점 막에서 호 중구 모집을 평가 하는 것을 목표로.
    1. CO2 흡입에 의해 3 일 후 감염 (탐정)에 감염 되 고 감염 되지 않은 컨트롤 마우스를 안락사.
      참고: tracheal 손상을 방지 하기 위해 동물을 안락사를 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 피하십시오. 또한, 안락사 쥐의 관류는 혈액 호 중구에서 오염을 방지 하는 것이 좋습니다.
    2. 70% 에탄올 솔루션 마우스 목 스프레이 하 고 가슴에서 턱을 수술가 위를 사용 하 여 피부 절 개를 수행 합니다.
    3. 집게를 사용 하 여 침 샘 하 고 기도 노출 합니다.
    4. 집게와가 위를 사용 하 여 기관지 주위 근육 해 부.
      참고:이 단계가 수행 되어야 합니다 신중 하 게 기도 절차 동안 쉽게 손상 될 수 있기 때문.
    5. 집게와 함께 기도 누른 조심 스럽게 절 개 식도 분리.
    6. 집게와 기도의 intrathoracic 부분을 잡고, 기관지 나무의 시작 부분에 절 개를 확인 합니다. 다음 후 두에서 기관지를 분리 하 고 왼쪽의 모든 근육을 조심 스럽게 제거.
    7. 포함 된 RPMI 1640 + 얼음에 HEPES 매체 (RPMI) 1.5 mL 튜브에 장기를 놓습니다.
    8. 콜라 (I 및 II)의 0.26 단위/mL과 0.2 mg/mL DNase의 포함 된 기관 소화 효소 혼합물 준비 RPMI에 나.
    9. 해 부 기도 효소 혼합물의 1 mL를 포함 하는 6-잘 접시에 놓습니다.
    10. 기관 집게와가 위의 도움으로 작은 조각으로 잘라. 이 단계 동안 얼음에 플레이트를 유지.
    11. 45 분 동안 37 ° C에서 품 어. 이 시간 동안 접시 마다 15 분 흔들.
    12. PBS에서 FACS 세척 버퍼 (2 mM EDTA와 2% 열 비활성화 필터 살 균 태아 둔감 한 혈 청 (FBS))의 1 mL을 추가 하 여 효소 소화를 중지 합니다.
    13. 1 mL 피 펫을 조직의 부분적으로 소화 되지 않은 조각 끊을 수 있도록 솔루션 resuspend
    14. 40 µ m 스 트레이너를 통해 콘텐츠를 전달 하 여 솔루션을 다른 영역 전송. 그런 다음, 부드럽게 2 mL 주사기 플런저를 사용 하 여 여과기 위에 갇혀 오르간의 나머지 조각 분쇄.
      참고: 흐름 cytometric 분석 하는 동안 셀의 최적 수를 얻기 위해 중요 한 단계는 스 트 레 통해 기관지의 부분적으로 소화 되지 않은 조각 스매싱.
    15. 워시 우물 및 FACS 세척 여과기 버퍼 전송 5 mL 튜브에 서 스 펜 션은 얼음에 보관.
    16. 166 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 관을 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 세척 버퍼의 100 µ L에 셀.
    17. Cytometry에 대 한 항 체 표면 얼룩과 진행 합니다. 간단히, CD16/32, 뒤에 표면 얼룩에 대 한 항 체를 사용 하 여 격리 된 세포의 Fc 수용 체를 차단 합니다. 중 성구를 제대로 식별 하려면 흐름 cytometry 패널 다음 항 체를 포함 해야 합니다: 죽은 세포를 제외 하는 생존 능력 뿐만 아니라 αLy6G, αCD11b, αCD45, 염료.
    18. 교류 cytometer에 샘플의 전체 콘텐츠를 실행 하 고 데이터를 분석.
      1. 면역 세포의 최적 수를 얻으려면 단일 셀 서 스 펜 션 높이 3000 이벤트/s 보다 빠른 속도로 실행 합니다. 이 이벤트는 중 제외 수를 줄일 것입니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 그것은 기관 당 셀 1에 2 백만 얻기 위해 가능 해야 합니다.

2. 절연 및 호 중구의 주입

참고:이 절차에서는, B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J 쥐 (CK6-ECFP) 사용된24했다. 이 동물 인간의 β-말라 발기인에 따라 모든 셀 형식에 CFP를 표현 한다. 또는 그것은 또한 세포를 격리 하 여 단계 2.6에에서 설명 된 프로토콜에 따라 얼룩 C57BL/6J 마우스를 사용 하 여. 정화와 호 중구의 조작 잠재적으로 그들의 철새 및 기능 속성을 변경, 그들의 활성화 상태를 증가할 수 있습니다.

  1. CO2 흡입 하 여 동물을 안락사.
  2. 화관과 tibias 제거 하 고 부드럽게 그들을 청소 집게를 사용 하 여.
  3. 뼈 epiphyses 고 얼음에 보관 50 mL 튜브에 살 균 차가운 PBS 가득 1 mL 주사기를 사용 하 여 골을 플러시.
  4. 18 G 바늘 셀 resuspend 고 40 μ m 스 트레이너와 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 110 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 PBS를 가진 한 번 세척 하 고 차가운 PBS의 2 mL에 셀 resuspend.
  5. 100% 희석 Percoll 9:1 10 x PBS에서 72%, 64%, 52 %1 x PBS를 사용 하 여 percoll의 그라데이션 솔루션을 준비 하 고. 조심 스럽게 2 mL 각 15ml 튜브에서 3 그라디언트 레이어, 하나 집중 가장에서 시작.
    1. 가속 및 브레이크 없이 실 온 (RT)에서 30 분 동안 1100 x g 에서 그라디언트 및 원심 분리기 골 수 세포 현 탁 액의 신중 하 게 2 개 mL를 추가 합니다.
  6. 조심 스럽게 64%와 72% 사이의 인터페이스에서 밴드를 제거 하 고 차가운 PBS와 4 ° C에서 5 분 동안 200 x g 에 한 번 씻어. PBS의 100 μ의 볼륨에 셀 resuspend 하 고 얼음에 그들을 유지. 호 중구의 순도 90% 보다 높을 것으로 예상 된다.
  7. 필요에 따라 레이블 호 중구 세포 확산 키트 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여. 1 mL의 볼륨에서 10 μ M의 최종 농도에 세포 현 탁 액을 염료를 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 세척 (166 x g, 5 분).
  8. 세포 농도 hemocytometer를 사용 하 여 추정 하 고 정 맥 5 x 106 셀 26 G 바늘 1 mL 주사기, 이미징 하기 전에 12 h를 사용 하 여 이전 감염된 CD11c YFP+ 마우스에서 100 μ의 최대 볼륨을 주입.

3. 영상에 마우스를 준비

  1. 마 취
    1. 1.2.3 단계에 따라 주 3 탐정에서 감염된 CD11c YFP+ 마우스 anesthetize
    2. 쥐 취 깊이 일단 마 취는 다시 먹이 지에 대 한 카 테 터를 준비 합니다.
      1. 집게를 사용 하 여 주사기에서 30g 바늘을 제거 합니다.
      2. PE 10 의료 실리콘 튜브 20 cm 조각에 바늘을 삽입 합니다.
      3. 튜브의 다른 쪽에 케 타 민/xylazine 혼합물으로 채워진 30 G 바늘 주사기를 삽입 합니다.
      4. 튜브 내부 공기를 제거 합니다.
    3. 20g 카 테 터 (그림 1A나) 자동된 환기를 유지 하는 산소 insufflating 기계에서 튜브에 연결을 준비 합니다. 100% 산소 가스 공급을 사용 하 여 0.2 mL의 해 양으로 130 분당 (b.p.m.)의 호흡 비율에 그것을 설정 합니다.
  2. 수술에 대 한 마우스를 준비
    1. 열띤된 접시 또는 수술의 모든 시간에 대 한 37 ° C에서 설정 온수 외과 벤치 특정 사용자 지정 된 외과 보드 (그림 1Aⅱ-3)에 마우스를 유지.
    2. 전기 면도기와 depilatory 크림을 사용 하 여 마우스의 목에서 머리를 면도 (그림 1B나).
    3. 위치 플라스틱 마우스 위에 마우스를 놓습니다 (그림 1Aii-a), 유지은 위치 외부 동물 머리 (그림 1Bii) 기관 삽 관 법을 용이 하 게 하는 각도 만들려고.
    4. 외과 테이프와 앞 발, 발, 꼬리를 해결 하 고 농축 비타민 A 젤 마우스 눈을 축 축 하 게 마우스 목 (그림 1Bii) 소독.
  3. 수술
    1. 제대로 압력가 항목, 즉,가 위, microsurgical가 위와 집게를 준비 합니다.
    2. 목, 약 1 ㎝ 길이, 상단의 가슴 및 mandible (그림 1Biii)의 낮은 지점을 통과 하는 선 사이의 중간 영역에서의 긴 중간 축에 작은 절 개를 수행 합니다.
    3. 피부 패치 및 침 샘 옆으로 이동 하 고 근육에 의해 덮여 기도 시각화. 그런 다음, 집게 (그림 1Biii)를 사용 하 여 신중 하 게 tracheal 근육 해 부.
    4. 카 테 터와 마우스를 넣어야 하 고 인공 환기 (그림 1Biv)를 시작 합니다.
      참고: 테 tracheal 점 및 내부 철 바늘 보호 외부 플라스틱 부품의 구성 됩니다. 바늘의 존재는 확장 하 고 기도 안정화 하 고 그것의 박람회를 규제 하는 이상적인 솔루션을 나타냅니다. 카 테 터를 통해 인공 환기는 마우스의 적절 한 호흡을 보장할 것 이다.
    5. 즉시 인공 환기 호흡 모니터를 시작 합니다.
    6. 카 테 터 높이 방향을 외과 보드 (그림 1Aii b) 특정 막대에 연결 된 외과 후크 (그림 1Bv)를 사용 하 여 수정 합니다. 턱의 같은 높이에서 기관지를 노출 합니다.
    7. 석유 젤리와 기도 둘러싸 자 고 보장 기관 (그림 1Bvi)에 적절 일 분을 미리가 열된 PBS의 몇 방울으로 그것을 커버.
    8. 준비 위에 coverslip을 탑재 합니다. 이 단계에 대 한 XYZ 번역기 (그림 1Aii-c)을 나사로 죄 어 질 것 이다 금속 홀더 (그림 1Bvii)에 coverslip 접착제. 수술 준비 위에 coverslip를 XYZ 번역기를 조정 합니다.
    9. Intraperitoneally는 마 취의 관리에 대 한 카 테 터를 놓습니다 (그림 1B8 조).
    10. 케 타 민/xylazine 혼합 매 30 분의 초기 복용량의 50%를 주사.
      참고: 안전 하 고 유효한 다른25는 초기 케 타 민/xylazine 혼합물의 25 %50 %에서 다시 먹이 지. 그러나,이 프로토콜은 터미널 전체 절차 동안 동물의 엄격한 동원 정지는 필요 때문에, 마 취의 깊은 수술 평면을 유지 하기 위해 더 높은 복용량을 사용 합니다.

4. 생체 내에서 시간 경과 영상

참고: 이미지 수집 2 Ti:Sa 레이저, 외피 온도-제어 약 실, 및 25 X, 직 립 2 광자 현미경으로 수행한 나 1.1 집중 목적 물 /. 이미지 수집에 사용 되는 photomultipliers (PMT) 하이브리드 감지기 또는 높은 감도 GaAsP 했다.

  1. 챔버 내부에 현미경 인큐베이션 (사전 37-38 ° C에 온수) 마 취 마우스와 함께 외과 보드를 놓고는 coverslip에 물 한 방울을 추가 합니다.
  2. 센터 및 찾기 tracheal 조직에 초점입니다.
  3. 520 x 520 픽셀, 440 x 440 μ m2 의 시야 800 hz, 스캐닝 주파수를 설정 하 고 줄 평균 1.
    1. 조정 Ti:Sa 레이저 830 nm 콜라겐, 150의 소스에서 나타내는 힘에서 둘째로 고조파 생성 (SHG)를 자극 mW. 920에서 두 번째 Ti:Sa 레이저 조정 94 nm 소스, CFP와 YFP 자극에 mW.
    2. 3D 및 동시 여기 timelapse 획득 모드
      참고: photobleaching 및 phototoxicity을 최소화 하기 위해 가능한 한 낮은 레이저 파워를 계속.
  4. 비 descanned 모드, 560에서 마스터 dichroic 거울에에서 두 개의 채널을 사용 하 여 레코드 형광 nm. 이 프로토콜에 사용 되는 설정, 두 번째 dichroic 거울 분할 495에서 신호 분리 nm 채널 1 (방출 필터 475/50) 채널 2 (배출 필터 525/50)에서 (그림 2A). 이 구성 CFP 방출 두 채널 1과 2에에서 수집과 YFP 채널 2에만 수집 하는 동안 SHG 첫 번째 채널에 콜라겐에서 빛을 수집 합니다.
  5. 3 μ m (복 크기 0.86 ㎛ x 3 μ m)의 단계 크기는 Z 축 범위 50 μ m를 정의 합니다. 기록 이미지 매일 30 30 분의 총 시간에 대 한 s.
  6. 원하는 경우, 여러 영역을 취득 합니다. 더 많은 인수를 실행 하기 전에 생체 신호를 확인 하 고 reinject (단계 3.3.10 참조) 필요한 경우 카 테 터를 통해 마 취.
  7. 이미징 프로세스의 끝에, 케 타 민/xylazine 과다 자 궁 경관 탈 구 다음을 통해 마우스를 안락사.

5. 이미지 Neutrophil DC 운동 성 및 상호 작용의 처리 및 정량 분석

참고:이 프로토콜에 전문된 이미징 소프트웨어 현미경 데이터를 분석 하는 데 사용 되었다.

  1. 4 D 이미지 수집 완료 후 충분 한 계산 리소스를 가진 워크스테이션에 (데이터 및 메타 데이터) 파일을 전송 (최소 시스템 요구 사항을 제안: 32 기가바이트 RAM, 빠른 solid-시-드라이브, 최근 CPU, GPU에 따라 전용 한 대규모 병렬 아키텍처)입니다.
  2. 이미징 소프트웨어에 파일을 엽니다.
  3. 비디오를 재생 하 고 관심사의 세포 명확 하 게 표시 하 고 이미징 아티팩트 결 석 하다.
    참고: 이 샘플 움직임 밝기 변화 모두는 충분히 국한 하는 것을 확인. 사실, 자동 분석26에 대 한 도전을 나타냅니다. 인접 한 프레임 간의 샘플 운동의 과도 한 경우에, 예를 들어 SHG 채널을 참조 하 여 고정 드리프트 보정 방법 적용. 그러면 더 나은 측정 하는 세포의 움직임 보다는 샘플의 움직임. 또한, 밝은 배경이 나 파편의 존재는 선택 매개 변수로 서 볼륨을 사용 하 여 복원된 표면 가지 치기.
  4. CFP와 콜라겐 (SHG) 신호를 분리 하기 위하여 CFP+ 세포에 대 한 공동 지역화 채널 특정을 생성 합니다. 이 위해, 제어 다각형을 (그림 2B나) 녹색 채널와 파랑 채널에 긍정적인 강도 갖는 복만을 선택 하는 나타냅니다.
    참고:이 절차는 현미경의 필터 집합 및 셀의 얼룩 달라질 수 있습니다. 그것은 녹색 및 파랑 채널에 충분 한 강도 가진 복만을 선택 하 여 얻을 수 있습니다. 사용 가능한 도구 중 강도 임계 처리에 따라 colocalization 채널을 자동으로 계산을 "coloc" 기능을 사용할 수 있습니다. 또한, 기계 학습 기반 방법 전문가27의 감독으로이 단계에 대 한 사용할 수 있습니다.
  5. 검색 및 c f P+ 세포, 자동 표면 재구성을 사용 하 여 및 적절 한 공동 지역화 채널을 통해 (표면 도구)을 추적 추적.
    참고: 최종 추적 오류 수동 변호사 및 트랙 (즉, 150 s) 정의 된 임계값 보다 짧은 기간을 제외 해야 합니다.
  6. CFP와 YFP 신호를 분리 하기 위하여 CD11c YFP+ 세포에 대 한 공동 지역화 채널 특정을 생성 합니다. 이 위해, 녹색 채널에 긍정적인 강도 하지만 파랑 채널에 낮은 강도 갖는 복만을 선택 하는 제어 다각형을 (그림 2Bii)을 나타냅니다.
    참고: 신호를 채널 1, 채널 2, CFP에 대 한 공동 지역화 채널, YFP에 대 한 공동 지역화 채널 모든 채널의 조합을 보여주는 대표적인 현미경 그림 2Biii에서 찾을 수 있습니다.
  7. CD11c YFP+ 세포의 표면 재구성 하 고 시간 (표면 도구)에 그들의 위치를 추적 합니다.
    참고: 최종 추적 오류 수동 수정이이 단계에 대 한 필요 하지 않습니다. 실제로, DC의 복잡 한 역학 spatio 시간적으로 사용할 수 있는 세그먼트화 소프트웨어와 함께 얻을 수 없는 도전적인 작업입니다 2 P IVM 데이터에서 그들의 정확한 표면 재구성. 이 작업을 도전 하는 이유, 사이 얇은 돌출 및 밝기 변화 허용 하지 않습니다 필터 되거나 정적 임계 처리와 같은 특정 이미지 처리 기술의 사용에 대 한. 또한, DC의 네트워크, 그것 어렵다 2 P IVM 데이터에 그들의 외관에만 기반으로 하는 단일 세포를 분리. 이러한 이유 보다는 소프트웨어 매개 변수를 조정 하 여 정확한 세분화를 시도, DC의 비 정확한 표면 재구성을 제안 한다. 그런 다음 5.8에 설명 된 대로 강력한 통계를 사용 하 여 가능한 오류를 처리.
  8. 측정 셀 마이그레이션.
    1. C f P+ 와 CD11c YFP+ 세포에 대 한 고전적인 마이그레이션 조치를 내보냅니다. 이 사이 "트랙 속도 평균" 셀의 방향을 나타냅니다 "추적 직진도" 셀의 평균 이동 속도 나타냅니다. 이러한 조치는 이미징 소프트웨어에서 스프레드시트 파일로 내보낼 수 있습니다.
    2. 내보낸된 스프레드시트 파일에서 "수정 된 트랙 직진도" (수정된 감 금 비율 라고도 함) 계산 CFP+ 와 CD11c YFP+ 세포는로 정의 됩니다 "트랙 직진도"의 제곱근을 곱한 비디오 기간의 제곱근으로 나눈 "추적 기간". 이 측정은 "" 짧은의 직진도 추적 추적28, 예를 들어 추적 오류에서 발생 하는 보다 더 강력한입니다.
      참고: 동일한 길이의 동영상만이 측정으로 비교할 수 있습니다.
  9. 세포 상호 작용을 측정 합니다.
    1. 그들의 거리 (가까운 복) 임계값 (즉, 2 μ m) 보다 더 적은 또는 동등한 경우 CFP+ 세포와 CD11c YFP+ 세포 사이 접촉을 정의 합니다.
      참고:이 임계값 충분히 엄격한 셀 가까운 위치에 있는 경우에 연락처를 검색 해야 합니다. 그러나, 우리는 이상적으로 N 번 복 반경 보다 큰 0 보다 큰이 임계값을 계속 격려 (N > 2), 테두리 부드럽게 만들 수 있는 세포의 재구성 실제 셀 크기 보다 작은 있기 때문에.
    2. 수와 CFP+ 와 CD11c YFP+ 세포 사이 접촉의 기간을 계산 합니다. 이미징 소프트웨어에이에 "키스 하 고 실행" 플러그를 실행 하 여 예를 들어 할 수 있습니다. 이러한 조치는 통계 탭에서 스프레드시트 파일로 내보낼 수 있습니다.
  10. 통계 소프트웨어의 이전 계산된 측정값을 가져올, 플롯을 생성 하 고 통계 시험을 수행.

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결과

이 작품에서 우리 상세한 프로토콜 vivo에서 공부 하는 운동 성 및 호 중구 및 DC 간의 상호 작용 동안 설명 murine 기도 (그림 3A)에 인플루엔자 감염. 이 목적에 우리 고립 CFP+ 호 중구 (92% 순도; 그림 3B) CK6 ECFP에서 마우스와 우리 adoptively 전송 그들 독감 감염 CD11c YFP 마우스에. 그 후, 우리는 2 P-IVM 하루 3 탐정에서 기도의 수행 이 시간 지점에서 흐름 cytometric 분석 (그림 3C)와 같이 감염된 지역에서 호 중구의 명확한 모집을 관찰 합니다. 2 P-IVM 프로토콜 설치류 (그림 1A)에 대 한 특정 외과 보드 및 산소 공급의 사용을 요구 한다. 기...

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토론

이 작품 마우스 기도에 인플루엔자 감염 시 adoptively 전송 된 호 중구 및 DC와 그들의 상호 작용의 마이그레이션을 보여주는 4 D 이미지의 생성에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 설명된 2 P-IVM 모델 기도에 감염 시 면역 세포 역학 연구와 관련이 있을 것입니다.

최근, 기도에 셀 역학의 시각화를 기반으로 여러 모델 개발된9,10,11,12,,1314,15 되었습니다. ,16. 그러나...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 스위스 국립 재단 (SNF) 보조금 (176124, 145038, 및 148183), 유럽 위원회 마리 퀴리 재통합 부여 (612742), 및 D.U.P. 부여에 대 한 SystemsX.ch에 의해 지원 되었다 (2013/124).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Gigasept instru AFSchü LKE & Mayr GmbH4 % 용액
CD11c-YFP 마우스Jackson Laboratories008829마우스는 사내에서 사육
CK6-ECFP 마우스Jackson Laboratories004218마우스는 사내에서 사육되었습니다
1x Dulbecco의 인산 완충 식염수는 칼슘 Choride 및 염화마그네슘없이 변형Sigma D8537-500ML
칼슘 코라이드와 마그네슘 클로라이드 없이 수정된 10x Dulbecco의 인산염 완충 식염수SigmaD1408-500ML
Percoll PLUSSigmaE0414-1L4°에서 보관; C
Ketamin Labatec LabatecPharma7680632310024RT의 4 °에 저장; C ket / 크실 혼합물
Rompun 2 % (Xylazin)Bayer6293841.00.00RT에 저장, 4 °C에 저장; C ket / xyl 혼합물
26 G 1 mL Sub-Q BD PlastipakBD Plastipak305501
30 G, 0.3 mL BD 마이크로 파인 인슐린 주사기BD324826
Falcon 40 µ의 용액에있을 때; m 세포 여과기Corning352340
2 mL 주사기BD Plastipak300185
Microlance 3x 18 G 바늘BD304622
Introcan Safety 20 G (카테터)Braun4251652.01
6 Well Cell Culture ClusterCostar3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x)ThermoFisher Scientific42401-0184°에 저장; C
Liberase TL 연구 등급Roche5401020001-20 °에 저장; C / 콜라겐 분해 효소 (I 및 II) 혼합물
DNAse IAmresco (VWR)0649-50KU-20 ° C
CellTrace 바이올렛 염색ThermoFisher ScientificC34557-20°C에서 보관 & deg; C
EDTASigmaEDS-500G
태아 소 세럼Gibco10270-106-20 °에서 보관; C
PE-10 마이크로 의학 배관2Biological 계기 SNC#BB31695-PE/1
외과 플라스틱 테이프M Plast
ViscotearsBausch & LombStore at RT
PlasticineOhropax
High tolerance Glass Coverslip 15mm RoundWarner Instruments64-0733
SomnoSuite 휴대용 동물 마취 시스템Kent ScientificSS-01
Nuvo Lite mark 5GCE medline14111211
MiniTag (기체 마취 및 가열 벤치)Tem Sega
SURGICAL BOARD베른
TrimScope II, 이광자 현미경LaVision, Biotec
Chameleon Vision, Ti:Sa 레이저,Coherent, Inc.
25X NA 1.05 침수 대물렌즈올림푸스XLPLN25XWMP2
The Cube& The Box 인큐베이션 챔버 및 온도 컨트롤러Life imaging Services
Imaris 9.1.0Bitplaneimaging software
GraphPad Prism 7GraphPadStatistical software
되었습니다 되었습니다 , 대학교, ,

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