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방법 논문

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

8.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58429

⸱

2018년 10월 18일

 , 
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

이 논문에서

요약

여기, 우리 3 성인 zebrafish 부상 모델 및 면역 억제 약물 치료와 결합 된 그들의 사용을 설명합니다. 우리는 거기에 뼈 강화 작용을 감지 및 조직 재생의 이미징에 지침을 제공 합니다.

초록

Zebrafish 절단 후 부속 (핀)를 포함 하 여 다양 한 장기를 다시 생성할 수 있습니다. 이 부상 후 약 2 주 이내 regrows 뼈의 재생을 포함 한다. 또한, zebrafish trepanation는 두개골의 후 뼈를 빠르게 치유 하 고 복구 zebrafish 뼈 탄 미 익 광선에 쉽게 도입 될 수 있는 골절 수 있습니다. 이러한 상해 분석 빠르게 뼈 형성에 관리 약물의 효과 테스트 가능한 실험 패러다임을 나타냅니다. 여기, 우리는 이러한 3 부상 모델의 사용과 뼈 억제 하 고 면역 억제 효과 미치는 조직의 glucocorticoid 치료와 함께 그들의 결합된 사용 설명. 우리 성인 zebrafish에 면역 억제 치료에 대 한 준비, 지 느 러 미 절단, calvarial 뼈와 지 느 러 미 골절의 trepanation 수행 하는 방법을 설명 하 고 스테로이드 제제의 사용에 미치는 두 뼈 형성을 설명 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 osteoblasts 그리고 뼈 조직에 있는 타고 난 면제의 일부로 monocyte/대 식 세포 계보의 세포.

서론

Zebrafish는 척추 개발 및 질병 연구에 강력한 동물 모델을 나타냅니다. 그들은 매우 잘 번 식 하는 작은 동물 및 그들의 게놈은 완전히 시퀀스이 고 조작1의무가 있다는 사실 때문입니다. 다른 장점은 지속적인된 라이브 이미징 vivo에서 화상 진 찰 성인 zebrafish2, 및 높은 처리량 약 스크린 zebrafish 애벌레3에서 수행할 수 있는 능력을 포함 한 여러 단계에서 수행 하는 옵션을 포함 합니다. 또한, zebrafish 장기와 조직, 뼈 등의 다양 한에서 높은 재생 능력을 보유 하 고 따라서 골격 질환을 연구 하 고 수리4,5유용한 시스템 역할.

Glucocorticoid 골다공증 (GIO) 예 천식이 나 류 마티스 관절염과 같은 자가 면역 질환 치료 과정에서 스테로이드 제제와 장기 치료에서 결과 질병 이다. GIO는 glucocorticoid 치료 환자의 약 30%에서 개발 하 고 주요 건강 문제6;를 나타냅니다. 따라서, 그것은 훌륭한 세부 사항에서 뼈 조직에 면역 억제에 미치는 영향을 조사 하는 것이 중요입니다. 최근 몇 년 동안에서 다양 한 GIO의 병 인을 다루는 zebrafish 모델 개발 되었습니다. Glucocorticoid 중재 뼈 손실 zebrafish 애벌레, 예를 들어 마약 화면7뼈 질량을 증가 하는 counteractive 화합물의 식별에 지도에서 유발 되었습니다. 또한, 뼈 glucocorticoid 유발 억제 효과에 유사 되었습니다가지고 zebrafish 비늘 생체 외에서 그리고 vivo에서8,9. 이 분석 실험은 매우 설득력 있는 접근, 그것에 관해서 특히 소설 면역과 뼈 근육 약물의 식별. 그러나, 그들은 부분적으로 endoskeleton 고려 하 고 재생 컨텍스트에서 수행 되지. 따라서, 그들은 성인, 재생 뼈 형성의 빠른 모드 동안 glucocorticoid 중재 효과의 조사를 허용 하지 않습니다.

여기, 선물이 성인 zebrafish 뼈 재생을 겪고 glucocorticoid 중재 효과 공부 하는 연구자를 사용 하는 프로토콜. 부상 모델은 zebrafish 꼬리 지 느 러 미, 지 느 러 미 레이 골절 (그림 1A-1 C)의 창조 뿐만 아니라, 두개골의 trepanation의 부분 절단을 포함 하 고 glucocorticoid 노출을 통해 인큐베이션 (그림 1E와 결합 ). 최근 성인 zebrafish 지 느 러 미와 두개골 뼈10회생에 prednisolone, 일반적으로 된 코르 티 코 스테로이드 약물 중 하나에 노출의 결과 설명 하기 위해이 프로토콜의 일부를 사용 했습니다. Zebrafish에 prednisolone 관리 감소 osteoblast 확산, 불완전 osteoblast 차별화 및 monocyte/대 식 세포 계보10apoptosis의 급속 한 유도 이끌어 낸다. 이 프로토콜에서 우리 또한 설명 어떻게 골절 한 뼈 핀 레이 세그먼트11, 도입 하실 수 있습니다이 방법은 골절 복구 중 발생 하는 뼈에 glucocorticoid 중재 효과 공부를 할 때 유용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법을 빠르게 뼈 재생에 glucocorticoid 행동의 메커니즘을 기본 추가 주소에 도움이 될 것입니다 그리고 zebrafish 조직 재생의 맥락에서 체계적 약국의 다른 설정에도 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법 Landesdirektion 드레스덴에 의해 승인 (허가 번호: AZ 24 D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).

1입니다. 재료 및 솔루션의 준비

참고: Prednisolone, 다른 스테로이드 제제와 같은 이끌어 낸다 면역 억제. 따라서, 실험 기간 동안 치료 동물에 감염을 방지 하기 위해 예방 조치를가지고 한다. 하이 엔드, 압력솥 유리 도자기 '물 물고기' (즉, 성인 zebrafish 후면에 사용 되는 물) 실험을 시작 하기 전에.

  1. 실험에 사용 될 zebrafish의 수를 계산 합니다. 개인 컨트롤 역할을 포함 해야 합니다.
  2. 압력솥 600 mL 유리 커 고압 테이프와 알루미늄 호 일로 덮여 있다. Zebrafish는 개별적으로 처리 됩니다, 그리고 따라서 1 유리 비 커 zebrafish 당 필요 합니다.
  3. 물고기 물 실험에 필요한 금액을 계산 합니다. 300 mL는 개인과 일 당 필요 합니다. 실험의 길이 고려 (예를 들어, 1 주/7 일).
  4. 생선 물으로 병을 채우기, 그들 및 고압 오토 클레이 브 테이프와 병. 이상적으로, 2 리터 병을 사용 하지만 1 L 또는 L 5 같은 다른 병 에서도 사용할 수 있습니다.
    참고: 실험은 긴 경우 (예를 들어, 4 주/28 일)와 유리 병의 양이 제한, 최소 한 번에 몇 일에 대 한 병을 준비 하 고 실험을 통해 (1.3 1.4) 과정을 반복.
  5. Dimethylsulfoxide (DMSO)에 살 균 필터링 100mm prednisolone의 prednisolone 재고 솔루션을 준비 합니다. 1 mL 또는 2 mL microcentrifuge 튜브 aliquots 재고를 고정 합니다.
    주의: 항상 때 의류 착용 보호 협력 prednisolone (보호 장갑, 안전 고글, 실험실 외 투).
  6. 실험의 첫 날, 각각 prednisolone와 DMSO, 부 화 솔루션을 준비 합니다. 이 위해, 100 mM prednisolone 재고 솔루션의 필요한 금액을 녹여 고 50 µ M의 최종 농도에 압력가 물고기 물에 prednisolone을 추가 합니다.
    1. 대 한 제어 치료 압력가 물고기 물에 DMSO의 해당 볼륨을 추가 합니다. 예를 들어, 2 L prednisolone 포함 물고기 물 생산, 추가 100 mM prednisolone 재고의 1 mL 2 L 물고기 물. 생선 물 2 L 병, 추가 1 mL DMSO, 대응 하 게.
    2. 27 ° c.에서 이상적으로 약물 치료를 수행 하도록 지정 하는 적절 한 장소에서 작업

2입니다. 제 브라 지 느 러 미에 상해의 세대

참고: zebrafish 지 느 러 미에 뼈 손상, 지 느 러 미 (꼬리 지 느 러 미에 보통 절단)의 절제를 수행 하거나 개별 뼈 탄 미 익 광선 (골절 모델) 골절 합니다. 이 위해 먼저 성인 zebrafish를 anaesthetize.

  1. 절단
    1. 100mm 직경 0.02%를 포함 하는 배양 접시 준비 성인 zebrafish, anaesthetize를 물고기 물 (이 물 필요가 없습니다 압력가 마로 소독 될)에서 MS-222 (에틸-3-aminobenzoate methanesulfonate).
      1. 물고기 그물을 사용 하 여 MS-222 포함 된 배양 접시를 한 번에 하나의 zebrafish를 전송 하 고 운동 없이 그것의 측면에 터치에 응답 하지 않는 때까지 그것을 품 어. 무딘 집게와 항문 지 느 러 미를 만져 후자 테스트 합니다.
      2. 마 취의 수준 4는 지 느 러 미 절제12에 대 한 적절 한 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 이 단계에서 opercular 운동의 속도 감소 하 고 근육 손실 됩니다 물고기 터치12시 이동 하지 않습니다.
    2. 무뚝뚝한 겸 자 하 고 신중 하 게 100 mm 페 트리 접시의 뚜껑을 쏘아 anaesthetized zebrafish 전송. 그것의 옆에 제 브라를 놓습니다. 예를 들어 자신의 오른쪽 몸 측면에 동일한 방향에 항상 거짓말 zebrafish 있는지 확인 합니다. 메스 또는 면도칼 블레이드, 지 느 러 미 (그림 1A, 2A)의 50%를 resect.
      참고: zebrafish 지 느 러 미 재생 속도 절제 지 느 러 미 조직의 금액에 따라, 즉, 더 많은 지 느 러 미 조직 절제는, 빨리는 지 느 러 미13재생성. 따라서, 최소화 하기 위해 지 느 러 미 재생에 변이 항상 모든 zebrafish의 동일한 수준에 지 느 러 미를 resect 있는지 확인 합니다.
    3. 부상된 zebrafish prednisolone 또는 압력가 물고기 물 포함 된 DMSO의 300 mL를 포함 하는 압력가 유리 비 커에 전송. 커버 알루미늄 호 일로 제 브라의 탈출 방지를 유리 비 커.
    4. 2.1.2 2.1.3 단계를 반복 하 여 실험에 대 한 제 브라의 필요한 수에 도달.
  2. 지 느 러 미 분쇄
    1. 물고기 물 또는 e 3에서 2 %agarose 용액을가 열 하는 agarose 코팅 100 mm 페 트리 접시를 준비 (배아 미디어 3, 50 m m 염화 나트륨, 염화 칼륨 0.17 m m, 0.33 m m 칼슘 염화 물, 0.33 m m 마그네슘 황산 염). 신중 하 게 페 트리 접시에 솔루션의 대략 10-15 mL를 붓으십시오. 접시의 바닥을 완전히 처리 되어야 합니다. Agarose를 공고히 하자.
    2. 섹션 2.1에에서 설명 된 대로 제 브라를 anaesthetize.
    3. 무뚝뚝한 겸 자 고 anaesthetized zebrafish agarose 코팅 100 mm 페 트리 접시를 신중 하 게 전송. 그것의 옆에 제 브라를 놓습니다. 해 부 현미경 아래 완전히 별개 뼈 핀 광선을 식별 하 고 지 느 러 미 레이 세그먼트 수를 꼬리 지 느 러 미를 확산. 예를 들어 자신의 오른쪽 몸 측면에 동일한 방향에 항상 거짓말 zebrafish 있는지 확인 합니다.
    4. 주사 바늘 (0.3 x 13 mm) 뼈 핀 레이 세그먼트 (그림 1B)의 중심에 골절을 소개 합니다. 이렇게 하려면, 바늘은 밀어 약간 세그먼트에 균열 ( 그림2b에서 화살표)가 나타날 때까지. 부드러운 압력 강한 두 반대 hemirays 중 하나만의 골절로 연결 하는 동안 압력 두 hemiray 세그먼트의 골절 이어질 것입니다.
      1. 이후이 크게는 지 느 러 미의 안정성에 악영향을 줄 것 이다 너무 많은 지 느 러 미, 골절을 소개 하지 않습니다. 제안, 골절 3 ~ 5 탄 미 익 광선에만 적용 됩니다.
      2. 항상 다른 지 느 러 미와 제 브라, 느 3, 7 (또는 8)와 복 부 탄 미 익 광선 3에서 예를 통해 골절 해당 세그먼트를 생성 합니다. 골절의 근 위 원심 수준 3 세그먼트 탄 미 익 광선의 분기 지점 11인접에 이상적입니다.
    5. 부상된 zebrafish prednisolone 또는 압력가 물고기 물 포함 된 DMSO의 300 mL를 포함 하는 압력가 유리 비 커에 전송. 커버 알루미늄 호 일로 제 브라의 탈출 방지를 유리 비 커.
    6. Zebrafish는 실험에 대 한 필요한 수에 도달 될 때까지 단계 2.2.2 2.2.5을 반복 합니다.

3. Calvarial 두개골 상해 (Trepanation)의 생성

참고: 제 브라에서 calvariae는 포유류에서 calvarial 뼈에 동종. 따라서, 이러한 exoskeletal 뼈14 GIO의 pathogenesis 공부를 할 때 특별 한 관심의 조직을 나타냅니다. 두개골을 다치게 하 trepanation microdrill11의 도움으로 Os 프 론 탈 레 와 Os parietale (그림 1C, 2c) 구멍을 시추에 의해 수행 됩니다.

  1. 섹션 2.1에 따라 제 브라 anaesthetize
  2. 마 취 제 브라 직 립 집게와 잡습니다 calvarial 뼈 (그림 1C) 위에서 해 부 현미경 아래에서 잘 볼 수 있습니다.
  3. 정면 뼈 (Os 프 론 탈 레)의 중앙에 회전 microdrill를 찾아서 뼈를 터치 합니다. 생산된 구멍 microdrill 버 (500 µ m, 그림 2C, 그림 3B)의 크기입니다.
    참고:는 microdrill 생산 부상 하면서 옆으로 이동 하지 해야 합니다. 또한 뼈의 저항 갑자기 떨어질 때 즉시 중지 합니다. 더 어떤 드릴 하지 마십시오, 그렇지 않으면 두뇌 손상 된 15됩니다.
  4. 그것은 마 취에서 완전히 복구 될 때까지 물고기 물으로 채워진 케이지를 부상된 zebrafish를 전송 합니다. 신중 하 게 조심.
  5. 물고기 물 플러스 prednisolone 또는 DMSO 포함 된 유리 비 커에 부상된 zebrafish를 전송 합니다.

4입니다. 외피 동안 Zebrafish의 치료

참고: prednisolone/DMSO의 응용 프로그램, 동안 포함 하는 물고기 물 약 매일, 변경할 수 고 zebrafish 정기적으로 먹이로 해야.

  1. 물 변화
    1. 생선 물 교환, 100 mM prednisolone 주식을 녹여 준비 하 50 µ M prednisolone 압력가 물고기의 필요한 양을 치료 기간의 매일 신선한 물. 따라 물고기 물 제어 zebrafish에 대 한 포함 된 DMSO를 준비 합니다.
    2. 유리 비 커의 인큐베이션 솔루션에서 단일 지 내게 zebrafish를 포함 하 고 적절 한 용기, 예를 들어 임시 주택 감 금 소에는 제 브라를 포함 하는 솔루션을 전송.
      참고: 항상 사용 prednisolone과 DMSO에 대 한 별도 임시 컨테이너 처리 zebrafish, 각각, DMSO 제어 zebrafish prednisolone와 반대로 노출 하지 않는 다는 것을 확인 하.
    3. 신선한 약물 물고기 물 (300 mL)에 포함 된 유리 비 커를 리필.
    4. 중간 컨테이너에서 물고기 그물을 사용 하 여 신선한 부 화 솔루션에 포함 된 유리 비 커는 제 브라를 전송. 다시는 제 브라의 탈출을 방지 하려면 호 일 넣어.
    5. 실험의 시간 2 주를 초과 하는 경우 유리 비 커를 교환 합니다.
  2. 수 유
    1. (최대 2 일)에 대 한 짧은 치료 기간 동안 zebrafish가 급지되지 않습니다. 더 이상 실험 동안 zebrafish 피드. 부 화 솔루션의 오염을 피하기 위해 특별 한 주의 분리 했습니다. 따라서, Artemia ssp. 보다는 오히려 찌 질 음식, 그리고 매초 마다 하루에만 피드.
      참고: Artemia 젊은 zebrafish, 피드를 정기적으로 사용 하 고 제 브라 haltering 단위에서 사용할 수 있어야 합니다.
      1. 2 h 대략 그들의 유리 비 커에 Artemia ssp 와 제 브라 먹이 물고기 물이 교환 되기 전에. 이렇게 하려면 플라스틱 피 펫을 사용 하 고 해치 Artemia 솔루션의 0.5 ~ 1 mL 당 유리 비 커 피드.
      2. 2 시간까지 기다립니다 고 신선한 약물을 포함 하는 섹션 4.1에 따라 물고기 물 부 화 솔루션을 교환 한다.

5입니다. 샘플의 분석

참고: prednisolone에 DMSO를 포함 하는 물고기 물 부상된 zebrafish의 부 화, 후 각각, 뼈 강화 작용/석 회화 분석 (5.1 5.3) 수행 또는 해 부 현미경 (5.4) zebrafish의 라이브 이미징 수행 10,,1116. 지 느 러 미 재생 길이 확인 하 고 유전자 변형 zebrafish에 리포터 유전자 발현의 차이 감지할 라이브 이미징 사용 합니다.

  1. 관심의 조직의 고정
    1. 지 느 러 미 및 두개골의 고정을 위한 PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 하 고 저장을 위한-20 ° C에서 동결. 사용 신선한 준비 4% PFA PBS 또는 녹여 사용 하기 전에 필요한 금액에. 또는, 2% PFA PBS에 사용 될 수 있다.
      주의: PFA 독성 이며 증기 두건에서 신중 하 게 처리 해야 합니다. 보호복을 착용 하십시오.
    2. 지 느 러 미의 고정을 위한 작은 페 트리 접시를 준비 (예를 들어, 30 m m) 찬 4% PFA PBS에서 접시의 바닥은 완전히 덮여 있는지 확인 하십시오. 두개골의 고정을 위한 뚜껑을 가진 작은 유리 제 단지 또는 찬 4% 튜브 준비 PFA PBS에.
      주의: 핸들 PFA 독성 연기 후드만 솔루션에 포함 된. 보호복을 착용 하십시오.
    3. 수확의 조직.
      1. 지 느 러 미 조직이 나 골절 핀 anaesthetize 섹션 2.1에 따라 zebrafish 재생성 수확 또는 섹션 5.1.5 따라 zebrafish를 안락사.
      2. 페 트리 접시의 뚜껑을 anaesthetized zebrafish를 전송. 메스 또는 면도칼 블레이드를 사용 하 여 지 느 러 미 재생성을 수확. 그 루터 기 조직 재생성 수확된 조직의 처리를 촉진 하기 위하여 지 느 러 미에 포함 되었는지 확인 합니다.
    4. 지 느 러 미에 평평 하 게 하룻밤 4 ° C에서 배양 접시를 포함 하는 PFA 수정. 평면 고정 고정 중 지 느 러 미 조직의 컬링 방지 합니다.
      1. 해결 하려면 평면, 그 루터 기의 등 이나 복 부 가장자리에 1 개의 좋은 집게 핀 조직 잡아 하 고 고정 솔루션에 몰두. 두 번째 좋은 집게와 그 루터 기의 반대 가장자리를 약간 우울 접시의 바닥에 조직.
      2. 10 ~ 20를 발표 하기 전에 s. 지 느 러 미 조직이 더 이상 컬 하지 해야. 않으면, 반복 합니다.
    5. 부상된 두개골 조직 수확 하려면 zebrafish를 안락사. 100mm 직경 0.1%를 포함 하는 페 트리 접시를 준비 물고기 물에서 MS-222. 낚시 그물을 사용 하 여 MS-222 포함 된 배양 접시를 한 번에 하나의 zebrafish 전송. 마 취 (골 수 축소)의 레벨 6에 도달 하면 표본12의 죽음을 보장 하기 위해서 적어도 10 분 기다립니다.
    6. 머리 플러스는 시체의 나머지 부분에서 조금 트렁크 조직을 잘라 메스를 사용 하 여. 유리 용기 나 플라스틱 튜브 준비 4 %PFA 솔루션에서 수확된 조직 담가. 부드러운 락 4 ° C에서 24 h에 대 한 수정.
    7. 샘플 고정 후 장기 저장을 PBS (RT 3 x 20 분)와 함께 그들을 씻어 및 메탄올-치료 증가 메탄올 시리즈 (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 20 분에 대 한 PBS에 2 x 100% 메탄올).
      1. -20 ° c.에 100% 메탄올에서 그들을 저장합니다 그렇지 않으면, 직접 진행 뼈 얼룩 또는 다른 분석 PBS로 세척 후.
  2. 뼈 얼룩 기법 (알리자린 레드 얼룩) 나
    참고:이 얼룩 반 Eeden 외. 199617 및 수정 워커 & Kimmel 200718 에 따라 수행 됩니다.
    1. 알리자린 레드 성인 지 느 러 미 또는 두개골에 얼룩을 수행 하려면 수확 하 고 5.1 섹션에 설명 된 대로 조직 수정.
    2. 샘플-20 ° C에서의 메탄올에 저장, 역 메탄올 시리즈 (70%, 50%와 30 %PBS, 각 1 x 20 분)를 수행 하 여 샘플을 rehydrate 하 고 PBS 가진 두 번 20 분을 씻어. 이온을 제거 된 물으로 최소 5 분에 대 한 샘플 워시.
    3. 알리자린 레드 두개골에 얼룩, 30%에서 50 mg/mL의 트립 신으로 샘플을 치료 포화 나2B4O7 실 온에서 하룻밤. 이 시간 동안 록 샘플입니다. 30%에서 린스 샘플 포화 나2B4O7 솔루션. 2 시간 5 분 대 한 이온된 수와 함께 샘플을 씻으십시오. 이 단계는 지 느 러 미 조직에 대 한 수행 되지 않습니다.
    4. 알리자린 레드 솔루션 (부품 b: 0.5% 붉은 알리자린 S 분말, 이온된 수에 10% 글리세롤)를 추가 하 고 1, 2, 4 h 또는 하룻밤 후 얼룩에 대 한 실시간 검사에서 부 화 하는 동안 샘플을 바위.
    5. 취소 샘플 감소 1% 칼륨 수산화: 글리세롤 시리즈 (3:1 하룻밤, 하룻밤 사이 1:1, 1:3 하룻밤) 그들을 치료.
    6. 0.1% 수산화 칼륨의 1:1 솔루션에는 샘플을 저장: 80% 글리세롤 이미징에 대 한 80% 글리세롤과 그들을 탑재.
      참고: 결합 Alcian 블루/알리자린 레드 Alcian와 치료 샘플 블루 솔루션 (부품 a: 최종 0.02 %Alcian 블루, 50 mM MgCl2, 70% 에탄올) 재 (단원 5.2.2) 감소 에탄올 시리즈와 실시간 치료 지 느 러 미에 2 h 후 얼룩 얼룩 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, 각 1 x 15 분) 및 세척에 최소 1 시간 (3 x 20 분)에 대 한 그들 저온. 알리자린 레드 얼룩 (5.2 단원)으로 진행 합니다.
  3. 뼈 얼룩 기법 II (calcein 얼룩)
    참고: 지 느 러 미 골절 및 두개골 상해에 칼슘 증 착을 감지 하 활 어는 인 큐베이 팅 솔루션을 포함 하는 calcein에.
    1. 이온된 수 (pH 7.5)에 0.2 %calcein 필요한 금액을 준비 합니다. PH가 중립 다는 것을 확인 하십시오. 1 M NaOH를 사용 하 여 pH를 조정.
    2. 알루미늄 호 일로 덮여 유리 비 커에 20 분에 대 한 calcein 솔루션의 100 mL에 동시에 3 제 브라까지 품 어.
    3. Zebrafish는 물고기 물으로 비 커를 전송 합니다. 짧게 물고기 물으로 새로운 비 커에 그들을 전송 하기 전에 수영 하자. 씻어 20 분에 대 한이 새로운 비 커에서 수영 하자. (섹션 5.4 참조) 사진을 찍을.
  4. Zebrafish의 이미징 라이브
    1. 이 접근을 사용 하 여는 제 브라를 희생 하지 않고 지 느 러 미 또는 실험을 통해 두개골 등 뼈 조직 재생의 이미지. 섹션 2.1에 따라 제 브라 anaesthetize
    2. 지 느 러 미 생성의 이미지를 수집 하는 agarose 코팅 페 트리 접시 (참조 섹션 2.2.1 및 그림 1B)에 anaesthetized zebrafish 전송.
    3. 두개골 뼈 재생의 이미지를 수집 하는 제 브라 (그림 1D) 스폰지에 똑바로 배치 하거나는 zebrafish의 트렁크를 준비 된는 agarose 코팅 접시에.
    4. 원하는 배율 및 stereomicroscopic 설정을 사용 하 여 해상도에서 이미지를 취득 합니다.
    5. 신선한와 함께 컨테이너 또는 마약 물고기 물을 포함 하는 제 브라를 반환 합니다.

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결과

여기에 제시 된 프로토콜 zebrafish 지 느 러 미와 두개골10,,1116의 재생 과정에서 급속 한 골 형성을 유도 하기 위해 반복적으로 사용 되었습니다. 함께 제시 방법의 prednisolone 관리, 뼈 재생 동안 prednisolone의 효과 대 한 연구를 추구 수 있습니다. 예를 들어 뼈 형성과 재생성에서 강화에 대 한 연구를 수행할 수 있습니다. Prednisolone, 다른 스테로이드 제제19,20, 지 느 러 미 재생, 뼈 형성, 알리자린 붉은 꼬리 지 느 러 미 조직 (그림 3A) 고정에 얼룩에 의해 검출 등의 전반적인 억제 리드...

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토론

Zebrafish는 많은 관계에서 골격 연구에 유용한 입증 했다. 선택 된 돌연변이 모방 골 imperfecta 등 관절염23,,2425,26,27, 인간 질병의 측면 그리고 애벌레 뿐만 아니라 저울에 사용 되 고 있습니다. 작은 분자 스크린7,,2829뼈 근육 강화 화합물을 식별 합니다. Zebrafish 임상 연습에 적용 되는 약물의 치료는 또한 적합 예 뼈 조직에에서 상 상속 역효과 공부 합니다. 이러한 맥락에서 급속 하 게 뼈를 회생의 존재 약물 유도 뼈 결함의 기본 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 센터의 재생 치료 드레스덴의 ("Zebrafish 모델 glucocorticoid 유발 뼈 손실의 메커니즘을 해명 하기") 교부 금에 의해 그리고 또한 도이치 가운데 (Transregio 67, 프로젝트의 교부 금에 의해 지원 되었다 387653785) FK를. 우리는 그들의 지도 원조 뼈 다 귀 탄 미 익 광선에 calvariae 및 골절의 trepanation 수행에 대 한 1 월 Kaslin를 Avinash Chekuru 매우 감사. 실험 설계, 수행 되었고 KG와 FK에 의해 분석. FK 원고를 썼다. 우리 또한 카트린 램버트, 니콜 Cudak와 기술 지원 및 토론을 위한 Knopf와 브랜드 연구소의 다른 회원 들에 게 감사 하 고 싶습니다. 우리의 감사는 또한 Henriette Knopf와 원고를 교정에 대 한 조 쉬 커리 마리카 피셔와 훌륭한 물고기에 대 한 Jitka Michling을 갑니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
프레드니솔론, 시그마-알드리치P6004
디메틸설폭시드(DMSO)시그마-알드리치D8418
에틸-3-아미노벤조에이트, 메탄설포네이트(MS-222)시그마-알드리치A5040
무딘 집게AesculapBD027R
, 미세 집게Dumont91150-20
메스Braun5518059
AgaroseBiozym840004
주사 바늘 (0.3 mm x 13 mm)BD Beckton Dickinson30400
Micro drillCell Point Scientific67-1000><>
Steel burrs (0.5 µ m 직경)Fine Science tools19007-05
Artemia ssp.Sanders425GR
파스퇴르 피펫 (플라스틱, 파스텟)Alpha LabsLW4111
파라포름알데히드시그마-알드리치 158127
알리자린 레드 S 파우더시그마-알드리치A5533
알시안 블루 8 GXSigma-AldrichA5268
CalceinSigma-AldrichC0875
TrypsinSigma-AldrichT7409
실체현미경LeicaMZ16 FAQIMAGING RETIGA-SRV 카메라
실체현미경OlympusMVX10Olympus DP71 또는 DP80 카메라
, , , , , , ( 포함) ( 포함)

참고문헌

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