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방법 논문

Polycystic 난소 증후군 연구 Hyperandrogenic 마우스 모델

11.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58379

⸱

2018년 10월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 PCOS와 이러한 PCOS 같은 댐에서 자손의 이상 공부 dihydrotestosterone 펠 릿 마른 PCOS 같은 마우스 모델의 개발을 설명 합니다.

초록

Hyperandrogenemia 여성에서 생식 및 대사 기능에 중요 한 역할을 담당 하 고 다낭 성 난소 증후군의 특징 이다. PCOS 가진 여자를 모방 하는 마른 PCOS 같은 마우스 모델을 개발 하는 것은 임상적으로 의미가 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 이러한 모델을 설명합니다. DHT (dihydrotestosterone) 크리스탈 분말 펠 릿의 4mm 길이 삽입 하 여 (펠 릿의 총 길이 8 m m), 매월 교체, 하지 DHT (no-DHT)으로 이식 하는 쥐 보다 더 높은 혈 청 DHT 레벨 2 배와 PCOS 같은 마우스 모델을 생성할 수 있습니다. 우리는 체중과 신체 구성을 변경 하지 않고 생식 및 대사 장애를 관찰. 불모의 높은 학위를 전시, 이러한 PCOS 같은 여성 쥐의 작은 하위 집합 임신 얻을 수 그들의 자손 성인 지연된 사춘기 및 증가 남성 호르몬을 표시 하는 동안에. 이 PCOS 같은 마른 마우스 모델 PCOS와 이러한 PCOS 같은 댐에서 자손의 이상 공부를 유용한 도구입니다.

서론

Hyperandrogenism 안 드로 겐 과잉 및 PCOS (애 PCOS) 사회와 NIH 기준에 따라 polycystic 난소 증후군 (PCOS)의 특징 이다. PCOS 가진 여자 임신 어려움이 있고 임신 합병증1의 위험을 증가 했다. 그들은 임신 하는 경우에 그들의 여성 자손 불리 한 건강 결과2,3있다. 다양 한 전략4,5,6,7,,89,10,11 을 사용 하 여 동물 모델 개발 되었습니다. , 12 그리고 체중 증가와 비만 확장된 adipocyte 크기 및 증가 체형 무게와 관련 된 (무 배 란, 나 장애인된 포도 당 및 인슐린 내성) PCOS의 많은 기능을 전시. PCOS를 공부 하는 데 사용 되는 동물 모델을 생산 하는 두 가지 주요 전략을 확인 하 고 있습니다. 하나는 출생13후 높은 수준의 androgens 직접 (외 인 안 드로 겐 주입/삽입) 또는 직접 (예: 안 드로 겐 변환할 aromatase 억제제와 에스트로겐 차단) 치료입니다. 다른 연구는 자손을 임신14,15 동안 androgens의 태아 hyperexposure입니다. 예를 들어 붉은 털 원숭이16,17, 양18, 그리고 자궁내 기간 안 드로 겐의 남성 수준에 노출 하는 설치류에서 여성 자손 PCOS 같은 특성 나중에 인생에서에서 개발. 이 모델은 크게 높은 안 드로 겐 효과, 그리고 태아 프로그래밍, 그리고 자 궁 환경에 미치는 영향에 대 한 우리의 이해를 향상. 그러나,이 모델은 그들의 자신의 제한: 1) 동물 개발 비만 이며 따라서 어려운 비만 유발 생식과 대사 부전;에서 hyperandrogenemia의 효과 분리 하 2) 하기 전에 임신 PCOS 가진 여자는 이미 안 드로 겐의 상부를 전시, 따라서 oocytes 수정; 전에 초과 androgen에 노출 되었을 3) 스토 (T) 또는 dihydrotestosterone (DHT) 출생 후 또는 임신 중 사용의 약리학 복용량 PCOS의 안 드로 겐 환경을 반영 되지 않을 수 있습니다. 난소 follicular 액체 또는 혈 청에서 측정 되었습니다 테 스토 테 론과 DHT 수치가 되며 남성 호르몬 DHT 수준과 PCOS5,,1920,21 여성에서 더 높은 1.5 3.9 배 ,,2223 영향을 받지 않는 여성에 비해. 우리는 성인 마우스 모델23,24,25 의 4 m m 길이와 펠 릿의 삽입에서 만성 DHT 노출의 개시의 2 주 이내 생식 및 대사 기능 장애를 개발 하 고 만든 크리스탈 DHT 분말 (펠 릿의 총 길이 8 m m). 이 모델 DHT 치료 없이 통제 쥐 보다 2-fold 높은 (2xDHT 라고도 함)에 대 한 혈 청 DHT 수준을 생성 합니다. 2xDHT 마우스 기저 혈 청 estradiol, 남성 호르몬, LH의 변경을 전시 하지 않습니다 하지 비만, 개발 하 고 유사한 난소 무게, 콜레스테롤, 자유로운 지방산, leptin의 혈 청 수준 표시 TNFα과 일리노이-623,24, 25 상대적으로 제어도 최대 3.5 개월 DHT 삽입23,,2425후. 또한, 이미 PCOS의 기능 개발 여성 짝짓기, 우리 자손15의 대사 및 생식 건강에 hyperandrogenic 모성 환경의 영향을 공부할 수 있습니다.

이 새로운 패러다임 (NIH와 AE PCOS 사회 기준에 관련 된)는 상대적으로 비슷한 수준의 androgens 그 여자와 PCOS 2-3 더 높은 남성 호르몬에 영향을 받지 않는 여성에 비해 DHT 수치를 생산 하 여 질병을 모델링 합니다. 그러나,이 모델은 유지 지속적인 exogenous DHT에 의해 프로그래밍 된 생 hyperandrogenism에서 DHT 철회 되 면. 이 글의 전반적인 목표 1에 초점을 하는) 어떻게 DHT 펠 릿; 2) 마우스 모델; 처럼 엎드려 서 PCOS를 생성 하는 방법 3)이이 댐에서 여성 자손을 평가 하는 전략. 다른 측정 및 고기의 평가이 원고에서 해결 되지 않습니다 하지만5,15,23,,2425,26에서 찾을 수 있습니다.

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프로토콜

여기, 상세한 프로토콜 DHT 펠 릿 준비 및 삽입, 및 생식 하 고 신진 대사 테스트를 위해 선물이. 쥐가이 연구에 사용 된 혼합된 배경 (C57/B6, c d 1, 129Sv) 그리고 음식과 함께 유지 되었다 광고 libitum 24 ° c의 존스 홉킨스 대학에서 브로드 웨이 연구 건물 동물 시설에서 14/10 h 명암 주기 물 의학입니다. 모든 절차는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1. PCOS 같은 마우스 모델 만들기

  1. DHT 펠 릿 준비
    1. 오토 클레이 브 소독 실리콘 튜브입니다. 실리콘 튜브 면도날; 15 mm의 길이로 잘라
    2. 20 G 무딘 바늘 3 mL 주사기에 부착 된 튜브에 의료 접착 실리콘을 주입 하 여 한쪽을 봉인. 플런저는 주사기 그리고 저수지에 삽입 하는 접착제에서 철수 해야 합니다. 플런저를 다시 삽입 하 고 바늘에서 등장 하기 시작 때까지 접착제 밀어. 무딘된 바늘 어떤 강한가 위 20 G 바늘의 날카로운 끝 쪽을 절단 하 여 이루어집니다. 실리콘 튜브에서의 길이 포스트 프로덕션 트리밍; 수 있도록 2 m m 이상 이어야 한다
    3. 하룻밤 건조; 봉인 된 측에 공기 방울을 확인 합니다. 그 아무 공기 방울 DHT 펠 릿 사용 됩니다. 다른 사람 없는 DHT 제어 알 약에 대 한 사용할 수 있습니다.
    4. 피부에 DHT 노출을 피하기 위해 후드에서 DHT-펠 릿을 하기 전에 장갑, 마스크, 고글 및 실험실 외 투를 착용.
    5. 플라스틱으로 부 어 DHT 분말 무게 보트와 접착제의 오픈 사이드 DHT 분말으로 튜브 (A1.1에서 생산) 출장 보도.
    6. DHT 분말 정리는 큰 종이 클립 tamped 수 있습니다.  DHT 4 m m (또는 원하는 길이)의 높이 도달할 때까지 계속 합니다. 통치자와 DHT의 길이 확인 하 고 하룻밤 건조 실리콘 오픈 사이드 인감.
    7. 실리콘 길이가 2 mm의 길이 만들기 위해 봉인된 양쪽을 잘라. 펠 릿의 총 길이 8 m m 될 것입니다.
    8. 제어 (no-DHT) 펠 릿으로 빈 실리콘 튜브의 양쪽을 봉인.
    9. 사용까지 실내 온도에 (빛 노출 방지)를 호 일로 포장 50 mL 원뿔 튜브에 펠 릿을 유지. DHT 펠 릿 저장의 적어도 3 개월에 대 한 전체 효능을 유지합니다.
  2. DHT 삽입 및 교체
    1. 20 DHT까지 펠 릿 또는 제어 알 약은 침수 별도로 염 분 0.9%를 37 °C 삽입 직전 평형에 대 한 24 시간에 대 한 살 균 30 mL 50 mL 원뿔 튜브에.
    2. 수술 전에 표면 및 장갑 clidox로 소독 하 고 작업 표면 흡수 성 종이 깨끗 한 플라스틱 백업된 (외과 패드)으로 덮여 있다.  동물을 접촉 하는 모든 악기는 압력가 마로 소독 하 여 동물 시설에 들어가기 전에 소독.  악기는 건조 하 고 차가운 사용 이전에 허용 됩니다.
    3. 2 개월 된 여성 마우스 사용 (4-5 마우스/케이지). 마우스는 Xylazine intraperitoneally 주사 (3.5 mg/kg bw)와 케 타 민 (78.8 mg/kg bw) 인슐린 주사기를 사용 하 여. 혼합 및 주입 마 취에 대 한 계산 표 1에 있다.
    4. 적절 한 마 취 달성, 발가락 반사의 손실에 의해 측정 된 호흡 둔화 후 마우스 수술을 위해 준비 됩니다.
    5. 멸 균 거 즈를 사용 하 여 betadine와 영역의 피부를 소독 하 고 70% 에탄올으로 청소.  지역은 betadine로 다시 그린 것입니다.
    6. 목 근처 피부 아래가 위는 약 5 m m 길이와 구멍을 잘라. 10 G trochar를 사용 하 여, rostral 방향으로 작은 터널 (15 m m)를 확인 합니다. 펠 릿 dorsally는 trochar와 함께 삽입 됩니다.
    7. 오프닝은 다음 외과 접착제로 봉인 됩니다. 수동으로 대략적인 상처 가장자리 집게와 근접된 상처 가장자리에 액체 접착제의 얇은 필름을 적용할 부드러운 칫 솔 선. 상승 3 접착제 상처에 고르게 분포 되어 있도록 접착제의 얇은 층. 접착제는 apposed 상처 가장자리의 각 측에 1 cm를 연장 해야 합니다. 치료 또는 수술 클립 구멍을 사용할 수 있습니다. 으로, 개별적으로 보관, 복구에 대 한 열 패드와 마우스를 다시 넣어. 안 드로 겐 노출의 일정 수준을 유지 하기 위해 펠 릿 매 4 주를 교체 합니다. 원래의 펠 릿을 제거 될 것 이다 하 고 비슷한 위치에 A1.15에 설명 된 대로 새로운 펠 릿 삽입 됩니다.
    8. DHT 삽입의 3 일 후 estrous cyclicity를 테스트 합니다. Estrous 주기 단계입니다 질 세포학에 의해 평가 됩니다.  질 세포 p10 pipettor 멸 균 식 염 수 (약 10 µ L) 질 구멍에 물 총을 사용 하 고 다음 동일한 살 균 피 펫 팁과 염 분 철수 여 16 일 연속 수집 됩니다.  질 벽에서 벗겨진 질 세포는 식 염 수와 혼합 하 고 수집.
    9. 레이블이 지정 된 슬라이드에 세포와 식 염 수를 확산. 각 슬라이드는 6 개의 샘플을 포함할 수 있습니다. 슬라이드는 샘플 6 위치에 배치 하는 표시 되어 있습니다.
    10. 후에 식 염 수는 완전히 건조 밖으로 셀을 해결 하기 위해 100% 에탄올 용기에 슬라이드를 넣어 슬라이드에서. 슬라이드 적어도 5 분 동안 고정 해야 하지만 더 사용 될 때까지 무기한 정착 액에 남아 있을 수 있습니다.
    11. 각 버퍼 B에 대 일 분 동안 얼룩 솔루션 및 수돗물와 실 온에서 건조 C. 세척 슬라이드에 슬라이드를 넣어.
    12. 10 X 객관적인 가벼운 현미경 세포 형태를 검사 합니다.  셀 형태학 diestrus (D), metestrus (M), 발 정기 (E), proestrus (P)을 구별 하는 참조27,,2829에서 설명 되어 있습니다.
    13. 각 일 단계 및 각 단계에서 % 시간을 계산 하는 일의 총 수로 나눈 수입니다.
    14. 밤새 쥐 (16 h) 금식과 intraperitoneally 2g/kg 몸 무게의 20% 포도 당을 주입 하 여 DHT 삽입 후 21 일에 포도 당 포용 력을 테스트 합니다. 예를 들어 마우스 몸 무게 25 g 인 경우에,이 마우스 것입니다 주입의 20% 포도 당 250 µ L와 50 cc (0.5 mL) 인슐린 주사기. 포도 당 수준에서 0, 15, 30, 60, 90, 꼬리 정 맥에서 혈액을 샘플링 하 여 glucometer 및 테스트 스트립에 의해 평가 120 분. 이것은 설명에 다른30세부.
  3. 혈액 컬렉션
    1. 바소와 출혈 submandibular 정 맥에 의해 9 그리고 10 분 사이 DHT 삽입 (스테로이드에 대 한 100 µ L을 LH/FSH 분석 결과 대 한 30ul 컬렉션 볼륨 제한) 후 다양 한 일에 혈액을 수집 합니다. 이것은11에 설명 되어 있습니다.
    2. 4 ˚C 10 분에서 6000 x g 에서 혈액을 원심을 분석 결과까지-80 °C에 저장 될 수 있는 또 다른 1.5 mL 튜브에 혈 청 레이어를 수집 합니다.

2. 평가 생식 만성 DHT에서 여성 자손의 프로필 삽입 댐

  1. 짝짓기
    1. 여성 마우스 테스트를 펠 릿 삽입 다음 15 일에서 입증 된 비옥한 남성 (그 여성 마우스 새끼 이전 했다)와 새 장으로 이동 합니다.
    2. 매주 마우스 임신 인지 확인 하려면 댐의 몸 무게를 문서화 합니다. 일주일에 3 세대 이상의의 댐 체중 증가 임신을 나타냅니다.
    3. 2 주 후에 우리가 관찰 댐 증가 체중 전에 주 3 세대 보다 큰 댐의 피를 수집 합니다.
  2. 사춘기 질 및 첫 발 정기에 의해 평가
    1. 질 검사 새끼는 투약를 중단 시킨 후 매일 체크 21 출생 일 (PND)에서 anogenital 거리를 측정 하 고 기록 질의 나이.
    2. 일단 질 열리면, 매일, 확인 estrous cyclicity 1.2.8–1.2.11에 설명 된 대로 질 세포를 수집 합니다.
    3. 설명된 1.2.12로 세포 형태를 관찰 하 고 첫 발 정기 날짜로 정의 모든 세포는 cornified 상피 세포.
  3. 몸 무게와 귀 펀치
    1. 랜 싯 팁 문신 붙여넣기로 및 참조12 7 PND에에서 설명 된 대로 각 강아지 문신 발가락에 마크와 무게 쥐 나이의 70 일까지 7 일 마다.
    2. 귀 펀치 쥐 그들에 12 ~ 16 PND 사이 그림 1 에 사용 하는 시스템. 섹스 구별, 신체의 복 부 측면을 검토, 여성 젖꼭지를 볼 수 있을 것 이다.
    3. 21, 26, 70에서 혈액 수집 PND 1.3.1에서 위에서 설명한 대로 출산 후
  4. 호르몬 분석 결과
    1. DHT 수준 혈액 혈 청에서 두 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 측정 하 고 액체 크로마토그래피 탠덤에 의해 질량 분석 (LC-MS)23,24,,3132. T는 LC-MS, 또는 쥐/마우스 복제23,24에 연구를 위한 센터에 버지니아의 대학 Ligand 분석 결과 코어로 검증 된 ELISA에 의해 측정 됩니다.

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결과

혈 청 DHT 수준 및 포도 당 내성 검사

DHT 수준은 측정 했다 수집 된 혈 청에서 두 ELISA와 LC-MS 프로토콜 1.24-1.25, 그리고 2.9, 3.0. 그러나 DHT 절대 값은 질량 분석 및 ELISA,, DHT 대 아니 DHT 삽입 두 분석에서 유사 이며 전체 실험15,,2324 ( 의 상대 배 (약 2-fold) 사이 다른 그림 2A).  그러나 DHT 수준을 크게 DHT와 노-DHT 쥐에서 임신을 통해 선입견에서 증가,, DHT 수준을 2-fold (1 일 짝짓기 전에) 둘 다 pregestational no-DHT 쥐에 비해 D...

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토론

Hyperandrogenism은 PCOS의 핵심 기능입니다. 혈 청 DHT (두 배 높은 아니 DHT 마우스에 비해 DHT 쥐)이이 프로토콜에 사용 되는 이전 연구에서 다른 조사자에 의해 보고 그 보다 낮은 및 비례 PCOS5,19, 여성 모방을 보정 20,21. 다른 모델과 달리이 2-fold DHT 모델 몸 무게와 DHT 삽입23,24후 최대 3.5 개월 아니 DHT 쥐에 비해 몸 전체 구성 변경 되지 않습니다. 이러한 성인 DHT 이식 마우스 지속적인 exogenous DHT에 의해 유지 됩니다. 몸 전체 구성 변경 되지 있지만 구조 변경 및 함수는 adipocytes의 마른 PCOS 여자<...

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공개 사항

아무것도 공개입니다.

감사의 글

이 작품은 건강의 국가 학회 (보조금 R00-남서에 HD068130)와 볼티모어 당뇨병 연구 센터에 의해 지원 되었다: 조종사와 (남서)에 타당성 부여.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
결정질 5α-DHT 분말Sigma-AldrichA8380-1G
Dow Corning Silastic 튜빙Fisher Scientific11-189-15D0.04in/1mm 내경 x0.085in/2.15mm 외경
의료용 접착 실리콘팩터 II, InC.A-100
고글, 실험복, 장갑 및 마스크.
10 & 마이크로; 필터가 없는 L 피펫 팁USA Scientific11113700
번짐용 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-550-003
염색을 위한 Diff QuikFisher ScientificNC9979740
LancetFisher ScientificNC9416572
3 mL 주사기Becton, Dickinson and Company (BD),30985
부속 바늘 : 20GBD305176
눈금자 : 밀리미터 눈금이있는 10cm 이상의 길이.
XylazineVet one AnnSeA LA, MWI, BoiseNDC13985-704-10100 mg/mL
케타민 염산염Hospira, IncNDC 0409-2051-05100 mg/mL
수술용 스테이플AutoClip® 시스템, Fine Science Tool12020-00
인슐린 주사기BD3294611/2 CC, 저용량 U-100 인슐린 주사기
투관침미국MP-182
현미경Carl Zeiss Primo Star415500-0010-001독일
귀 펀치Fisher Scientific13-812-201
테스토스테론 쥐/쥐 ELISA 키트IBLB79174
DHT ELISA 키트알파 진단 국제1940
원터치 울트라 혈당계Life Scan, Inc.
원터치 울트라 테스트 스트라이프스캔 (Life Scan, Inc.)
Eppendorf 튜브Fisher Scientific05-402-18
면도날Fisher Scientific12-640
클리독Fisher ScientificNC0089321
외과용 언더패드Fisher Scientific50587953제조사: Andwin Scientific 56616018
Betadine 방부제 솔루션Walgreens
3M Vetbond (n- 부틸 시아 노 아크릴 레이트)3M 과학. 생활
세포 스 에 적용

참고문헌

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