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방법 논문

아 급성 대뇌 Microhemorrhages 쥐에서 Lipopolysaccharide 주입에 의해 유도 된

6.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58423

⸱

2018년 10월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Shanxi Medical University, 2Department of Neurology, PLA Army General Hospital, 3Department of Neurology, NO 261 Hospital of PLA

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

선물이 유도 하 고 탐지 LPS 주입 수 있습니다 Sprague-Dawley 쥐에 의해 발생 하는 CMHs CMHs의 병 인에 대 한 연구 조사 미래에 활용 하는 프로토콜.

초록

대뇌 microhemorrhages (CMHs) 노인된 환자에서 일반적 이며 다양 한 정신병 무질서에 상관. CMHs의 병 인은 복잡 한, 그리고 neuroinflammation 동시 발생으로 자주 관찰 됩니다. 여기, 우리가 설명 하위 급성 lipopolysaccharide (LPS) 주입, 조직 CMHs. LPS 주입을 탐지 하기 위한 방법에 의해 유도 된 CMHs 쥐 모델은 상대적으로 경제적, 간단 하 고 비용 효율적인. LPS 주입의 주요 장점 중 하나는 염증을 유발 하는 안정성입니다. CMHs LPS 주입으로 인 한 총 관찰, 되며 (그) 오신 얼룩, Perl의 프러시안 얼룩, 에반스 블루 (EB) 더블 라벨 및 자기 공명 영상-민감성 가중치 이미징 (MRI-SWI) 기술 검출 될 수 있었다. 마지막으로, 그들의 이점 및 단점를 포함 하 여 CMHs 동물 모델 개발의 다른 방법 또한이 보고서에 설명 되어 있습니다.

서론

클래식 대뇌 microhemorrhages (CMHs) 뇌1적혈구에서 작은 혈관 주위 예금 hemosiderin 같은 혈액 저하 제품의를 참조 하십시오. 로테르 담 스캔 연구, CMHs 60-69 년 세의 거의 17.8%와 80 년2에 그들에 38.3%에 찾아낼 수 있었다. 노인에서 CMHs의 보급은 상대적으로 높은, 그리고 CMHs의 축적과 인지 및 정신병 장애 사이의 상관 관계 설립된3,4되었습니다. 여러 동물 모델 CMHs의 최근 보고 된, 유형 IV 콜라 stereotaxic 주입5, APP 유전자 변형6, β-N-methylamino-L-알라닌 노출7, 및8, 고혈압 유발 설치류 모델을 포함 한 와 함께 가장 잘 허용된 선택의 하나로 서 조직의 염증에 의해 유도 된 CMHs. 피셔 외. 9 처음 급성 CMHs 마우스 모델을 개발 살 모 넬 라 typhimurium 에서 파생 된 LPS를 사용. 그 후, 같은 그룹 같은 방법을2를 사용 하 여 하위 급성 CMHs 마우스 모델의 개발을 보도 했다.

LPS는 복 주입을 통해 표준화 된 염증 성 자극으로 간주 됩니다. 이전 연구는 많은 양의 microglia 반영 LPS 주입 neuroinflammation 일으킬 수 및 동물에 사이토 활성화 모델2,10확인 했습니다. 또한, neuroinflammation 활성화의 활성화 및 CMHs의 수 사이 긍정적인 상관 관계가 설립된2,10되었습니다. 이러한 이전 연구를 바탕으로, 우리 있었다 하 라는 메시지가 CMHs 쥐 모델 개발 LPS의 복 주사.

검색 기술 CMHs에 대 한 연구 조사에의 증가 귀착되 었 이동 합니다. 가장 널리 인정 hematoxylin와 얼룩, 프러시안 블루9, 착 색 제 2 철 철 감지 (그는) 오신 붉은 혈액 세포의 탐지를 포함 하는 검색 하는 CMHs 에반스의 블루 면역 형광에 의해 증 착 (EB) 이미징, 그리고 7.0 테슬라 자기 공명 영상-민감성 가중치 이미징 (MRI-SWI)10. 현재 연구의 CMHs에 대 한 심사 방법을 개발 하는 것을 목표로.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) PLA 육군 종합 병원에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 자료

  1. LPS 주입의 준비
    1. LPS 분말 1 mg/mL의 최종 농도에 S. typhimurium 에서 파생 된의 25 mg을 증류수 25 mL를 추가 합니다. 저장소 4 ° c.에 무 균 튜브에 주입
      주의: LPS 독성이 있다.
    2. EB 주입 작업 농도에서 계속 정상적인 0.9% 소금물에 2 %EB 솔루션을 준비 합니다.

2입니다. 동물

  1. 10 주 세 남성 Sprague-Dawley (SD) 쥐에 LPS를 관리 (평균 무게: 280 ± 20 g) 복 주사.
    주의: 쥐가 다른 조직에서 구입 하는 경우 다음 적응 단계 해서는 안됩니다 7 일 미만.

3. LPS 주사

  1. 1 mg/kg의 복용량에 각 쥐에 intraperitoneally LPS를 주입 하 고 그들의 홈 케이지를 쥐를 반환 합니다.
    참고: 마 취는 필요 하지 않습니다.
  2. 6 시간 후에, LPS는 쥐로 주입의 동일한 복용량 주입.
  3. 16 시간 후 쥐에 LPS의 동일한 복용량을 주사.
    주의: 사망률 5%에서에서 발생할 수 있습니다 1 mg/kg의 복용량에 LPS와 SD 쥐를 주입. 사망 율 더 젊은 이상 쥐 또는 임신 여성 쥐에 증가할 수 있었다.
  4. LPS 주입 후 그들의 감 금 소에 쥐를 반환 하 고 음식과 음료에 대 한 광고 libitum 액세스 제공.
    참고: 쥐 별개 조직의 염증 반응, 전시 하 고 따라서 그것은 감 금 소는 실험을 통해 깨끗 한 유지 필수적입니다. 쥐 해야 될 자주 (2 x 일) 모니터링 무게, 일반적인 모양 및 태도 대 한 첫 번째 LPS 주입 후. 쥐 돌출된 자세, 이동 하는 방식은, 상당한 체중 감소를 전시 하기 위하여 시작 하는 경우 (> 20%), 7 일 전에 EB 연구 끝점 안락사 포 르 피 린 착 이어서 편안 하.

4. 샘플 컬렉션

  1. EB 주입
    1. 첫 번째 주사 후 7 일 anesthetize intraperitoneally 승인된 IACUC 프로토콜에 의해 쥐.
    2. 쥐 각 막 반사 응답을 표시 하지 않습니다 때까지 1-2 분을 기다립니다. 5-8 밀리미터를 수행-각 쥐;에 깊은 심장 펑크 찌른 포인트 3, 4 늑 공간에 흉 골의 왼쪽된 여백 5 m m 이어야 한다.
    3. 혈액 복구, 관찰 될 때까지 기다려야 하 고 주입 EB 0.2 mL/100 g 체중의 복용량에서 왼쪽된 심장 심 실.
      주의: 심장 펑크와 EB 주입 수 신중 하 게 수행 한다. EB 흉 강 또는 왼쪽된 심장 심 실 대신 심장에 주입 될 수 있습니다.
      1. 빈 관으로 다시 빨 아 하 고 실패율을 줄일 수 있도록 주입 전에 EB 튜브에이 볼륨을 바꿉니다 (예., 오류에 의해 흉 곽에 주입).
    4. 10 분 동안 부정사 위치에 쥐를 유지.
      참고: 샘플 면역 형광 이미징에서 EB 누설 감지를 사용 하지 않으면, 다음이 단계를 생략할 수 있습니다.
  2. 총 관찰
    1. 심장 perfusions 대뇌 맥 관 구조와 두뇌를 차가운 1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 사용 하 여 수행 합니다.
      1. 메스를 사용 하 여 횡 경 막의 전체 길이 걸쳐 복 부 절 개를 확인 합니다.
      2. 그냥 갈비를 통해 컷 왼쪽 흉 곽 중간.
      3. 흉 강에 열어. 클램프를 사용 하 여 마음을 노출 하 고 혈액과 다른 체액의 배수 장치를 촉진 하기 위하여.
      4. 직접 삽입이 연장에 약 5 mm. 좌 심 실의 돌출에 바늘 항목의 지점 근처 클램핑 하 여 그 위치에 바늘 보안 꾸준히 집게 (심장 해야 여전히 수 박동)와 마음 잡고.
        주의: 하지 지나치게 확장지 않습니다 바늘, 실내 벽을 관통 하 고 타협 솔루션의 순환 수로.
      5. 약 20 mL/min 살포 펌프를 사용 하 여에서 느리고 꾸준한 속도로 흐름 얼음 처럼 차가운 PBS 솔루션 (200-300 mL) 수 있도록 밸브를 해제. 동물 총 관측 대신 고정 필요, 얼음 처럼 차가운 0.9% 생리 식 염 수의 동일한 복용량을 사용 합니다.
      6. 날카로운가 위를 사용 하 여, 아 트리 움, 솔루션 지속적으로 흐름 보장에 절 개를 확인 합니다. 만약 유체 흐름을 자유롭게 하지 않습니다 또는 동물의 코 또는 입에서 오고 있다, 바늘 위치를 변경할.
    2. 총 관찰에 의해 CMHs에 대 한 화면입니다.
      참고: 샘플 총 관찰에 의해 CMHs의 숫자를 계산에 사용 하지 않으면, 다음이 단계를 생략할 수 있습니다.
  3. 고정
    1. 심장 perfusions 얼음 0.9% 생리 식 염 수 (200-300 mL) 대뇌 맥 관 구조를 취소 하 고 두뇌를 사용 하 여 수행 합니다.
    2. 심장 perfusions 고정을 위한 얼음 4 %paraformaldehyde 사용 하 여 수행 합니다.
    3. 목을 벨 쥐, 뇌를 분리 하 고 적어도 6 h에 대 한 20% 자당 해결책에 뇌를 담 궈.
    4. 30% 자당 및 다른 6 h. 에 대 한 수정으로 솔루션을 변경
  4. cryostat를 사용 하 여 10 m m 두께 뇌 조직 섹션을 준비 합니다.

5. 그 얼룩

참고:이 절차는 그 얼룩 키트를 사용 하 여 수행 됩니다.

  1. 씻고 증류수에 슬라이드.
  2. 수돗물에 5 분 동안 실행 되며 솔루션 8 분 세척 얼룩.
  3. 1 분 동안 수돗물을 실행에 30 미 세척에 대 한 1% 산 알코올에 구분 합니다.
  4. 0.2% 암모니아 물 (청소법)에 얼룩 또는 포화 리튬 탄산염 30 솔루션 1 분 씻어 수돗물에 5 분 동안 실행 s.
  5. 린스에 95% 알코올 (10 딥).
  6. Counterstain 30 오신 솔루션 s 1 분.
  7. 95% 알코올, 5 분에 대 한 절대 알코올의 2 개의 변화를 통해 탈수.
  8. 30 대 한 자일 렌에 분명 s.
  9. Liu의 방법9를 사용 하 여 탑재 합니다.
  10. 대물 형광 현미경을 사용 하 여 분석 합니다.
    참고: 붉은 혈액 세포는 CMHs의 구성 요소, 혈관에서 발표 레드-오렌지 얼룩 그 아래에 나타납니다.

6. 펄 프러시안 파란 얼룩

참고:이 절차는 Perls 얼룩 키트를 사용 하 여 수행 됩니다.

  1. 증류수와 슬라이드를 씻어.
  2. 등분 혼합 ferrocyanide 및 10 분에 대 한 염 산의 반응 솔루션에 얼룩.
  3. 탈수, 취소, 마운트, 그리고 5.7-5.10 단계에 설명 된 대로 슬라이드를 분석.

7. EB 더블 얼룩

참고:이 절차는 단계 4.1.3 다음과 같습니다.

  1. 5 분에 대 한 세 번 PBS와 슬라이드를 씻어.
  2. 4', 실 온에서 15 분 동안 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션으로 슬라이드를 품 어.
  3. 각, 5 분에 대 한 세 번 PBS 솔루션 슬라이드를 세척 하 고 PBS 글리세롤 솔루션 슬라이드 마운트.
  4. 형광 현미경에서 이미지를 분석 합니다. EB 증 착 빨간 형광;로 표시 핵은 블루 형광으로 표시 됩니다.

8입니다. MRI-SWI

  1. 적극적으로 차폐 된 그라데이션 시스템 (내경 16 cm) 7 T 자석에 MRI를 수행 합니다.
  2. 치료 후, 7 일 1.5-2.0% isoflurane isoflurane 마 취 시스템을 사용 하 여의 안 면 흡입 하 여 쥐를 anesthetize.
  3. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 적용 됩니다.
  4. 경향이 위치에 쥐를 유지 하 고 MRI SWI 스캔을 수행.
  5. SWI가 중 검사 다음 매개 변수를 사용 하 여 빠른 회전 급강하 에코 시퀀스를 사용 하 여 얻을: 에코 시간 (TE) 8 ms, 반복 시간 (TR) 40 ms, 대칭 이동 각도 = 12 °, 시야 (FOV) 35 m m × 35, 인수 매트릭스 384 × 384, 1 m m 두께 슬라이스를 얻으려고.
  6. 그린 버그 외 에 따라 MRI SWI에 CMHs를 식별 11, 다음 조건을 포함 하는: (1) ≤ 10 mm, 그리고 (2) 원형, 고립 된, 그리고 낮은 신호 강도 반점의 직경.
  7. 실험의 끝에, 과다 복용 (6 L/min의 흐름) 또는 컨테이너 볼륨의 30%에서 이산화탄소 방법을 사용 하 여 쥐를 안락사.

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결과

CMHs는 다양 한 방법을 사용 하 여 검색할 수 있습니다. 가장 잘 받아들여 메서드는 다음과 같습니다: (1) 총 관찰 및 평가의 표면 CMHs ( 그림 1, 위쪽 패널에에서 표시 된); (2) 그는 적혈구 ( 그림 2A에 표시 된, 상단 패널) 또는 프러시안 얼룩 검출 제 2 철 철의 검출에 대 한 얼룩 적혈구 (그림 2A, 하단 패널);의 세포에서 파생 된 (3) EB BBB 누설 (그림 3, 왼쪽 패널);에서 파생 된 EB 증 착의 검출에 대 한 얼룩을 두 배로 (4) MRI-SWI CMHs hypointense 신호 (그림 4, 왼쪽된 패널)의 탐지.

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토론

CMHs에 대 한 조사 연구는 지난 몇 년 동안에서 증가 하고있다. 그러나, CMHs의 메커니즘 불분명, 과학자 들이 특정 조건을 시뮬레이션 하는 동물 모델을 확립 하 라는 남아 있습니다. 예를 들어 호프만 외. 개발 hypoxia 유발 CMHs 마우스 모델 CMHs 저 산소 증 및 뇌혈관 autoregulation12의 중단에 의해 발생 보여줍니다. 로이터 외. 5 보여준 그 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy CMHs 피셔 외. 의 병 인에 중요 한 역할 보고 LPS 주입9에 의해 유도 되었다 CMHs 마우스 모델 (CAA) 놀이, APP23 유전자 변형 쥐에 CMHs 모델을 설립 하 CMHs는 염증2,,13

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 교사 Jian Feng 레이 MRI 동안 가이드에 대 한 수도 의과대학에서 동료 감사합니다. 우리는 또한 선사 쩡 신경과 부, 기술 지원 제공에 대 한 창 두 번째 사람들의 병원에서에서 감사 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염증 유도를 위한LPSSigma-AldrichL-2630
EB 누출 감지를 위한EBSigma-aldrichE2129
DAPI 염색 용액ServicbioG1012카운트 매체 IF
Perl' s 프로이센 염색SolarbioG1424프로이센 염색
용 키트 HE 염색SolarbioG1120키트 HE 염색
클로랄 수화물Sigma-Aldrich47335U마취
인산염 완충액 식염수 (PBS)SolarbioP1022실험에서 일반적으로 사용되는 완충 용액의 일종
0.9 % 식염수Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., 중국관류
용액 파라포름알데히드Sigma-Aldrich158127고정에 일반적으로 사용되는 용액의 일종
SolarbioG2461고정에 일반적으로 사용되는 용액
30% 자당 용액SolarbioG2460고정
수의사 연고Solcoseryl 눈 젤, Bacel, 쥐의 눈 보호를 위한
용 은 에 일반적으로 사용되는 용액의 일종 스위스

참고문헌

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