여기, 우리는 미토 콘 드리 아 산소 소비, 영양에 너 지론, 및 양성자 누출, 미토 콘 드리 아에서 ATP 비능률적의 주요 원인의 정의 개념을 측정 하기 위한 방법 공유. 이러한 결과 미토 콘 드리 아 기능을 평가할 수 있도록 영양소 사용률에 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다.
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방법 논문
홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정
이 논문에서
요약
초록
산소 소비, 양성자 동기 힘 (PMF) 그리고 양성자 누출 측정의 미토 콘 드리 아 호흡, 또는 얼마나 잘 미토 콘 드리 아 ATP로 NADH와 FADH 변환할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아도 산소 사용 및 이산화탄소와 물에 영양분 산화에 대 한 기본 사이트 이기 때문에, 그들이 얼마나 효율적으로 산소를 사용 하 고 직접 ATP를 생산 영양소 대사의 효율성에 관한 동물의 영양소 요구 사항 및 동물의 건강입니다. 이 방법의 목적은 다른 약물, 다이어트와 미토 콘 드리 아 대사에 환경에 미치는 영향의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 미토 콘 드리 아 호흡을 살펴보는 것입니다. 결과 산소 소비를 양성자 종속 호흡 (주 3) 및 양성자 누출 종속 호흡 (주 4)으로 측정 포함 됩니다. 주 3 / 주 4 호흡의 비율 호흡 제어 비율 (RCR)로 정의 되 고 미토 콘 드리 아 에너지 효율을 나타낼 수 있습니다. 미토 콘 드 리아 양성자 누출에서 ADP ATP 합성의 효율을 감소 연결을 푸는 산화 인 산화에 의해 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)의 소비를 허용 하는 프로세스입니다. 미토 콘 드리 아 기질 및 전자 수송 체인 억제제 산소와 TRMP + 민감한 전극 상태 3 주 4 호흡, 미토 콘 드 리아 멤브레인 PMF (또는 ATP 생산 잠재력)를 측정 하는 데 사용는 양성자 누출. 이 방법에 한계는 간 조직을 최대한 신선한 해야 모든 생 검 및 분석 실험 10 h이 하에서 수행 되어야 합니다. 이 샘플을 수집 하 고 약 5 하루에 한 사람에 의해 처리 수의 수를 제한 합니다. 그러나, 간 조직 1 g만 필요, 그래서 젖소와 같은 큰 동물에 필요한 샘플의 금액은 간 크기에 상대적으로 작은 작은 복구 시간이 필요 합니다.
서론
미토 콘 드리 아 스트레스에 매우 민감합니다 그리고 그들의 세포질 환경 다양 한 대사 질환에 기여할 수 있다. 산소 소비와 양성자 누출 미토 콘 드리 아에는 미토 콘 드리 아 건강의 지표입니다. 산소 소비와 양성자 누출 없이 RCR을 사용 하 여이 종이 견적 미토 콘 드 리아 에너지 효율에 설명 된 방법을 기반으로 합니다. 이러한 결과 영양소 사용률1에서 손실 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다. 산소 소비와 양성자 누출에 변화는 신진 대사 질환에 기여 하 고 감소 에너지 효율에서 결과 미토 콘 드 리아 기능 장애를 식별할 수 있습니다. 이러한 방법 또한 미토 콘 드리 아 호흡에 다른 처리의 효과 검사를 사용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 측정의 전반적인 목표는 미토 콘 드리 아 기능 및 에너지 효율 평가입니다.
간 미토 콘 드 리아 기능 장애 젖소에 여러 가지 질병으로 연결 되었습니다. 수 유 초기에 에너지 적자를 직면 하는 때 지질과 탄수화물 연료 전환 세포질 물질 대사 수 숫자 셀2에 미토 콘 드리 아의 기능에 의해 좌우 된다. 에너지와 증가 β-산화에 대 한 증가 수요에 적응 하는 미토 콘 드리 아의 능력에 결....
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프로토콜
모든 메서드, 프로토콜 및 여기서 설명 하는 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 캘리포니아 대학, 데이비스 승인 되었다.
1. 홀스타인 낙농 암소에서 간 생 검을 얻기
참고: 간 생 검은 허용한 수 의사에 의해 수행 되어야 한다. 간 생 검 젖소는 유제품 사이트에 수행할 수 있습니다. 일반적으로 젖을 계속 젖이 젖소 그리고 우유 식량 공급 절차 전후에서 철회 될 필요가 없습니다. 적어도 4 명 낙농 소에 간 생 검을 수행 해야 하는 것이 좋습니다: 생 검, 생 검 위치 및 수 의사, 세가에 펜의 외부에 실험실 기술자를 보호 하기 위해 암소의 엉덩이에 서는 동물 처리기를 수행 하는 수 의사 어 도구, 재료와 생 수 의사에서 샘플 고 뒤쪽에 차량 (그림 1), 그리고 간 샘플을 검색 하 여 미토 콘 드리 아 격리 시작 기술 자가 될 수 있는 깨끗 한 영역을 유지.
- 1 개월 간 생 검 전에 주고 소 clostridia 예방 접종. 압력가 마로 소독 외과 수건, 생 검 계기, 메스 홀더 및 수술 장비 수술 팩을 만듭니다.
- 간 생 검 전에 1 일 Ceftiofur 염 0.044 mL/kg body....
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결과
RCR와 양성자 누출 속도 보여주는 긍정적인 결과 각각 표 1 과 그림 15에 표시 됩니다. 이 연구7, RCR 및 단백질 누출에서 속도 론 측정 되었다 홀스타인 젖소에서 우유에 70 일 후 소는 28 일에 대 한 Cu, Zn와 Mn의 5 가지 레벨의 1을 공급 했다. 주 4, 최대 양성자 누출 종속 호흡, Cu, Mn, Zn (p < 0.1)의 미네랄 섭취에 의해 영향을 받을 하는 경향이 있었다. 주 3 호흡 (최대 ATP 자극 호흡) 및 RCR = 상태 3 / 상태 4 (호흡 제어 비율)은 미네랄 섭취에 의해 영향을 받지 않습니다. 4 호흡 했다 LowMn에서 최고 및 최저 컨트롤, 미네소타 최소화 양성자 누출 종속 호흡에 중요 한 역할을 합니다 나타내는 상태. 망간 Mn Superoxide Dismutase 효소를 통해.......
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토론
프로토콜에서 가장 중요 한 포인트는 대표 간 조직 샘플을 얻기 이며 생 후 즉시 미토 콘 드리 아의 격리를 시작. 호흡 측정에 변이 실험실으로 암소에서 짧은 전송 시간으로 인해 낮은 (표 1). 전송 시간을 줄이기 위해, 작은 실험실 세워졌다는 유제품의 사무실에서 그리고 각 미토 콘 드리 아 생의 10 분 안에 고립 됐다 있도록 수집으로 간 샘플 사무실 실험실에 기반 했다. 설치 및 사용 기록 차이 양성자 기온 변화도에 하루 전에 수집 하 고 처리 하는 샘플 양성자 누출에서 초기 측정 누락 등 오작동을 방지할 수 있습니다 pH 미터 호흡 챔버 및 전극 (산소, TPMP +)의 테스트 속도 론 (그림 16)입니다.
신선한 간 샘플 및 미토 콘 드리 아의 신속한 격리에 대 한 필요 때문에 수집 되 고 하루에 처리 될 수 있는 샘플의 수는 제한 됩니다. 각 샘플 완료; 약 5-6 시간 걸립니다. 따라서.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 연구 센터를 통해 Alltech 및 USDA 해치 자금 음식 동물 건강에 UC 데이비스 수의 학부의 지원 한다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney 소 간 생검 기구 | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| 봉합 | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| 봉합 바늘 | NA | 포함 봉합사 | |
| 메스 | 포함 시그마 - Aldrich | S2896 / S2646 | # 핸들 및 블레이드용 |
| 수술용 수건 | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| 팔콘 튜브 50mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 핀셋 | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50mL 주사기 | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| 주사 바늘 (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| 암소 고삐 | 트랙터 공급 유한 | ||
| 면봉 | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| 면 거즈 사각형 (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| 의료용 가위 | 시그마 - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | 제공 수 | ||
| Clostridia 백신 | 의사 | ||
| 제공 간 생검 항생제 엑세넬 2cc/100lbs, 3일 | |||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| 에탄올 70% | Sigma 제공 - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg | 의사 제공 | ||
| 2% 리도카인 HCl (10-15mL) | 의사 제공 | ||
| 플루닉신 메글루민 | 사 수의사 제공 | ||
| 미토콘드리아(간) 분리 | |||
| 장비 | |||
| 0.16mm 간격의 테프론 유봉이 있는 Wheaton 바이알 30mL | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| 균질화 모터 | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| 균질화 프로브 | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| 자동 피펫(10mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| 얼음이 있는 비커(500mL) | Fisher Scientific | FB100600 | |
| 냉장 마이크로퓨지 | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| 마이크로fuge 튜브(1.5mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)abcam | ab102536 | ||
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| 트리스-HCl | 시그마 - 알드리치 | T1503-1KG | |
| EDTA | 시그마 - 알드리치 | EDS-1KG | |
| BSA(지방산 무함유) | 시그마 - 알드리치 | A7030-50G | |
| 만니톨 | 시그마 - 알드리치 | M4125-1KG | |
| 탈이온수 | 시그마 - 알드리치 | 38796 | |
| 헤페스 | 시그마 - 알드리치 | H3375-500G | |
| 미토콘드리아 분리 매체를 만드는 데 사용: 220 mM 만니톨, 70 mM 자당, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA 및 0.1% (w/v) 지방산 무료 BSA, pH 7.4 at 4 &g; C, 냉장고 | |||
| Mitochondria 산소 흡수< / strong> | |||
| >< 장비< / strong> | |||
| Oxygraph 설정 + Clark type 산소 전극 | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| 온도 조절 워터 펌프 | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark 타입 산소 전극 | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μ L) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH 측정기 | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 Sigma | - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | 시그마 - Aldrich | E3889-100G | |
| 미토콘드리아 산소 소비 매체를 만드는 데 사용: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes 및 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 ° 0.3% 탈지 BSA | |||
| 로테논이 함유된 C(4mM 용액) | 시그마 - Aldrich | R8875-5G | |
| 숙시네이트(1M 용액) | 시그마 - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP(100mM 용액) | 시그마 - Aldrich | A5285-1G | |
| 올리고마이신(8μ 용액); g/mL in ethanol) | 시그마 - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions는 신선할 필요는 없지만 실행 사이에 냉동고에 보관해야 합니다 | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μ g/mL in ethanol), 냉동고에 보관 | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), 냉동고에 보관 | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP 용액: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes 및 1 mM EGTA, 30°C에서 pH 7.4 & 0.3% 탈지 BSA |
참고문헌
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica ....
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재인쇄 및 허가
