골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

요약

MALT1 타고 난 면역을 조절 하지만 병이 정의 남아 어떻게이 발생 합니다. 우리는 타고 난 신호 통행세 같이 또는 C 형 lectin 같이 수용 체의, MALT1 골수성 cytokines의 생산 조절 시연 다운스트림 다운스트림 MALT1의 기여를 푸는 선택적 MALT1 paracaspase 억제제 MLT-827 사용 C-타입 lectin 같이 수용 체의 선택적으로.

초록

수많은 연구에 의해 해결 되었습니다, 림프 세포, 그것의 기능 외 paracaspase MALT1 또한 패턴 인식 수용 체의 타고 난 셀 하류에 중요 한 역할을 재생 합니다. 최고의 공부는 Dectin-1 및 Dectin-2 일원 이다 C 형 lectin 같이 수용 체 가족의 SYK-및 CARD9-종속 MALT1 종속 방식에서 NF-κB 활성화를 선도 하는 캐스케이드 신호를 유도 하는. 대비, 통행세 같이 수용 체 (TLR), TLR-4, 같은 의해 NF-κB 활성화 하지만 신호는 MYD88/IRAK 종속 캐스케이드를 통해 전파 합니다. 그럼에도 불구 하 고, MALT1 TLR 4 신호에 기여할 수 있습니다 여부 불분명 남아 있다. MLT-827, MALT1 paracaspase 활동의 강력 하 고 선택적 억제제와 최근 증거가 나타냅니다 TNF-생산 하류 TLR-4 인간의 골수성 세포에서의 Dectin-1, TNF-생산 하류 반대로 MALT1의 독립적인 MALT1은 종속. 여기, 우리는 더 이상 감지, 및 마우스 세포 준비, Dectin 1, MINCLE 또는 TLR 4 통로의 자극의 다양 한 사용 패턴 인식에 MALT1의 선택적 참여 해결. 우리는 또한 넘어 TNF-, cytokines를 탐험 하 고 SYK 억제제 (Cpd11)와 IKK 억제제 (AFN700) MLT-827를 비교 하 여 추가적인 통찰력을 제공 했습니다. C-타입 lectin 같이 수용 체의 MALT1 종속성에 대 한 제공 하는 데이터 추가, 증거를-반대로 TLR 신호를 신호.

서론

MALT1의 paracaspase 활동 (점 막 관련 림프 조직 림프 종 전 좌 단백질 1) 2008^1,2에서 밝혀졌다. 그 이후, 연구의 여러 세포에 항 원 수용 체 응답의 중요 한 기여를 보고 있다. 유전자 모델 마우스 뿐만 아니라 T 세포, T 세포 의존 면역 및 B-세포 림프 종 설정^3,4약리학 데이터는 중요 한 역할을 지원. MALT1 paracaspase 활성화는 CARD11-BCL10-MALT1 복잡 한⁵, 항 원 수용 체 근 위 신호에 의해 트리거되는 조립 시 발생 하는 림프 톨에 T 또는 B 세포 수용 체의 다운스트림. 또한 유사한 CARD9-BCL10-MALT1 복잡 한 예를 들어 C 형 lectin 같이 수용 체 (CLLR)의 하류 신호를 전파에 대 한 중요 하다는 충분 한 증거가 있다, Dectin-1, Dectin 2, MINCLE에 골수성 세포^6,7. Dectin-1이이 통로 곰 팡이 감염

프로토콜

실험 지침 및 노바 티 스 인간의 연구 윤리 위원회의 기준에 따라 실시 했다.

1. 인간의 버 피 코트에서 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs)의 준비

참고: 우리 컬렉션, 50 mL 가방에서 후에 1 일 건강 한 지원자에서 버 피 코트를 받았다. 그들은 동의에서 제공 하 고 Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz통해 수집 했다. 우리는 다르게 지정 하지 않는 한에 실 온에서 아래 절차를 사용 하 여 처리 합니다.

1. 가 위 (아래 lamina 흐름) 비닐 봉지 1 리터 비 커의 살 균 하 고 깨끗 한 쌍을 준비 합니다.
2. 비 커에 버 피 코트를 전송 하 고 신중 하 게는 위.
3. 25 mL 피 펫을 사용 하 여 추가 100 mL의 인산 염 버퍼 염 분 버퍼/ethylenediaminetetraacetic 산 (PBS/EDTA: PBS 1 x pH 7.4 아니 CaCl₂ 및 없음 MgCl₂, 보충 2 mM EDTA pH 8.0).
   참고:

결과

골수성 세포에서 MALT1 여러 C 형 lectin 같이 수용 체, Dectin 1, Dectin 2, MINCLE⁶등의 하류 활성화 신호를 릴레이합니다. (앙) ITAM는 수용 체를 포함 하는 주제에 의존 하는이 경로 (예:, Dectin-1) 또는 ITAM 주제 포함 된 공동 수용 체 (예:, FcRγ, Dectin 2, MINCLE)를 채용 하 고 SYK 키 (그림 1)을 활성화. 이 활성화 한 단백질 키 니 아 제 C isoform, 즉 PKCδ, phosphorylates CARD9, CARD9/BCL10/MALT1 복잡 한 형성 및 다운스트림 NF-κB 활성화¹²TRAF6의 채용 함으로써 실행을 이끌어 낸다. 대조적으로, TLR 4 통로 TRAF6 MYD88/IRAK 종속 방식으로 NF-κB.......

토론

이 작품에서 우리 인간의 신호 통로 마우스 타고 난 세포를 연구 하 고 MALT1 분해 기능에 대 한 그들의 의존성을 심문 간단한 실험 설정 사용. 이전 작업¹¹에 확대, 우리의 연구 MALT1 paracaspase 활동 C 형 lectin 같은 수용 체 유도 cytokine 생산, TNF-α를 포함 하 여 컨트롤을 보여주었다. 반면, TLR 4 유도 하는 TNF-α MALT1 두 종에서 독립 했다. 샨 다, 이러한 데이터는 MALT1/CBM signalosome 하류 C 형 lectin 같이 수용 체의 이전 연구^6,12,18에 의해 공개 됐다이의 키와 선택적 기여 뒷받침.

TLR 4 MALT1 골수성 세포에서에 신호의 명확한 독립 다른 적용 여부 셀 유형 탐험 남아 있다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 &마이크로; m 나일론 셀 스트레이너	Sigma	CLS431752
14 mL Falcon tube	BD Falcon	352057
15 mL Falcon tube	Falcon	352090
50 mL Falcon tube	Falcon	352070
6 웰 플레이트	Costar	3516
96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid	Costar	3595
96 웰 V-바닥 플레이트	Costar	734-1798
염화 암모늄 - NH4Cl	시그마	A9434
분석 희석제 RD1-W ELISA	R& D	895038	분석 희석제
세포 배양 마이크로플레이트, 384 웰, 블랙	Greiner	781986
고갈 Zymosan	Invivogen	tlrl-dzn	now: tlrl-zyd
디메틸 설폭사이드	시그마	D2650	DMSO
EDTA-Na2	Sigma	E5134	에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨염 이수화물
ELISA 뮤트TNF-&알파;	R& D	SMTA00
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
gentleMACS C 튜브	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
GM-CSF	Novartis-Heat-inactivated
소 태아 혈청	Gibco	10082	FBS
HTRF hu IL-23	CisBio	62HIL23PEG
HTRF hu TNF-&알파;	CisBio	62TNFPEC
HTRF 재구성 완충액	CisBio	62RB3RDE	50mM 인산염 완충액, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA
IFN-&감마;	R& D	L4516
IL-4	Novartis-Isoflurane
Abbott	Forene
Lipopolysaccharides (LPS)	Sigma	L4391	LPS 인체 샘플에 사용
Sigma		L4516	LPS 쥐 샘플에 사용
Lysis buffer	자체 제작	-	155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4
자석	Stemcell	18001
Microplate, 384 웰 화이트	Greiner	784075
Monocytes 농축 키트	Stemcell	19059
Nalgene Mr. Frosty Cryo 1° C 냉동 용기	Nalgene	5100-0001	냉각 장치(프로판올-2 포함)
PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2	Gibco	10010	인산염 완충 식염수
페니실린/스트렙토마이신	Gibco	15140	펜/스트렙
타슘 바이카보네이트 - KHCO3	Sigma	P9144
PrestoBlue	Invitrogen	A13262	Resazurin 용액
Propanol-2	Merck	1.09634
읽기 버퍼	MesoScale Discovery	R92TC-3	트리스 기반 완충액 함유 트리프로필아민
회수 세포 배양 동결 매체	Gibco	12648-010	동결 매체
Roswell Park Memorial Institute 매체(RPMI) Glutamax	Gibco	61870	+ iMoDCs + 10% FBS + 1 mM 피루브산 나트륨 + 100 U/mL 펜/연쇄상구균 + 5 µ M β-인간 PBMC 및 단핵구에 대한 메르캅토에탄올 + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µ 쥐 비장 세포용 M β-메르캅토에탄올
분리 완충액	자체 제작	-	PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1mM EDTA pH 8.0
피루브산 나트륨	Gibco	11360
트레할로스-6,6-디베헤네이트	Invivogen	tlrl-tdb	TDB
트윈 20	시그마	P7949	폴리소르베이트 20
울트라퓨어 0.5M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15675	에틸렌디아민테트라아세트산
Viewseal 실러	Greiner BioOne	676070
V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit	MesoScale Discovery	K15049D	전기화학발광 멀티플렉스 분석법(IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8)
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350

포생존 능력 평가를 위한