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방법 논문

식물 반응 산소 종에서 Vivo에서 음이온 세 륨 산화물 나노 입자의 촉매 청소

8.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58373

⸱

2018년 8월 26일

 ,  ,  , 
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 선물이 vivo에서confocal 현미경 검사 법, 그리고 비보에 의해 식물 조직에서 이미징 nanoceria 청소 합성 및 선생님 (반응성 산소 종)에 대 한 세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria)의 특성에 대 한 프로토콜 nanoceria 선생님 confocal 현미경 검사 법에 의해 청소의 모니터링.

초록

반응성 산소 종 (ROS) 축적 식물 abiotic 스트레스 반응의 특징 이다. 선생님 신호 수준 낮은 분자 및 높은 수준에서 분자를 손상 하 여 식물에는 이중 역할을 재생 합니다. 스트레스 식물에 선생님의 축적 대사, 효소, 지질, 및 식물 성장과 수확량의 감소를 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 수 있습니다. 세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria)의 능력을 촉매로 선생님에서 vivo에서 청소는 독특한 도구 이해를 bioengineer 공장 abiotic 스트레스 관용을 제공 합니다. 여기, 선물이 합성 및 폴 리 (아크릴) 산 성 코팅된 nanoceria (PNC) 특성화, 식물 잎 lamina 침투를 통해 나노 인터페이스 및 그들의 분포와 선생님에서 vivo에서 confocal 사용 하 여 청소 하는 프로토콜 현미경 검사 법입니다. 식물에 선생님 축적을 조작 하기 위한 현재 분자 도구 모델 종으로 제한 하 고 힘 드는 변환 방법이 필요로. Vivo에서 선생님 청소에 대 한이 프로토콜 애기 thaliana같은 잎 구조와 넓은 잎 야생 타입 식물에 적용 될 가능성이 있다.

서론

세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria) 생물 공학 능력1,,23청소의 독특한 촉매 반응성 산소 종 (선생님) 때문에 기초 연구에서 널리 사용 됩니다. Nanoceria는 두 산화 상태 (Ce3 + 및 Ce4 +) 4,,56사이 대체 표면 산소 공석의 큰 숫자 때문에 능력을 청소 하는 선생님. Ce3 + 매달려 유대는 nanoscale에 격자 긴장 redox 반응7자전거를 통해 이러한 결함 사이트의 재생을 촉진 하는 동안 선생님을 효과적으로 청소. Nanoceria는 또한 최근 사용 되었습니다 공부 하 고 엔지니어링 공장 기능8,9. Abiotic 스트레스 식물 선생님, 지질, 단백질 및 DNA10산화 손상의 축적 경험. A. thaliana 식물, 높은 빛, 열, 및 재미 스트레스8에서 향상 된 식물 광합성에 리드 nanoceria 촉매 vivo에서 선생님의 청소. 토양도 밀 (Triticum aestivum)11;의 증가 촬영 바이오 매스 및 곡물 수율 적용 nanoceria nanoceria로 치료 하는 canola (브라 시카 napus) 식물 소금 스트레스12에서 더 높은 식물 바이오 매스에 있다.

Nanoceria는 bioengineers를 제공 하 고 식물 생물학 abiotic 스트레스 응답을 이해 하 고 식물 abiotic 스트레스 내성을 강화 하는 나노기술 기반 도구. 선생님 청소 기능 vivo에서 Nanoceria의 식물 종의 독립적인 있으며 식물 조직에 손쉬운 배달 모형 유기 체 이상으로 광범위 한 응용 프로그램을 사용 하도록 가능성이 있다. 다른 유전자 기반 메서드와 달리 nanoceria 청소 능력13높은 선생님에 대 한 항 산화 효소의 overexpression 공장 라인을 생성 필요 하지 않습니다. Nanoceria 식물의 잎 lamina 침투 연구소 기반 연구에 대 한 실용적인 접근 방법입니다.

이 프로토콜의 전체 목표 1) 합성 부정 청구 폴 리 (아크릴) 산 nanoceria (PNC)의 특성화, 2) 납품 및 리프 셀에 걸쳐 PNC의 추적 및 3)의 모니터링 PNC 기반 선생님 청소 에서 설명 하는 vivo. 이 프로토콜에서 부정 청구 폴 리 (아크릴) 산 nanoceria (PNC)는 합성 하 고 그들의 흡수 스펙트럼, 유체역학 직경, 및 잠재적인 제타 특징. 식물으로 잎 조직 PNC를 제공 하는 간단한 잎 lamina 침투 방법을 설명 합니다. 이미징에 대 한 vivo에서 mesophyll 셀 내에서 나노 분산의, 형광 염료 (DiI) 레이블을 PNC (DiI-PNC)과 공초점 형광 현미경 검사 법을 통해 나노 입자 관찰에 사용 되었다. 마지막으로, 우리는 vivo에서 confocal 현미경 검사 법을 통해 PNC 선생님 청소 모니터링 하는 방법을 설명 합니다.

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프로토콜

1. A. thaliana 식물 성장

  1. 5 cm x 5 cm 일회용 냄비에 뿌리 다 A. thaliana 씨앗 표준 토양 혼합 가득. 32 이러한 냄비의 물으로 채워진 플라스틱 쟁반에 넣어 (~ 0.5 c m 깊이)는 식물을 가진 플라스틱 트레이 식물 성장 챔버로 전송.
    1. 다음과 같이 성장 챔버 설정을 설정: 200 µ / ms 광합성 활성 방사선 (파), 24 ± 1 ° C 일 및 21 ± 1 ° C 밤, 습도 60%, 및 14/10 h 주/야간 라이트 정권, 각각.
  2. 발 아의 1 주 후 하나의 개별 공장을 두고 각 냄비 얇은. 각 냄비에서 비슷한 크기와 묘를 계속 기록해 둡니다.
  3. 물이 냄비 플라스틱 쟁반에 직접 붓는 수도 물으로 한 번 매 2 일. 4 주에 대 한 식물을 성장. A. thaliana 식물 추가 사용 하기 위해 준비가 되었습니다.

2. 합성 및 PNC의 특성화

  1. 세 륨 (III) 질산염의 1.08 g 무게 그리고 분자 생물학 학년 물 50 mL 원뿔 튜브에서 2.5 mL에 용 해.
  2. 50 mL 원뿔 튜브에 분자 생물학 학년 물 5 mL에 용 해 및 폴 리 (아크릴) 산의 4.5 g 무게.
  3. 디지털 소용돌이 믹서를 사용 하 여 15 분 동안 2000 rpm에서 철저 하 게 이러한 두 가지 솔루션을 혼합.
  4. 수산화 암모늄 솔루션 (7.2 M)의 15 mL 50 mL 유리 비 커에 전송.
  5. 500 rpm에서 교 반 하면서 dropwise 수산화 암모늄 솔루션에 혼합 단계 2.3에서 추가 하 고 증기 두건에서 24 시간 동안 실 온에서 500 rpm에서 저 어.
  6. 동안을 피하기 위해 솔루션의 상당한 손실 하룻밤 반응 종이의 조각으로 비 커를 커버.
  7. 24 시간 후 결과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브에 전송 하 고 모든 가능한 파편 및 큰 응집 체를 제거 하는 1 h 3900 x g에서 원심.
  8. 표면에 뜨는 솔루션의이 22.5 mL 3 15 mL 10 kDa 필터에 전송 하 고 분자 학년 물 45 mL의 총 희석 수 있도록 필터의 나머지를 입력 합니다.
  9. 무료 고분자에서 표면에 뜨는 솔루션을 정화 하 고 15 mL 10 kDa 필터와 15 분에 3900 x g에서 원심 분리기에는 상쾌한을 추가 하 여 벤치탑 원심 분리기와 다른 시 약 6 번 이상이 단계를 반복.
  10. 아니 무료 고분자를 위해 220-700 nm에서 대 일 분 광 광도 계를 각 주기에서는 eluent의 흡 광도 측정 하 고 다른 시 약은 최종 PNC 솔루션에 존재.
  11. 5 mL 주사기로 수집한 PNC 솔루션을 20 nm 기 공 크기 주사기 필터에 대 한 필터링. 필터링 된 PNC 솔루션 50 mL 원뿔 튜브에 수집 합니다.
  12. 플라스틱 베트에 희석된 최종 PNC 솔루션을 대 일 분 광 광도 계 220-700 nm에서의 흡 광도 측정. PNC 흡 광도 피크는 271 nm.
  13. 맥주 Lambert 법률을 사용 하 여 그것의 농도 계산: A = εCL. A는 주어진된 샘플에 대 한 피크 값의 흡 광도, ɛ PNC (c m-1 M-1)의 어 금 니 흡수 계수, L 광학 경로 길이 (베트 폭,이 방법에서는 1 cm) 이며 C는 측정 된 나노 입자의 어 금 니 농도.
  14. 유체역학 직경 및 분석기를 사용 하는 입자 크기와 제타 잠재적인 (그림 1) 합성된 PNC의 제타 전위를 측정 합니다.
  15. 추가 사용까지 냉장고 (4 ° C)에서 최종 PNC 솔루션을 저장 합니다.
    참고: 우 외를 참조 하십시오. PNC 특성화에 대 한 더 많은 프로토콜 세부 정보에 대 한 8 .

3. 라벨 DiI 형광 염료와 PNC

  1. 학년 물 20 mL 유리 유리병에 분자 생물학의 3.6 mL와 5 m m (58 mg/L) PNC의 0.4 mL를 혼합 하 고 500 rpm에서 저 어.
  2. 24 µ L 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 과염소산염 염료 솔루션 추가 (DiI, 2.5 mg/mL; DMSO에 희석) DiI 염료 솔루션 DMSO (디 메 틸 sulfoxide)의 176 µ L로.
  3. PNC 솔루션, 주위 온도에 1 분 동안 1000 rpm에서 교 반에 dropwise DiI 염료를 추가 합니다.
  4. 15 mL 10 kDa 필터에이 결과 혼합물을 전송 하 고 분자 생물학 학년 물 총 희석을 가기로 튜브를 채울 15 mL.
  5. 5 분 동안 3900 x g에서 15 mL 10 kDa 필터와 DMSO 및 모든 가능한 무료 DiI 염료에서 PNC (DiI-PNC) 솔루션 벤치탑 원심 분리 하 여 표시 하는 DiI를 정화.
    1. 단계 3.5 5 번 이상 반복 합니다.
  6. 20 nm 기 공 크기 주사기 필터를 통해 최종 DiI PNC 솔루션을 필터링 합니다.
  7. 대 일 분 광 광도 법에 의해 최종 DiI-PNC의 흡 광도 측정 하 고 맥주 Lambert 법률 (그림 2)의 농도 계산. 자세한 내용은 단계 2.13를 참조 하십시오.
  8. 추가 사용에 대 한 4 ° C에서 냉장고에 보관.

4. 식물의 침투 PNC와 나뭇잎

  1. 침투의 0.1 mL를 추가 그것은 0.5 m m PNC 또는 DiI PNC 솔루션 및 소용돌이의 0.9 mL에 (100 mM TES, 100 m m MgCl2, pH 7.5, HCl에 의해 조정)를 버퍼. 부정적인 통제로 10mm TES 침투 버퍼의 솔루션을 사용 합니다.
  2. 1 mL 균 needleless 주사 통에 PNC 또는 DiI PNC 침투 솔루션의 0.2 mL를 전송. 가능한 모든 기포를 제거 하려면 누릅니다.
  3. 식물 성장 챔버 룸 라이트 조건에서 가능한 stomata 폐쇄를 피하기 위해 나노 입자와 침투 직전에서 검색 합니다.
  4. 침투 하기 전에 엽록소 측정기를 사용 하 여 비슷한 크기와 A. thaliana 잎에서 엽록소 콘텐츠 측정. 측정 3 복제와 각 리프 (3 개 이상 측정의 구성 된 각 복제)14. A. thaliana 나뭇잎 침투 실험에 대 한 비슷한 엽록소 콘텐츠를 선택 합니다.
  5. 부드럽게 리프 lamina (abaxial 쪽)의 하단에 대 한 needleless 주사기의 끝을 누르면 천천히 최근 준비 PNC 또는 DiI PNC 솔루션으로 잎에 침투 하 고 플런저 (그림 3A)를 누릅니다.
  6. 부드럽게 닦아 내는 섬세 한 작업 퍼그림 3(C)를 사용 하 여 리프 lamina (그림 3B)의 표면에 남아 있는 과잉 솔루션 및 공장 레이블. 새로운 섬세 한 작업 잎사귀를 사용 하 여 잎의 각 그룹에 대 한.
  7. 계속 침투 A. thaliana 식물 잎 적응 및 3 h에 대 한 PNC와 DiI PNC 보육에 대 한 벤치에.
    참고: 침투 A. thaliana 식물은 더 사용 (그림 3D)에 대 한 준비 다음.

5. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 리프 샘플의 준비

  1. 롤은 완두콩 크기의 관찰 1 ㎝ 반경(그림 4)에 대 한 하 젤 양과 다음 1mm 얇은 유리 슬라이드 (그림 4B) 될 때까지 밖으로 확산.
  2. 코르크 송곳을 사용 하 여 (직경 0.3 c m) 유리 슬라이드 (그림 4C)에 관찰 젤의 중심에 원형 부분을 잘라.
  3. 채워 컷 잘 완전히 perfluorodecalin (PFD) 잎 조직에 깊이 및 더 나은 confocal 영상 확인.
  4. 코르크 송곳을 사용 하 여 (직경 0.2 c m) 적응된 DiI PNC에서 잎 디스크 수집 하 침투 A. thaliana 식물 (그림 4D).
  5. 가득 PFD에 리프 디스크 탑재 잎의 침투 (abaxial) 쪽 얼굴.
  6. 잎 디스크 위에 사각형 coverslip 넣고 조심 스럽게 관찰 젤 잘 밀봉 하 고 아무 공기 방울 갇혀 (그림 4E) 유지를 균등 하 게 슬라이드 coverslip에 누릅니다.

6. 이미징 DiI-PNC Confocal 현미경 검사 법에 의해 잎 조직에

  1. 40 X 객관적 렌즈는 거꾸로 레이저 confocal 현미경 검사에 사용 합니다.
  2. 2 3 드랍 스 ddH2O 40 X 객관적 렌즈 상단에 드롭.
  3. 객관적인 렌즈 거꾸로 40 위에 준비 된 DiI PNC 침투 잎 샘플 슬라이드를 놓습니다.
    1. Coverslip 편이지만 렌즈에 ddH2O와 직접 접촉을 슬라이드 유리 하지 있는지 확인 하십시오.
  4. 레이저 빛 또는 밝은 분야 현미경 샘플에 관심 영역을 찾아.
  5. 현미경 소프트웨어를 시작 하 고 (20% 설정) 아르곤 레이저를 켭니다.
  6. 광학 슬라이스 2 µ m 및 4 선 평균 미만 수집 pinhole을 설정 합니다.
  7. Confocal 현미경 설정을 샘플 이미지: 514 nm 레이저 여기 (30%); Z-스택 섹션 두께: 2 µ m; PMT1: 550-615 nm (대 한 DiI PNC 영상); PMT2: 700-800 nm (엽록체 영상)에 대 한.
  8. 다른 개인에서 리프 샘플의 대표적인 confocal 이미지, 3 생물의 최소 복제.

7. 이미징 PNC에서 vivo에서 Confocal 현미경 검사 법에 의해 청소 선생님

  1. 준비 25 µ M 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA, 일반 선생님을 나타내는 염료)와 10 µ M dihydroethidium (DHE, superoxide 음이온을 나타내는 염료) 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 TES 침투 버퍼 (pH 7.5)에 염료 별도로.
  2. 코르크 송곳을 사용 하 여 (직경 0.2 cm) 잎을 수집 하는 적응된 PNC에서 디스크 A. thaliana 식물 침투.
    1. 염료 로드 프로세스를 가속 화 하기 위해 잎 디스크에 3 ~ 4 구멍을는 집게의 날카로운 팁을 사용 합니다.
  3. 이동 잎 디스크 microcentrifuge 튜브 H2DCFDA 및 DHE 별도로 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.
  4. 부 화, 후 린스 잎 ddH2O 3 번 디스크와 유리에 관찰 슬라이드 마운트 (프로토콜 섹션 5를 참조) 젤.
  5. Confocal 현미경에 슬라이드를 넣고 수동으로 리프 mesophyll 셀의 지역에 초점. 자세한 내용은 프로토콜 섹션 6을 참조 하십시오.
  6. UV-a 잎 디스크 노출 (405 nm) 레이저 3 분 선생님을 생성 하 고 시계열 ("xyt") 잎 디스크 당에 선생님 신호 강도 변화를 기록.
  7. Confocal 현미경 설정으로 리프 디스크 이미지: 40 X 물 목표; 496 nm 레이저 여기; PMT1: 500-600 nm (DHE 및 DCFDA 염료 검출);에 대 한 PMT2: 700-800 nm (엽록체 감지)에 대 한. 부정적인 컨트롤로 침투 버퍼 솔루션에 침투 하는 식물을 사용 합니다.

8. PNC 청소의 H2O2체 외

  1. 이전 간행물3,,815 에 방법에 따라 합성 PNC에는 생체 외에서 의 고양이 (catalase) 모방 활동을 수행
  2. 45.4 추가 1 x TES 침투의 µ L 버퍼 (10 m m TES, 10 m m MgCl2, pH 7.5, HCl에 의해 조정), 피츠버그 (60 nM, 3 µ L), 및 H2O2 (2 µ M, 1 µ L) 잘 (흰색 둥근 바닥 96 잘 접시)에 pipetting으로 부드럽게 섞는다.
  3. 추가 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine (작업 농도 100 µ M, 0.5 µ L) 및 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP; 작업 농도 0.2 U/mL, 0.1 µ L) 우물에 부드럽게 pipetting, 그것을 혼합 하 고 30 분 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine에 대 한 그것을 품 어 H2O2 와 반응 하 고 HRP의 resorufin로 변환 됩니다.
    1. 랩는 인큐베이션 기간 동안 빛을 피하기 위해 알루미늄 호 일로 접시.
    2. H2O2를 대체 하기 위하여 물 또는 반응 버퍼를 사용 하 여 부정적인 제어를 준비 합니다.
    3. 재고 솔루션을 제외한 주위 온도에 다른 모든 솔루션을 준비 합니다.
  4. 플레이트 리더를 부 화 후 560에서 흡 광도 모니터링 nm resorufin를 사용 하 여 H2O2의 수준을 나타냅니다. 0, 2, 5, 10, 20, 및 30 분에서 시간 체제를 설정 합니다.

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결과

PNC 합성 및 특성 .
PNC 종합 되었다 하 고 정화 방법을 프로토콜 섹션 2에서 설명 하는 다음 특징. 그림 1 A 세 륨 질산염, PAA, 세 륨 질산염 및 PAA, PNC의 혼합물의 솔루션의 채색을 보여 줍니다. PNC 합성 후 흰색에서 밝은 노란색 색상 변화를 볼 수 있다. 10 kDa 필터 정화, 후 피츠버그 대 일 분 광 광도와 특징 이었다. PNC에 대 한 흡 광도의 피크 271에서 관찰 되었다 (그림 1B) nm. 최종 eluent 또한 자외선에 대 한 비 반응 화학 물질 정화 동안 씻 겨 했다 확인 하로 측정 되었다. 유체역학 직경 및 합성된 PNC의 제타 전위는 입자 크기 조절기와 제타 잠재적인 분석기 ...

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토론

이 프로토콜에 우리 PNC 합성, 특성, 형광 염료 라벨, 및 그들의 비보에 선생님 청소 활동을 전시 식물 mesophyll 세포 내에서 나노 입자의 confocal 영상 설명 합니다. PNC는 세 륨 질산염 및 PAA 솔루션에서 수산화 암모늄의 혼합물에서 합성 됩니다. PNC 흡수 spectrophotomery와 맥주 Lamberts 법을 사용 하 여 결정 하는 농도 의해 특징. 제타 잠재적인 측정 엽록체8납품을 강화 하기 위한 PNC의 부정적으로 위탁 된 표면을 확인 했다. 형광 DiI 염료와 PNC의 라벨은 나노 엽록체와 colocalization의 높은 레벨을 보여 리프 mesophyll 셀 내에서 confocal 현미경 검사 법에 의해 vivo에서 화상 진 찰을 수 있습니다. DHE 고 DCF 형광 염료를 사용 하 여, 우리 superoxide 음이온과 비보에선생님의 강력한 폐품으로 PNC 역할을 확인 했다.

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 캘리포니아 대학, 리버 사이드와 미국 농 무부 식품 및 농업, 해치 프로젝트 1009710 J.P.G.에 의해 지원 되었다 이 자료는 J.P.G.에 보조금 번호 1817363에서 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
세륨 (III) 질산염 육수화물Sigma-Aldrich238538-100G
분자 생물학 등급 물, CorningVWR45001-044 
Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브VWR14-959-49A
폴리(아크릴산) 1,800 mwSigma-Aldrich323667-100G
Fisherbrand 디지털 볼텍스 믹서Fisher Scientific02-215-370
Fisherbrand 디지털 볼텍스 믹서 액세서리, 인서트 리테이너Fisher Scientific02-215-391
Fisherbrand 디지털 보텍스 믹서 액세서리: 폼 삽입 세트Fisher Scientific02-215-395
수산화 암모늄 용액Sigma-Aldrich05002-1L
PYREX Griffin Beakers, 졸업, CorningVWR13912-149 
RCT basicIKA3810001
Eppendorf Microcentrifuge 5424VWR80094-126
Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛Millipore-SigmaUFC901024
Allegra X-30 시리즈 벤치탑 원심분리기Beckman CoulterB06314
UV-2600 SptecrophotometerShimadzuUV-2600 120V
Whatman Anotop 10 주사기 필터Sigma-AldrichWHA68091102
Luer-Lok 팁이 있는 BD 일회용 주사기Fisher Scientific14-829-45
Zetasizer Nano SMalvern PanalyticalZen 1600
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorateSigma-Aldrich42364-100MG
디메틸 설폭사이드, ACSVWRBDH1115-1LP
선샤인 믹스 #1 LC1Green Island Distributors, Inc5212601.CFL080P
Adaptis 1000ConvironA1000
TES, >99% (적정Sigma-AldrichT1375-100G
염화마그네슘Sigma-AldrichM8266-1KG
Air-Tite All-Plastic Norm-Ject 주사기Fisher Scientific14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼Fisher Scientific06-666A
Carolina Observation GelCarolina132700
Corning microscope slides, frosted one side, one endSigma-AldrichCLS294875X25-72EA
Cork Borer 핸들 세트Fisher ScientificS50166A
PerfluorodecalinSigma-AldrichP9900-25G
마이크로 커버 안경, 정사각형, No. 1VWR48366-045
Leica 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 TCS SP5Leica MicrosystemsTCS SP5
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetateSigma-AldrichD6883-250MG
디하이드로에티듐시그마-알드리치D7008-10MG
Fisherbrand 프리미엄 마이크로원심분리기 튜브: 1.5 mL피셔 사이언티픽05-408-129
에펜도르프 Uvette 큐벳시그마-알드리치Z605050-80EA
엽록소 미터 코니카 미놀타SPAD-502

참고문헌

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