이 프로토콜은 돼지 hepatocyte 격리와 ex vivo 유전자 배달 모델 autologous 세포 이식 통해 대사 질환의 치료를 설명 하는 위한 것입니다. 이 특정 모델은 성공적인 치료를 선호 하는 독특한 장점, 있지만 응용 프로그램은 추가 질병 징후를 해결 하기 위해 관련 기초 이다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 치료는 치료 많은 선된 천 성 간 물질 대사의 이상적인 선택 이다. Ex vivo, lentiviral 벡터 사용 되었습니다 성공적으로 인 간에, 많은 조 혈 질환의 치료에 그들의 사용은 주인 게놈으로 통합 하는 벡터의 능력으로 인해 안정적인 transgene 식으로. 이 메서드는 유전 tyrosinemia 형식의 큰 동물 모델에 ex vivo 유전자 치료 hepatocytes의의 응용 프로그램을 보여 줍니다 나. 헌 혈 기증자/받는 동물, 2에서에서 기본 hepatocytes의 1) 절연 이루어져이 프로세스) ex vivo 유전자 배달 hepatocyte 변환 lentiviral 벡터와 포털을 통해 수정된 hepatocytes의 3) 헌 식을 통해 사출 맥락 메서드의 성공 일반적으로 간 절제, 격리 된 셀의 다시 engrafting, 높은 백분율 변환에 대 한 충분 한 실행 가능한 hepatocytes의 격리에 대 한 삭제 견본 취급 주의의 효율적이 고 살 균 제거에 의존 하 고 전체 감염을 방지 하기 위해 무 균 수술 절차입니다. 이 단계에서 기술적인 실패 자가 이식 가능한 불리고 hepatocytes의 낮은 수익률 또는 기증자/받는 사람 동물의 감염 발생 합니다. 인간의 유형 1 유전 tyrosinemia (HT-1)이이 접근에 대 한 선택의 돼지 모델은 이러한 메서드를 고유 하 게 의무가 engraftment 수정된 세포의 심지어 작은 비율 간 repopulation 건강 한 세포는 강력한 기반으로 이어질 것으로 기본 병 hepatocytes에 선택적인 이점입니다. 성장 선택이 모든 표시에 대 한 사실이 되지 않을 것입니다, 하지만이 방법은 다른 표시로 확장을 위한 기초 이며 추가 질병, 간 내에서 모두 해결 하 고 넘어, 동안에이 환경 조작할 수 있습니다. 바이러스 성 벡터와 오프 대상 독성 및 tumorigenicity에 대 한 기회에 대 한 노출 제어.
서론
선된 천 성 간 물질 대사의 총칭 1에 800 생존 출생1만큼 영향을 미치는 유전 질환의 가족입니다. 이 질병의 많은 단일 유전자 결함2 고 hepatocytes3의 충분 한 수에 영향을 받는 유전자의 단일 수정 된 복사본을 도입 하 여 기능적으로 치료 될 수 있습니다. 수정 해야 hepatocytes의 실제 비율 질병4 에 의해 변화 하 고 인코딩, 단백질 세포질 대 예 배설된 단백질의 특성에 크게 좌우 됩니다. 대부분의 경우, 신진 대사 질환에 대 한 어떤 치료의 효능은 순환에서 자주 사용할 수 있는 바이오 마커의 존재를 통해 쉽게 분석 됩니다.
HT-1은 fumarylacetoacetate 가수분해 효소 (파)5결함, 티로신 물질 대사6의 마지막 효소 단계에서 결과 간 대사의 선천적인된 오류가. 파 결핍 리드 빌드 급성 간 기능 장애 및 사망을 일으킬 수 있습니다 또는 질병의 만성 모양에서 경 변 증 및 간세포 암 하면 간 독성 대사 산물의. 질병은 임상 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), 효소 상류 파의 티로신 물질 대사에서의 작은 분자 억제 물의 행정에 의해 관리 됩니다. Hepatocytes의도 적은 수의 성공적인 교정 결국 모두 크고 작은 동물 모델에 수정 된 셀의 전체 간 repopulation에 발생 질병 유전자 치료 방법, 테스트할 수 있는 이상적인 환경을 제공 합니다. 7 , 8.이 때문에 발생 합니다 수정 세포는 깊은 생존 이점을 독성 대사 산물의 축적으로 인해 수정 되지 않은 셀에서 후자. 수정 되지 않은 hepatocytes의 손실 수 있습니다 수정된 hepatocytes의 선택적 확장 간 재생 용량와 일치. 치료는 쉽게 순환 이식 다음 티로신 및 succinylacetone 수준에 감소를 측정 하 여 다음 수 있습니다.
부분 hepatectomy 포함, 절차의 침략 적인 본질을 정당화 하기 위해이 방법의 목표 내구성 치료 해야 합니다. 따라서, 복제 무능 한 lentiviral 벡터 때문에 그들은 안정적으로 hepatocyte 게놈9를 통합할 것 이다 데 사용 됩니다. 간으로 모든 딸 세포에는 수정 된 유전자의 배달 보장 성장 하 고 확장 합니다 수정 되지 않은 세포의 급속 한 손실 대체. 이 주로 유사 분열10 주만 치료의 어떤 효력 든 지 그로 인하여 잃는 동안 단일 딸 세포에 전달 될 수 있는 episomes로 존재 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터에 유리 하다.
문학의 성장 시체 위에 lentivirus11, 관심사의 안전 지원 하지만 차적인 이벤트 환경 제어 생체 외에서 호스트 셀 변환 제한 하 여 완화 됩니다. 이 방법은 수행 되는 문맥을 통해 헌 이식으로 다시 소개 될 hepatocytes에 노출 제한 무료 벡터 적 체계적으로 호스트에 도입 되었습니다.
이 보고서는 수술의 방법 및 절차 ex vivo 유전자 치료 비보 전 을 위한 hepatocytes와 HT-1 돼지8의 치료에 대 한 후속 헌 이식12 를 격리 하는 데 사용에 대해 설명 합니다. 1) 부분 hepatectomy hepatocytes와 호스트의 간 성장 자극의 근원, 2) 삭제 간 뒤에 ex vivo 유전자 보정, 그리고 마지막으로 3)의 재 소개부터에서 hepatocytes의 절연 역할을 포함 하는 전체 프로세스는 수정된 hepatocytes 호스트에 다시. 설명 하는 방법을 몇 가지 수정, 모든 큰 동물 모델에 적용 됩니다 하지만 파 불충분 한 돼지13 수정된 hepatocytes에 대 한 선택적 환경 활용 해야한다.
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프로토콜
모든 동물 절차 기관 지침에 따라 수행 된 검토 하 고 연구 행위 이전 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 했다. 여기에 설명 된 절차는 수술에 적합 하 고 건강 한 것으로 간주 되는 나이의 3 개월까지 남성과 여성의 큰 백색 농장 돼지 (50 %Landrace/50% 큰 화이트 유전 배경)에 수행 했다. 동물 기관 수의 관리 직원에 의해 호환 되지 않는 것으로 간주 하지 않는 한 사회적으로 지 내게 됩니다. 동물 적어도 한 번 매일 관리 직원에 의해 차 우 두 번 매일 하 고 임상 증상에 대 한 관찰의 적절 한 수준을 먹인 다.
1입니다. 수술을 위한 준비
- 5 mg/kg telazol 및 진정 작용을 유도 하는 것을 피하는 2 mg/kg xylazine를 관리 합니다. 수술 후 무 통을 위한 0.18 mg/kg의 복용량에 피하 buprenorphine 명함 관리 (무 통이이 복용량에서 72 h를 될 것으로 예상). 수동으로 응답 진정 확인에 대 한 동물을 확인 합니다.
- 일단 진정, 약리학 적인 접근에 대 한 주변 귀 정 맥에 정 맥 카 테 터를 삽입 합니다.
- 수술 전 정 맥 25 mg/kg cefazolin와 ceftiofur의 근육 5 mg/kg를 관리 합니다.
- 혈압과 심장 박동 절차를 통해 정상적인 생리 한계 내에서 유지 하는 정 맥 정상적인 염 분 관리.
- 복 부를 압축 하는 orogastric 튜브를 놓습니다. 적절 한 크기의 endotracheal 튜브 endotracheal 삽 관 법을 수행, 증발 기, 감지 수동으로 가슴을 압축 하 여 적절 한 배치를 확인 하 고 1-3 %isoflurane 동물을 기계적으로 환기.
- 심전도 (ECG) 리드, 혈압 팔목, 온도 프로브, 및 생체 신호를 모니터 및 기록 하 펄스 속도도 장소. 동물 부정사 위치에서, 흉 곽에서 골반 betadine와 복 부를 문질러 놓고 sterilely 드러 워 진.
- 마 취의 수술 평면을 유지 하는 절차 중 1-3 %isoflurane 주제를 환기. 변경에 대 한 생체 신호를 모니터링 하 고 유지 하려면 사전 절 개 수준에서 심장 박동 혈압 강하 극적으로 isoflurane 감소 같은 생명력, 복원 제도 승인 에이전트 시작 isoflurane 조절 하 정 맥 피 네 프 린입니다.
- 심장 박동, 호흡, 혈압, 비율과 온도 추적 하 고 유지 하는 큰 동물 복지 표준 준수 하기 위해 교육 기관 관련 정책에 따라 동물 복지 수술 기록에 기록 합니다.
2. 복 강경 부분 Hepatectomy
- 초기 포트 사이트 항목은 배꼽에 cephalad 오픈 Hassen 기술을 사용 하 여 수행 합니다. 복 막 시각 때 안전 하 게 복 부 구멍으로 12mm trocar를 소개 합니다. 이 포트를 통해 5 mm, 30 °, 범위를 전달 합니다.
- CO2 15 mmHg 복 부 insufflate 복 강경 카메라와 함께 직접 시각화, 아래 두 개의 추가 5 m m 포트 간 왼쪽된 측면 엽에 측량을 배치 합니다. 포트의 정확한 배치 크기와 동물의 해부학에 따라 달라 집니다.
- 이 시점에서 5mm 포트 중 하나에 복 강경을 놓습니다.
- 왼쪽된 엽의 주요 균열 지점 간 왼쪽된 측면 세그먼트를 식별 합니다. 이 게 의료와 왼쪽 측면 세그먼트 구분합니다. 수술 용 스테이플러를 사용 하 여이 게 따라 간 정 맥 함께 포털 구조 확보 ( 재료의 표참조). 60, 45, 또는 30mm 긴 혈관 부하를 사용 하 여 스 테 플 러에서 순차적 실행을 사용 하 여이 균열을 통해 실질 transect
- Parenchymal 절제 완료 되 면 적절 한 hemostasis 되도록 남은 간을 평가 합니다. 로 또는 봉합 된 실질에서 어떤 출혈을 제어 합니다.
- 내 시경 graspers 및 내 시경 조직 검색 가방을 사용 하 여 간 섹션을 검색 합니다.
- 포트를 제거 하 고 중간 근 막, 피부 깊은 층에 대 한 실행 2-0 봉합 및 subcuticular 계층에 대 한 실행 4-0 봉합 사 봉합 사 중단된 크기 0와 3 개의 층에 12 m m 포트 절 개를 닫습니다. 5 m m 포트 2-0으로 한 층에 닫힐 수 있습니다.
- ( 재료의 표참조) 절 개에 멸 균 드레싱을 놓습니다.
- 셀 4 시간 이내에 준비가 될 것입니다 때 autotransplantation의 시간까지 전신에서 동물 post-operatively 유지.
- 또는 셀 조작 장기간을 요구 하는 경우 (예: hepatocyte spheroids 또는이 방법의 개별 응용 프로그램에 따라 더 이상 변환/선택 기간의 형성을 허용) 허용 동물 마 취와 반복에서 복구 하는 autotransplantation 셀 준비가 전에 마 취 유도 단계.
3. hepatocyte 절연
- 연결할 연동 펌프 (43 ° C 물 욕조에 유지) 따뜻한 분산 솔루션을 제공 하도록 설정 하는 관류와 간 섹션의 큰 노출된 혈관에 배치 하는 카 솔루션 온도 38 ° C는 조직에 소개 시. 모든 배관, 장비 및 솔루션 유지 되어야 세포 이식 적합 되도록 살 균.
- 프라임 펌프와 튜브 당 II와 I와 II 당 배달 조직에 당 사이 전환 배치 자 지까지. 당 놓고 프라임 튜빙 세트의 나머지 소개를 방지 하기 위해 완전히 인라인 거품 트랩을 작성 하는 자 지를 전환 조직에 기포.
- 깨끗 한 가로 수직 문맥 분 지의 횡단면을 간 순환을 잘라 준비 하 고 키 모 혈관 도관 법에 대 한.
- perfusate의 누설을 방지 하는 아늑한 피팅 카 테 터와 함께 사용할 수 있는 노출된 정 맥 catheterize 1 포털 cannulate 하 고 조직의 적절 한 관류를 위해 정 맥 간장 1.
- catheter(s)는 공기의 액/무료 정 맥에 카 테 터를 배치 하기 전에 확인 하십시오.
- 100 mL/min, 콘센트 튜브에서 정 맥을 정 맥 30 초 마다 1 분 주기를 통해 이동 15-20 분에 대 한 모든 사용 가능한 혈관에서 나 당 따뜻한 perfuse. 동안 난 당 주입, 대피 튜브 절차 트레이 비어 있는 진공에서 폐기물 컨테이너를 설정 합니다.
- 100 mL/min, 정 맥으로와, 당 30 분의 총 순환에 당 II로 전환. 2 당 동안 반환 펌프 사용 하 여 활성 효소의 준비를 보존 하기 위해 다시 관리를 위한 저수지에 다시 당 II를 재활용. 리턴 펌프 유출 펌프 보다 낮게 설정 (즉, 94 mL/min), 소스 병에 과도 한 공기를 반환 하지 않도록 주의 되 고.
- 간 캡슐 휴식,이 시간을 줄일 수 있습니다.
- 간은 완전히 소화 되지 경우 (남아 있지 않는다 부드러운 초점 압력 보조 개가) 관류의 추가 5 분을 수행할 수 있습니다.
- 때때로 (약 매 5 분) 문서는 hepatocytes 감기 하지 못하고 되도록 간 거품 트랩의 표면 온도. 간은 점점 추 워 하는 경우 (< 35 ° C) 38 ° c 가까이 간 온도 복원 물 목욕의 열을 증가 관류 진행 간 위임 해야 합니다.
- 간 살 균 격판덮개 또는 셀 문화 후드 수 수송을 위한 페 트리 접시를 제거 합니다. Hepatocyte 처리 하는 동안 무결성을 유지 하기 위해 무 균 드 레이프와 살 균 분야 커버.
- 무 균 드 레이프에서 간 절 하 고 찬 hepatocyte 세척 미디어 (HWM) 간 잠수함. 위쪽에 위를 드래그 하 여 캡슐을 방해. 멸 균 장갑 착용, 부드럽게 매체에 있는 hepatocytes 출시 간 마사지.
- HWM hepatocytes 멸 균 거 즈를 통해 큰 (~ 200 mL) 원심 분리기 병에 포함 된 필터링. 3 중으로 첫 번째 물의 resuspension 후 여러 병에서 셀 펠 릿 결합에서 다음 절차를 통해 hepatocytes 세척:
- 50 x g, 5 분, 4 ° C에서 원심 분리기
- 발음 하 고 HWM의 150ml에서 resuspend.
- HWM 3rd 세척 후 펠 릿을 둡니다.
- 가능한 한 hemocytometer 또는 다른 장치를 사용 하 여 셀 농도 계산 합니다. 이 세포는 ex vivo 유전자 치료, 세포 분류, 또는 autotransplantation에 앞서 다른 전문화를 포함 하 여 관심의 조작에 대 한 준비가 지금. 특정 농도 (셀/mL)를 대상으로 HWM의 최종 볼륨을 조정할 수 있습니다.
4. hepatocyte 변환
- 미디어에서 hepatocytes resuspend (Dulbecco의 수정된이 글 매체 [DMEM], 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS] 페니실린 스, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic [HEPES], dexamethasone, 표 피 성장 인자 [EGF] 산과 NTBC) 1-2 얼음에 원뿔 튜브에 mL 당 백만 셀입니다.
- Lentiviral 벡터 실 온에서 해 동 하 고 추가 감염 (MOI) 셀 바인딩할 대상 20 다양성에서 얼음에 원뿔 튜브. 세포 표면에 바이러스 성 벡터를 바인딩할 90 분 10 rpm에서 4 ° C에서 세포를 회전 합니다.
- 30-40 분 혼합 바인딩된 셀 시험 벡터를 촉진 하기 위하여 5 분 마다 반전에 대 한 37 ° C에 튜브를 전송 합니다.
- 셀 4 분 Resuspend 셀 펠 릿 얼음에 원하는 농도에서 식 염 수에 4 ° C에서 50 x g에서 원심 준비에서 바인딩되지 않은 모든 벡터의 제거를 보장 하기 위해이 세척을 반복 합니다.
- 만약에 가능 하다 면, 생존, 접착, 변환 효율성, 등등 을 위한 확인 (즉, 500000 셀 6에서 잘 당 잘 셀 문화 접시) 세포의 충분 한 aliquots 플레이트
참고: 그것 불가능 자주 특히 당일 절차에 대 한 autotransplantation, 이전에 이러한 매개 변수를 평가 합니다. 예를 들어 여기에 설명 된 절차는 알파-1 antitrypsin 간 특정 발기인, 쉽게 이식 전에 hepatocytes에서 assayable는의 통제 된 파 cDNA를 고용. 그러나, 이러한 도금된 셀 변환 (즉, 통해 서 부 럽)의 성공 또는 절차의 일반적인 성공의 예측 지표로 서는 autotransplantation 후속 분석 될 수 있다.
5. hepatocyte 이식
- 2 ~ 5 MHz 변환기를 사용 하 여 초음파를 통해 문맥을 식별 합니다. 18 G, 그것의 분기를 인접 주요 포털 정 맥 쪽으로 5 인치 바늘을 직접.
- 1 x 109 hepatocytes (약 10 g) 주사기를 사용 하 여 최대의 느린 수동 주입을 시작 합니다. 모니터 포털 압력 주입 카 테 터를 사용 하 여 이식 하는 동안.
- 포털 압력 증가 기준선 위에 8 mmHg, 주입을 일시 중지 하 고 초기 수준으로 반환 하는 압력을 허용 합니다.
- 포털 압력 일시 중지 후 기준선을 반환 하지 않는 경우 5 분 동안 주입 주입을 중단.
- 이식 및 카 테 터 제거 후 thrombotic 이벤트의 존재에 대 한 평가 문맥에서 흐름을 전달 하는 초음파를 사용 합니다.
6. 수술 후 회복 및 유지 보수
- 적절 한 복구 영역에 따라 이동한 동물 완전히 보 행, 필요에 따라 15-30 분 마다 따뜻한 담요로 체온 유지 또는 공기가 열 랩 심 박수, 산소 포화 온도 모니터링 될 때까지 관찰 합니다.
- Inappetence의 복싱으로 발생할 수 있는 위 궤의 기회를 줄이기 위해 매일 (의 끝을 통해 연구) 입으로 1 mg/kg omeprazole를 관리 합니다.
- Postoperatively, 동물 실험실 및 수의 직원에 의해 주의깊게 감시 하 고 일반적으로 수술 buprenorphine 복용량에서 별도 추가 진통제를 필요로 하지 않습니다. 고통/통증의 표시 된 수의학 케어 직원 (절 개를 지키고, inappetence, 혼 수)에 의해 관찰 된다, 항 염증 제 대리인 (즉, Carprofen) 관리할 수 있습니다.
7입니다. 조리법
- 이 프로토콜에서 사용 하는 조리법에 대 한 표 1 을 참조 하십시오.
| 시 약 | HWM | 시 약 | 난 (10 배) 당 | 제 2 차 당 (10 배) |
| 윌리엄스는-E 분말 (g/L) | 10.8 | NaCl (g/L) | 83 | 39 |
| NaHCO3 (g/L) | 2.2 | KCl (g/L) | 5 | 5 |
| HEPES (g/L) | 2.6 | HEPES (g/L) | 24 | 240 |
| 펜/Strep (100 x, mL/L) | 10 | EGTA (g/L) | 9.5 | - |
| 소 태아 혈 청 (mL/L) | 100 | N-아 세 틸-L-시스테인 | 8 | 8 |
| pH | 7.3 | (N-A-C, g/L) | ||
| 리세 (mL/L) | 5 | 5 | ||
| CaCl2 2 H2O (g/L) | - | 7 | ||
| 콜라 D (mg/mL) | - | 0.2 | ||
| pH | 7.4 | 7.6 |
표 1: 간 섹션에서 Hepatocyte 절연에 사용 되는 솔루션에 대 한 조리법.
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결과
간 절제 및 자가 이식 개요로 그림 1에 표시 됩니다. 5 돼지 간 절제 수술의 대표적인 일대에 대부분의 수확량 했다 > 1 x 109 hepatocytes 약 80% 생존 (표 2)와 함께 모든 종류의 많은 셀을 제공 하는 조작, 유전자를 포함 하 여 원하는 치료입니다. 각 그 5 돼지 보여 좋은 생존 및 접착, 전형적인 hepatocyte 형태학 46 시간 후에 변환 및 초기 도금 (그림 2)와 준비 hepatocytes의 비 이식 부분의 후속 문화. 이러한 결과 성공적인 준비의 대표 동안 가난한 결과 셀, 생존, 또는 최소한의 준수는 단층에 셀의 낮은 수와 함께 표시 될 것 이다.
파
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토론
이 보고서에는 비보 전 헌 유전자 치료 접근을 돼지 모델 HT-1의 치료를 설명 합니다. 그것은 교정 transgene 들고 lenti 바이러스 비보 전 hepatocyte 고립과 격리 hepatocytes의 변환 다음 부분 hepatectomy 포함. 수정된 헌 hepatocytes는 다음 다시 문맥8파 결핍 동물에 이식 됩니다. 설명 하는 방법을 몇 가지 수정 모든 큰 동물 모델에 적용 됩니다, 하지만 파 불충분 한 돼지는 매우 선택적 환경 수정된 셀13,15의 독특한 이점이 있다. 이 메서드는 HT-1에 대 한 효과적인 치료로 약 복용된 동물 쇼 화학적 측정 된 대사 산물과 염증 성 간 생체, 변과 HCC의 예방 및 초기 섬유 증 본의 완전 한 반전의 정규화 NTBC 독립적인 성장 NTBC와 사이클링. 또한, 최근 연구와 관련 된 광범위 한 조직...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 전문성 수술 절차 동안 지원을 위한 포털 정 맥 주입, 스티브 Krage, 조 앤 로버츠, 그리고로 리 Hillin를 수행에 대 한 드 웨인 Meixner을 감사 합니다. 이 작품은 어린이 병원의 미네소타 기초 및 재생 의학 미네소타에 의해 지원 되었다. R.D.H. 재생 의학 경력 개발 상을 위한 NIH K01 DK106056 보너스와 메이 요 클리닉 센터를 통해 투자 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-(2-니트로-4-트리플루오로메틸벤조일)-1,3-시클로헥산디온(NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12mm 투관침 | B12STS | ||
| 5mm 투관침 | B5SHF | ||
| 엔도 수술용 스테이플러 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| 엔도 수술용 스테이플러 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| 엔도 외과 스테이플러 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo 캐치 백 | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | 멸균 드레싱 |
| Williams'-E 파우더 | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | 시그마 알드리치 | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| 펜/스트렙 | Gibco | 15140-122 | |
| 소 태아 혈청 | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| 콜라겐분해효소 D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| 표피 성장 인자 | Gibco | PHG0314 |
참고문헌
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