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방법 논문

음이온 교환기 (Diethylaminoethyl-셀 루 로스 열)에 의해 혈액에서 아프리카를 포함 한 세포 외 Trypanosomes의 정화

9.4K 조회수

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DOI:

10.3791/58415

⸱

2019년 4월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Univ. Bordeaux UMR INTERTRYP 177 IRD CIRAD, 2IRD UMR 177 INTERTRYP CIRAD, 3CNRS, UMR 5234, Microbiologie Fondamentale et Pathogénicité, Univ. Bordeaux, 4Centre Hospitalier Université Bordeaux

이 논문에서

요약

혈액에서 trypanosome 분리의이 방법은 포유류 혈액 세포 보다 덜 부정 되 고 그들의 표면 충전에 따라 다릅니다. 감염 된 혈액은 놓이고 음이온 교환기 열에 치료. 이 방법, 아프리카 trypanosomiasis에 대 한 가장 피팅 진단 면역학, 생물학, 생화학, 제약 및 분자 생물학 수사에 대 한 정화 기생충을 제공합니다.

초록

이 메서드는 trypanosomes, 기생충 감염 된 혈액에서 인간과 동물 아프리카 trypanosomiasis (모자)에 대 한 책임의 분리 수 있습니다. 첫 번째 무대 모자의 진단 위한 가장 좋은 방법 이며 또한이 기생충 정화 방법 serological 허가 하 고 조사 연구.

모자는 체체파리 비행 전송 Trypanosoma brucei gambiense 에 의해 발생 및 T. b. rhodesiense. 관련된 trypanosomes는 동물 trypanosomiasis의 원인이 되는 에이전트. Trypanosome 탐지 모자 진단, 치료 및 후속 필수적 이다. 여기에 설명 된 기술은 가장 중요 한 기생충 검출 기법, T. b. gambiense 모자의 진단에 대 한 필드 조건에 적응 이며, 1 시간 이내 완료 될 수 있다. 혈액은 pH 8, 이전 조정 하는 음이온 교환기 열 (DEAE 셀 룰 로스)에 층이 고 차입 버퍼 추가 됩니다. 덜 부정 청구 trypanosomes 통과 하는 반면 매우 부정적으로 위탁 된 혈액 세포는 열에 흡착 됩니다. 수집 된 trypanosomes 원심 분리에 의해 수송과 있으며 현미경으로 관찰. 또한, 기생충은 그들의 infectivity 유지 하는 동안 세포 손상 없이 준비 됩니다.

순화 trypanosomes는 필요한 면역 테스트; 그들은 trypanolysis 분석 결과, 모자 혈 청 학에 골드 표준에에서 사용 됩니다. 얼룩진된 기생충 필드 혈 청 학에 대 한 카드 교착 시험 (CATT)에 활용 됩니다. 항 원은 변형 표면 당단백질, exoantigens, 같은 순화 trypanosomes에서 다양 한 immunoassays에도 사용 됩니다. 여기에 설명 된 절차는 아프리카 trypanosomes;에 대 한 설계 되었습니다. 따라서, 크로마토그래피 조건 호스트 포유동물의 각 종족의 피를 각 trypanosome 스트레인, 그리고 더 일반적으로 적용할 수 있다.

병원 체를 매혹적인 이들은 쉽게 순화 하 고 사용 수 생화학, 분자 세포 생물학 연구 호스트 세포 막 수용 체, 신호 전달, 유전자의 수준에서 호스트 기생충 관계 조사와 공동 문화를 포함 하 여 식; 약물 테스트 시험관; 유전자 삭제, 돌연변이, 또는 신진 대사 과정, cytoskeletal 속 기생충 생존에 overexpression의 조사.

서론

제시 하는 방법을 설명 여기 trypanosomes, 기생충 혈액에서 인간과 동물 아프리카 trypanosomiasis (모자)에 대 한 책임의 분리를 수 있습니다. 이 첫 번째 무대 모자의 진단 위한 가장 좋은 방법 이며이 기생충 정화 방법 강력한 serological 및 연구 조사를 허용 하는 또한.

모자는 체체파리 비행 전송 Trypanosoma brucei gambiense 와 T. b. rhodesiense1. 발생 이 protozoan 기생충 질병 (hemolymphatic 단계)의 첫 번째 단계에서 혈 류, 림프, 및 간 질 성 체액 extracellularly 곱하면 됩니다. 2 단계 (meningoencephalitic stage) 시작 때 기생충 혈액 뇌 장벽; 신경 징후,이 질병에 그것의 이름을 "잠자는 병" 주신, 수 면 장애를 포함 하 여이 2 단계2의 전형입니다. 관련된 trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei)는 동물 아프리카 trypanosomosis (AAT)3의 원인이 되는 에이전트.

세계 보건 기구 (WHO) 2020 공중 보건 문제로 모자를 제거 하 고 20304전송 중지를 목표로 합니다. 급속 한 진단 테스트의 최근 소개는 향상 된 혈 청 학적인 진단1,,45. 여러 가지 분자 진단 테스트 개발 되었습니다 하지만 필드 진단에 그들의 역할은 아직 되지 설립된5. 그들은 brucei 그룹 및 기생충 동물 trypanosomosis6에 대 한 책임에 의해 발생 하는 비정형 trypanosomiasis의 하위 종류를 식별 하는 데 사용 됩니다.

혈 청 학 틀린 긍정적이 고 불행 하 게도 틀린 부정적인 결과1을 줄 수 있는 기생충의 검출 진단, 치료 및 후속, 필수적 이다. 이러한 hemoflagellate 원생의 직접적인 현미경 관찰 모자 경우 발생 하는 T. b. gambiense, (케이스의 95% 이상)에 의해 낮은 parasitemias는 규칙으로 모자에 대 한 T. b. rhodesiense, 큰에 의해 발생 하는 반면에 어렵습니다. 기생충의 수는 자주 혈액에 존재 한다. 다양 한 농도 기술은 사용 된 두꺼운 드롭 등 세관 원심 분리 (CTC), 하지만 음이온 교환기 (DEAE 셀 룰 로스)의 열에 의해 혈액에서 기생충의 분리 다음 원심 분리와 현미경 관찰은 작은, 가장 민감한 방법 (혈액의 약 50 기생충/mL를 검출 될 수 있다)1,7. 따라서,이 음이온 교환기 (DEAE 셀 룰 로스) 메서드에서 trypanosomes의 정화는 최고 고, 데이트, 시각화 및 격리 모자 진단 위한 혈액에서 기생충에 대 한 참조 방법. 필드 조건에서 DEAE 룰의 미니 열 성공적으로 사용 되 고 현미경 관찰7,8을 촉진 하는 몇 가지 개선.

혈액, 아래 설명에서 trypanosome 분리의 방법은 포유류 혈액 세포9보다 덜 부정적 이다 기생충 표면 충전에 따라 다릅니다. 흥미롭게도,이 방법은 50 년 전, 박사 쉴라 란 햄에 의해 1968 년에 개발 되었다 고 검색 및 혈 류 trypanosomes의 준비에 대 한 황금 표준 남아. 그것은 빠르고 다양 한 포유류, 허용 하는 둘 다 인간과 동물 trypanosomiasis10의 진단에서에서 salivarian trypanosomes에 대 한 재현.

생활, 정화 기생충, 감염 된 혈액은 음이온 교환기 열에 추가 됩니다. 크로마토그래피 조건 (주로 pH, 이온 강도 버퍼/미디어의) 포유류 혈액 세포와 trypanosomes10각 믹스를 각 trypanosome 종, 그리고 더 일반적으로 적용할 수 있다. 차입 버퍼 pH 8 대부분의 아프리카 trypanosomes10정확 하 게 조정 됩니다. Parasitemias 너무 낮은 혼자, 현미경 관찰에 의해 검출 될 수 있기 때문에이 방법은 환자의 혈액에서 발견 하는 기생충의 농도 호의 하 고 실험실 조사 수 있습니다. 일 갓 격리 된 trypanosomes와이 기술을 사용 하 여 감염 된 동물의 혈액에 무기한 기간에 대 한 실험실에 있는 axenic 조건에서 배양 된 기생충으로 연구 보다는 다양 한 조사에 대 한 관련입니다.

호스트 기생충 관계는 기생충 감염, 따라서, 그것의 자연적인 호스트 T. musculi, 자연 murine 기생충, 세포 외 trypanosomes의 대표, murine 감염에 관련 된 많은 이점이 가장 공부를 작은 실험실 동물 생물 안전 수준 (BSL) 조건 필요 하지 않습니다. T. musculi 인간 병원 체를 포함 하 여 다른 많은 Trypanosoma 종 달리 immunocompetent 쥐 죽 일 하지 않습니다. T. musculi 는 T 세포를 박탈 쥐에서 제거 되지 하 고 parasitemias 식품 및 영양소 섭취 량11를 수정 하 여 감염 된 생쥐에서 증가할 수 있다. 이 기생충에는 다른 병원 체12co 감염에 면역 반응 조절 한다. T. musculi 교양된 T. musculi 에서 감염 된 쥐 전시 차이에서 예를 들어 막 Fc 수용 체의 식 T. musculi axenic 문화, 기생충 감염된 쥐13 에서 정화에 비해 손실 됩니다. , 14. Excreted 분 비 요소 (ESF) 또한 질적 및 양적 덜 axenic trypanosome 문화 표현 되며 발병 지역15에 고립 된 긴장 사이 다. ESF는 호스트 면역 시스템에 표시 되 고 그래서 플레이 초기 호스트에서 중요 한 역할 면역 응답16를 첫 번째 항.

실험적 감염 동물 실험실 조사,이 프로토콜 마우스 immunosuppressed 동물을 사용할 때에 특히 필요한 수를 최소화 하는 기생충의 더 많은 수에 용이. 변형 표면 glycoproteins (VSGs)에 사용 되는 카드 교착 테스트 Trypanosomiasis (CATT)에 대 한 대량 검사에는 여전히 쥐에서 전파 되는 trypanosomes에서 순화 된다. 2 급속 한 진단 테스트 (개별적으로 감싸인된 카세트)는 필드에서 사용 하기 위해 사용할 수 있는 네이티브 VSGs와 trypanosomes에 체 외에서 배양 하지1,4, 의 감염 모델 소스를 사용 하 아직도 5. 이후 자연스럽 게 또는 실험적으로 감염 된 호스트에서 대량 및 특히, 설치류 DEAE 룰 정화 기생충이 쉽게 얻을 수 있습니다 trypanosome 면역학 및 생물학의 연구에서 발전 촉진 되었습니다 있다.

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프로토콜

조사 관리 및 실험 동물 사용 (NIH 간행물 번호 85±23, 개정 1996)에 대 한 지침을 준수. 프로토콜은 우리의 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 동물

  1. 8 10 주 오래 된, 20-25 g, 주택 시설 15 일전 각 실험 동물에서 세 여성 스위스 (의 1) 마우스를 유지. 보호, 온도 (22 ℃)와 습도 (50%)에 보관 통풍이 상자에 그들을 집합니다 룸, 12 시간 라이트 사이클 온/오프 제어.
  2. 에 게 동물 무료로 음식과 물. 통증, 고통 및 고통을 최소화 하 고 환경의 농축을 제공.
  3. 주택, 일반 벽 감 금 소, 농축 나무 막대기와 골 판지 터널을 사용 합니다. 부드럽게 그것을 전송 케이지에서 손바닥에 터널으로 동물을 그립니다.
  4. 의식, 사회적 고립, 신체 상해, 뻗 치고 머리 또는 손질의 부족의 징후를 평가 하기 위해 일일 모니터링을 수행 합니다.
  5. 한 번 주 당 각 동물의 무게. 수 의사에 의해 정기적으로 검사를 수행 합니다.
  6. 자연 기생충에 대 한 parasitemia의 및 동물 죽음을 일으키는 원인이 되는 기생충에 대 한 피크에 혈액 수집, 추정 된 죽음 전날 혈액을 수집.
    참고: 전염 성 요원으로 모든 실험 대학 승인 지침에 따라 전용된 객실에서 수행 됩니다.

2입니다. 버퍼, 미디어 준비

  1. 각 물질을 무게와 증류수 다음 버퍼에 대 한 추가:
    1. 집중된 인산 염 버퍼 식 염 수를 준비 (2 x):
      나2HPO4 (무수) (MW 141.96 g) 10.14 g
      NaH2포4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.62 g
      NaCl (MW 58.44 g) 2.55 g
      H2O 1 l 증류수
    2. 인산 염 버퍼 식 염 포도 당을 준비:
      나2HPO4 (무수) (MW 141.96 g) 5.39 g
      NaH2포4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.31 g
      NaCl (MW 58.44 g) 1.70 g
      포도 (MW 180 g) 당 10 g
      H2O 1 l 증류수
    3. 1 M KH2포4를 준비 합니다.
    4. 인산 염 버퍼 염 분-포도 당으로 보충 차입 버퍼를 준비:
      페니실린 (100 U/mL), 스 (100 µ g/mL), 페 놀 레드 (5 µ g/mL).

3입니다. DEAE-셀 루 로스의 준비

  1. DEAE-셀 루 로스 준비를 위해 약 5 시간을 계획 합니다.
  2. 100 g DEAE-셀 루 로스의 좁은 목 플라스 크에 증류수 세척과 후 정착, 미세 입자를 삭제 수 있습니다. 세척을 반복 하는 상쾌한 분명 하다.
  3. Phosphate-Buffered 염 분 및 저 어 집중 2 3 L를 추가 합니다.
  4. 1 M KH2포4 8.0 pH를 조정 하 고 상쾌한 삭제.
  5. 두 번 증류수로 세척 하 고 정착을 두고.
  6. 세척 하 고 두 번와 3 리터 Phosphate-Buffered 염 분-포도 당을 정착 하 고는 supernatants 삭제.
  7. 셀 룰 로스의 볼륨 측정 고 동일한 볼륨의 Phosphate-Buffered 염 분-포도 당 추가, 플라스틱 병에 배포-20 ° c.에 저장

4입니다. 기생충

  1. 인간과 동물 trypanosomiasis 발병 지역에서 trypanosome 종자를 수집 합니다. 액체 질소에서 냉동 기생충을 유지.
    참고: Trypanosoma musculi 인 간에 게 병원 성 비 이며 안전 하 게 다양 한 실험실 실험에서 병원 성 trypanosomes를 대체 하는 데 사용 하는 extracellular trypanosome입니다.
  2. 실험실 조사 인간 병원 체를 요구, 경우 처리 전용된 적절 한 생물 안전 수준 (BSL) 조건 및 주의; 주의 실험 T. b. gambiense 및 BSL3 T. b. rhodesiense에 대 한 BSL2. 필드 조건에서 표준 미생물학 연습 설립: 샘플링, 기계적 pipetting, 표면의 빈번한 오염 및 폐기물의 살 균을 확보.

5. 마우스 감염

  1. 빠르게 37 ° c.에 물 목욕에 기생충을 녹여
  2. 해 동된 감염 된 혈액의 드롭 현미경으로 관찰 합니다. 운동 형태17의 비율을 측정 하 여 기생충 생존 능력을 평가 합니다.
  3. Intraperitoneally 마우스 (마우스 당 0.5 mL)에 기생충을 삽입할. 매일, 감염 된 후, 바늘 구멍에 의해 꼬리 혈액의 20 µ L를 수집 하 고 현미경 관찰. 나는 haemocytometer를 사용 하 여 여러 현미경 분야의 기생충을 계산 하 여 허버트 강평18 에 따라 parasitemia를 평가 합니다.
  4. Parasitemia는 각 변형에 대해 정의 된 임계값에 도달 하면 헤 파 린 (10 U/mL)를 포함 하는 차입 버퍼 (5 mL/마우스)에 혈액 (1 mL/마우스)를 수집 합니다.
    참고: Lanham Godfrey의 원래 고 소설 작품 인산 염의 최적의 이온 강도 버퍼링 염 포도 당 pH 8.0 재고 솔루션에서 여러 호스트/기생충 종에 대 한 보고.

6. 기생충 분리

참고: 이후이 시점에서 모든 실험은 장갑을 끼고 조직 문화 후드에서 수행 되어야 합니다. 실내 온도 습도 실험실 사용에 22 ° C와 45%에 각각 했다. 필드 조건에서 기생충 분리 성공적으로 수행 되었습니다 34 ° c.에

  1. 수직 지원에 10 mL 주사기를 놓고 이전 컷된 원형 필터 종이, 유리 솜 또는 셀 루 로스 갯 솜의 조각을 추가 합니다.
  2. 붓고 DEAE 룰 주사기 8 mL 수준에 도달 하면, 다음 차입 버퍼의 25 mL로 씻어 때까지.
  3. 신중 하 게 칼럼의 상단에 희석된 혈액의 2 개 mL를 추가 하 고 추가 차입 매체. 정기적으로 trypanosomes의 이동에 따라 차입 버퍼를 추가 합니다.
  4. 원심 분리기 튜브에서 열에서 유출 액을 수집 하 고 현미경으로 기생충의 존재에 대 한 정기적으로 확인.
  5. 때 기생충 이상 열 유출에 감지, 원심 관 (1800 x g, 10 분, 실험실에서 4 ° C에 주위 온도 필드 조건에).
  6. 상쾌한을 제거 하 고 조사 단계에 필요한 관련 매체의 1 mL에 기생충을 중단.
  7. hemocytometer와 기생충을 계산 하 고 필요한 경우 적절 한 매체에서 그들을 희석.

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결과

순화 trypanosomes 제약 테스트에 사용 되었습니다. 기생충은 포함 하는 특정 약물, 혼자 또는 혼합19의 직렬 희석 문화 우물으로 전송 됩니다. 현미경 관찰, 운동 성 평가 생존의 표식만 몇 dugs 테스트 중인 때 수행할 수 있습니다, 그리고 반면 AlamarBlue 세포 생존 능력 분석 결과 약20를 심사 하는 동안 큰 운동 성 분석에 대 한 훌륭한 방법입니다. Pentamidine, 모자 치료에 사용 되는 참조 약물의 효과 그림 1에 표시 됩니다.

대 식 세포 피더 세포로 문화에 매우 유용 하다. 그들은 허용, 생체 외에서, 개시 및 trypanosome의 개발21...

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토론

순화 trypanosomes 면역학, 생화학, 세포 및 분자 생물학을 공부 하는 강력한 수단을 나타냅니다. 데이터 및 결과의 큰 확대는 다음 도움이 되는 정보를 얻기 위해 다른 진 핵 세포30trypanosomes에서 얻은 되어 있다. Trypanosomes는 또한 중요 하 고 흥미로운 연구 주제 때문에 그들은 생존 하 고 두 개의 매우 다른 환경에서 성장 하는 그들을 허용 하는 수많은 기계 장치를 고안 했다: 체체파리 비행 벡터 및 포유류 호스트23, 31. trypanosomes을 다양 한 기술을 보고 되었습니다, 그리고 마이크로-기반 접근에 대 한 리뷰는 최근 게시 된32. 따라서, 기생충 분리의 재현성 및 강력한 수단 필수적 이다.

DEAE 룰 준비는이 기생충 준비 프로토콜에서 필수...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD 대학교 드 보르도의 모든 회원을 감사합니다. 이 연구는 보르도의 대학에서 내부 자금에 의해 지원 되었다 및 지원 LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, ANR 및 협회에서 부 르 지속 가능성 드 라 검색 en parasitologie 외 두개골 트로피와 서비스 드 coopération 동부 표준시 d'action culturelle de l'Ambassade de 프랑스 à 방기 (Centrafrique).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10mL 피펫 Falcon357,551
2 mL 피펫 Falcon352,507
원심분리 튜브 50 mLFalcon352,070
원심분리기Sigma Aldrich4K15
DEAE 셀룰로오스Santa Cruzs/c- 211213100 G
여과지 Whatman1,001,125
평면 바닥 플라스크 좁은 목Duran21 711 766000 mL
포도당 VWR101174Y500 G
헤파린시그마 AldrichH3149-50KU5 000 U
KH2PO4VWR120 26936.260500 G
현미경OlympusCH-20
현미경 커버슬립Thermofisher 과학CB00100RA020MNT0
현미경 슬라이드Thermofisher scientificAGAA000001
Na2HPO4 폭스바운드100 28026; 260500 G
NaClVWR27800.2911 KG
NaH2PO4 폭스바운드110 33616; 262500 G
Nalgene 플라스틱 미디어 병 크기 125 mLThermofisher scientific342024-0125
Nalgene 플라스틱 미디어 병 크기 500 mLThermofisher scientific342024-0500
파스퇴르 피펫VWRBRND125400
페니실린 10,000 UI/스트렙토마이신 10,000 &마이크로; gEUROBIOCABPES01 OU100 mL
페놀 레드시그마 알드리치P0290100 mL
주사기 DutscherSS+10S21381
조직 배양 후드Thermoelectro CorporationMSC-12
Trypanosoma brucei bruceiInstitute of Tropical Medicine (벨기에 앤트워프).ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambienseInstitute of Tropical Medicine (벨기에 앤트워프).ITMAP 1893
Trypanosoma musculiLondon School of Hygiene and Tropical Medicine (영국)Partinico II

참고문헌

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음이온 교환기 (Diethylaminoethyl-셀 루 로스 열)에 의해 혈액에서 아프리카를 포함 한 세포 외 Trypanosomes의 정화
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