돼지에서 자가 이식 Hepatocytes 전 비보 의 lentiviral 벡터 중재 된 유전자 치료

요약

이 프로토콜은 돼지 hepatocyte 격리와 ex vivo 유전자 배달 모델 autologous 세포 이식 통해 대사 질환의 치료를 설명 하는 위한 것입니다. 이 특정 모델은 성공적인 치료를 선호 하는 독특한 장점, 있지만 응용 프로그램은 추가 질병 징후를 해결 하기 위해 관련 기초 이다.

초록

유전자 치료는 치료 많은 선된 천 성 간 물질 대사의 이상적인 선택 이다. Ex vivo, lentiviral 벡터 사용 되었습니다 성공적으로 인 간에, 많은 조 혈 질환의 치료에 그들의 사용은 주인 게놈으로 통합 하는 벡터의 능력으로 인해 안정적인 transgene 식으로. 이 메서드는 유전 tyrosinemia 형식의 큰 동물 모델에 ex vivo 유전자 치료 hepatocytes의의 응용 프로그램을 보여 줍니다 나. 헌 혈 기증자/받는 동물, 2에서에서 기본 hepatocytes의 1) 절연 이루어져이 프로세스) ex vivo 유전자 배달 hepatocyte 변환 lentiviral 벡터와 포털을 통해 수정된 hepatocytes의 3) 헌 식을 통해 사출 맥락 메서드의 성공 일반적으로 간 절제, 격리 된 셀의 다시 engrafting, 높은 백분율 변환에 대 한 충분 한 실행 가능한 hepatocytes의 격리에 대 한 삭제 견본 취급 주의의 효율적이 고 살 균 제거에 의존 하 고 전체 감염을 방지 하기 위해 무 균 수술 절차입니다. 이 단계에서 기술적인 실패 자가 이식 가능한 불리고 hepatocytes의 낮은 수익률 또는 기증자/받는 사람 동물의 감염 발생 합니다. 인간의 유형 1 유전 tyrosinemia (HT-1)이이 접근에 대 한 선택의 돼지 모델은 이러한 메서드를 고유 하 게 의무가 engraftment 수정된 세포의 심지어 작은 비율 간 repopulation 건강 한 세포는 강력한 기반으로 이어질 것으로 기본 병 hepatocytes에 선택적인 이점입니다. 성장 선택이 모든 표시에 대 한 사실이 되지 않을 것입니다, 하지만이 방법은 다른 표시로 확장을 위한 기초 이며 추가 질병, 간 내에서 모두 해결 하 고 넘어, 동안에이 환경 조작할 수 있습니다. 바이러스 성 벡터와 오프 대상 독성 및 tumorigenicity에 대 한 기회에 대 한 노출 제어.

서론

선된 천 성 간 물질 대사의 총칭 1에 800 생존 출생¹만큼 영향을 미치는 유전 질환의 가족입니다. 이 질병의 많은 단일 유전자 결함² 고 hepatocytes³의 충분 한 수에 영향을 받는 유전자의 단일 수정 된 복사본을 도입 하 여 기능적으로 치료 될 수 있습니다. 수정 해야 hepatocytes의 실제 비율 질병⁴ 에 의해 변화 하 고 인코딩, 단백질 세포질 대 예 배설된 단백질의 특성에 크게 좌우 됩니다. 대부분의 경우, 신진 대사 질환에 대 한 어떤 치료의 효능은 순환에서 자주 사용할 수 있는 바이오 마커의 존재를 통해 쉽게 분석 됩니다.

HT-1은 fumarylacetoacetate 가수분해 효소 (파)⁵결함, 티로신 물질 대사⁶의 마지막 효소 단계에서 결과 간 대사의 선천적인된 오류가. 파 결핍 리드 빌드 급성 간 기능 장애 및 사망을 일으킬 수 있습니다 또는 질병의 만성 모양에서 경 변 증 및 간세포 암 하면 간 독성 대사 산물의. 질병은 임상 2-(2-nitro-4-tri....

프로토콜

모든 동물 절차 기관 지침에 따라 수행 된 검토 하 고 연구 행위 이전 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 했다. 여기에 설명 된 절차는 수술에 적합 하 고 건강 한 것으로 간주 되는 나이의 3 개월까지 남성과 여성의 큰 백색 농장 돼지 (50 %Landrace/50% 큰 화이트 유전 배경)에 수행 했다.  동물 기관 수의 관리 직원에 의해 호환 되지 않는 것으로 간주 하지 않는 한 사회적으로 지 내게 됩니다.  동물 적어도 한 번 매일 관리 직원에 의해 차 우 두 번 매일 하 고 임상 증상에 대 한 관찰의 적절 한 수준을 먹인 다.

1입니다. 수술을 위한 준비

1. 5 mg/kg telazol 및 진정 작용을 유도 하는 것을 피하는 2 mg/kg xylazine를 관리 합니다. 수술 후 무 통을 위한 0.18 mg/kg의 복용량에 피하 buprenorphine 명함 관리 (무 통이이 복용량에서 72 h를 될 것으로 예상). 수동으로 응답 진정 확인에 대 한 동물을 확인 합니다.
2. 일단 진정, 약리학 적인 접근에 대 한 주변 귀 정 맥에 정 맥 카 테 터를 삽입 합니다.
3. 수술 전 정 맥 25 mg/kg cefazolin와 ceftiofur의 근육 5 mg/kg를 관리 합니다....

결과

간 절제 및 자가 이식 개요로 그림 1에 표시 됩니다. 5 돼지 간 절제 수술의 대표적인 일대에 대부분의 수확량 했다 > 1 x 10⁹ hepatocytes 약 80% 생존 (표 2)와 함께 모든 종류의 많은 셀을 제공 하는 조작, 유전자를 포함 하 여 원하는 치료입니다. 각 그 5 돼지 보여 좋은 생존 및 접착, 전형적인 hepatocyte 형태학 46 시간 후에 변환 및 초기 도금 (그림 2)와 준비 hepatocytes의 비 이식 부분의 후속 문화. 이러한 결과 성공적인 준비의 대표 동안 가난한 결과 셀, 생존, 또는 최소한의 준수는 단층에 셀의 낮은 수와 함께 표시 될 것 이다.

파

토론

이 보고서에는 비보 전 헌 유전자 치료 접근을 돼지 모델 HT-1의 치료를 설명 합니다. 그것은 교정 transgene 들고 lenti 바이러스 비보 전 hepatocyte 고립과 격리 hepatocytes의 변환 다음 부분 hepatectomy 포함. 수정된 헌 hepatocytes는 다음 다시 문맥⁸파 결핍 동물에 이식 됩니다. 설명 하는 방법을 몇 가지 수정 모든 큰 동물 모델에 적용 됩니다, 하지만 파 불충분 한 돼지는 매우 선택적 환경 수정된 셀^13,15의 독특한 이점이 있다. 이 메서드는 HT-1에 대 한 효과적인 치료로 약 복용된 동물 쇼 화학적 측정 된 대사 산물과 염증 성 간 생체, 변과 HCC의 예방 및 초기 섬유 증 본의 완전 한 반전의 정규화 NTBC 독립적인 성장 NTBC와 사이클링. 또한, 최근 연구와 관련 된 광범위 한 조직.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-(2-니트로-4-트리플루오로메틸벤조일)-1,3-시클로헥산디온(NTBC)	Yecuris	20-0027
12mm 투관침		B12STS
5mm 투관침		B5SHF
엔도 수술용 스테이플러 60	Covidien	EGIA60AMT
엔도 수술용 스테이플러 45	Covidien	EGIA45AVM
엔도 외과 스테이플러 30	Covidien	SIG30AVM
Endo 캐치 백	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	멸균 드레싱
Williams'-E 파우더	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	시그마 알드리치	S8875-1KG
HEPES	Fisher	BP310-1
펜/스트렙	Gibco	15140-122
소 태아 혈청	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetyl-L-cysteine	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
콜라겐분해효소 D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexamethasone	Fresenius Kabi	NDC6337
표피 성장 인자	Gibco	PHG0314