방법 논문

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

DOI:

10.3791/58448

⸱

2019년 1월 7일

 , 
1Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Anesthesiology, University of Nebraska Medical Center

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 글의 전반적인 목표, 특성화, 고립과 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포 (CSCs)의 분화에 대 한 프로토콜을 표준화 하입니다. 여기, 우리가 murine CSCs 분리 밀도 그라데이션 원심 분리 방법 및 CSC, 확산, 문화와 cardiomyocytes로 차별화에 대 한 정교한 방법을 설명 합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

심근 경색 (MI)는 병 적 상태와 사망률 세계 각국의 주요 원인입니다. 재생 의학의 주요 목표는 미 후 죽은 심근을 보충. 여러 전략 심근을 다시 생성 하는 이용 되었다, 줄기 세포 치료는 내 심장의 죽은 심근을 보충 하는 주요 접근 남아 있다. 증거를 축적 성인 심장 및 심장 재생, paracrine 또는 내 분 비 효과에서 주민 심장 줄기 세포 (CSCs)의 존재를 제안 합니다. 그러나, CSC 절연 특성 및 심근 세포, 특히 cardiomyocytes 향해 차별화 기술 도전 남아 있습니다. 현재 연구에서 우리는 절연, 특성, 및 성인 마우스 마음에서 CSCs의 차별화에 대 한 간단한 방법을 제공. 여기, CSCs, 심장 0.2% 콜라 II 솔루션에 의해 소화 된다의 절연에 대 한 밀도 그라데이션 방법을 설명 합니다. 격리 CSCs 특성, 우리는 Sca 1, NKX2-5, 및 GATA4, CSCs/심장 마커 및 pluripotency/stemness 마커 OCT4, SOX2, 및 Nanog 식 평가. 우리는 또한 배양 접시에 배양 하 고 확산 표식 기-67의 식을 평가 하 여 절연된 CSCs의 확산 가능성을 결정. CSCs의 감 별 법 잠재력을 평가, 우리는 7-10 일 교양 CSCs 선택. 우리는 cardiomyocyte 차별화 매체와 새로운 접시에 그들을 전송. 그들은 셀 문화 인큐베이터에서 12 일 동안 incubated는 차별화 매체는 3 일 마다 변경 하는 동안. 차별화 된 CSCs 익스프레스 cardiomyocyte 특정 마커: actinin와 분 나. 따라서,이 프로토콜 절연 CSCs stemness 있고 심장 마커, 그리고 그들은 확산 및 cardiomyocyte 혈통으로 차별화에 대 한 가능성.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

허 혈 성 심장 질환, 심근 경색 (MI)를 포함 하 여 세계1주위 죽음의 주요 원인입니다. 죽은 심근 재생을 위한 줄기 세포 치료는 미 심장2,3,,45의 심장 기능을 개선 하는 주요 접근 남아 있다. 다른 종류의 줄기 세포 죽은 심근을 보충 하 고는 내 심장의 심장 기능을 개선 하기 위해 사용 되었습니다. 그들은 광범위 하 게 배아 줄기 세포6 및 성인 줄기 세포로 분류 될 수 있습니다. 성인 줄기 세포에서 다양 한 종류의 줄기 세포 사용 되었습니다, 단 세포 골 수에서 파생 된7,8, 골9,10, 지방 조직 에서에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 등 11,12및 탯13, CSCs14,15. 줄기 세포 심장 재생 paracrine 또는 내 분 비 작업16,17,18,,1920를 통해 홍보할 수 있습니다. 그러나, 줄기 세포 치료의 주요 한계 확산 수 있는 특정 심장 혈통21,22향해 분화 줄기 세포의 적절 한 번호를 얻는 이다. 헌 및 allogenic 이식 줄기 세포의 줄기 세포 치료9에 있는 중요 한 도전 이다. 그들은 마음에서 파생 하기 때문에 그들은 분화 될 수 있다 더 쉽게 심장 계보에 비 심장 줄기 세포 보다 CSCs 심장 재생을 위한 더 나은 방법은 수 있습니다. 따라서, 기형종의 위험을 줄여줍니다. 또한, 내 분 비 및 paracrine 효과 CSCs의 exosomes 등 miRNAs는 CSCs에서 파생 된 줄기 세포의 다른 유형 보다 더 효과적인 수 있습니다. 따라서, CSCs는 심장 재생23,24에 대 한 더 나은 옵션을 남아 있다.

CSCs는 그들의 심장 근원 때문에 미 마음에 심장 재생을 위한 더 나은 후보자, CSCs는 주요 한계는 효율적인 절연 방법의 부족으로 인해 더 적은 수확량. 또 다른 한계는 cardiomyocytes 리니지2,25,,2627향해 CSCs의 장애인된 차별 될 수 있습니다. 이러한 한계를 회피, CSC, 특성화, 고립과 심장 혈통으로 차별화에 대 한 효율적인 프로토콜을 개발 하는 것 중요 하다. CSCs에 대 한 단일 허용 마커 없는 고는 특정 세포 표면 마커 기반 격리 CSCs의 적은 CSCs 수익률. 여기, 우리는 비용 효율적 이며 CSCs의 증가 수확량에서 결과 마우스 심장 CSCs 격리 하기 위해 간단한 그라데이션 원심 접근 표준화. 이러한 격리 CSCs 형광 활성화 셀 단락에 의해 특정 세포 표면 표식에 대 한 선택할 수 있습니다. CSCs 격리, 뿐만 아니라 우리는 CSC, 특성화, 문화와 cardiomyocyte 혈통으로 차별화에 대 한 프로토콜을 제공 했습니다. 따라서, 우리는 격리, 성격, 문화, CSCs 성인 마우스 마음 (그림 5)에서 분화 하는 우아한 방법 제시.

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프로토콜

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주택, 마 취, 그리고 마우스의 희생은 네브라스카 대학 의료 센터의 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 하는 것을 수행 했다.

1입니다. 자료

  1. 사용 10-에 12 주 된 C57BL/6J 블랙 남성 쥐, CSCs CSCs의 격리에 대 한 제도적 동물 시설에서 사내 보관 수도 비 임신 여성 쥐에서 격리 되어야.
  2. 모든 필요한 수술 악기, 수술가 위, 등 정밀한 수술가 위, 곡선된 칼 집게, 외과 블레이드, 압력가 마로 소독 하 여 소독 마우스의 안락사 전에 그들.
  3. 멸 균된 상태에서 CSC 절연 버퍼를 준비 하 고 얼음에 4 ° C에서 저장. 이 버퍼는 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션 1.077 g/mL의 조밀도를 조정, 불완전 한 Dulbecco의 수정이 글의 중간, 1 x 햄의 소금물 (HBSS), 균형 및 문화-학년 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀. 1% 콜라 II 재고 솔루션 (필터링 및 소독)와 0.2% 작업 솔루션 HBSS에서 준비 합니다.
  4. 캐비닛, 10 mm 페 트리 접시, 등 6 잘 플레이트, 24-잘 접시, T-25 및 T-75 문화 플라스 크, 15 mL 및 50 mL 원뿔 튜브, 일회용 serological 펫 40 µ m와 100는 biosafety에 멸 균된 상태에서 조직 문화 자료를 유지 -0.22 μ m 필터 µ m 세포 멤브레인.
  5. 10 µ L, 200 µ L, 및 1000 µ L 피 펫 팁 오토 클레이 브 소독.
  6. 파우더 프리 니트 릴 장갑, 70% 에탄올을 사용 하 여 실험을 통해 무 균 상태를 유지 하기 위해.
  7. 10% 표 백제를 사용 하 여 살 균 제로.
  8. 사용 하 여 상용 CSC 유지 보수 매체 cardiomyocytes 차별화 매체 문화, CSCs의 차별화에 대 한 각각.

2. 절연 방식의 심장 줄기 세포

  1. 4-5 성인 남성 (또는 비 임신 여성) 안락사는 CO2 챔버를 사용 하 여 마우스. 핀 이나 끈 적 테이프와 함께 별도 해 부 골 판지에 각 마우스의 무기를 수정.
  2. 외부 세균을 제거 하 고 심장의 수확 하는 동안 멸 균된 상태를 유지를 마우스에 70% 에탄올을 스프레이. 복 부 중간에 위로 절 개 하 고 직선에서에서 가슴까지 복 부 피부를 잘라. 피부와 머리카락의 복 부 영역을 지우려면 중간 컷의 양쪽에서 피부를 제거 합니다. 가 위, 핀셋를 사용 하 여 흉 곽 아래 횡 경 막 잘라.
  3. 후드 안쪽 흉 곽을 절단 하 여 마우스의 흉 강을 엽니다. 마음 하 고 심장 근처 혈액을 제거. 워시는 심장 주변 모든 혈액의 제거를 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 심장의 주변 지역.
  4. 수술가 위 핀셋을 사용 하 여 심장 해 부. 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 마음을 놓습니다.
  5. Palpitate 곡선된 칼 집게를 사용 하 여 심장 고 마음 안에 잔여 혈액을 제거 합니다.
  6. 온 마음을 사용 하 여 CSCs의 격리에 대 한.
  7. 모든 4 개 또는 5 개의 전체 마음 얼음 처럼 차가운 HBSS의 10 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 추가 처리까지 얼음에 튜브를 유지.
  8. 내부와 외부는 biosafety 멸 균된 환경을 만들기 위해 70% 에탄올과 캐비닛 닦아냅니다. 심장-포함 된 튜브와 70% 에탄올과 다른 필요한 재료를 소독. 추가 처리를 위해 캐비닛에 biosafety 심장 포함 된 튜브를 놓습니다.
  9. 100 mm 페 트리 접시 얼음 HBSS의 10 mL를 포함 하는 마음을 전송 합니다. Palpating 마음 안에 어떤 잔여 혈액을 제거 하 여 다시 마음을 씻어. 혈액의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 각 세척 후 HBSS 솔루션을 변경 합니다.
  10. 마음 HBSS 솔루션의 5-7 mL를 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 잘 수술가 위 또는 외과 블레이드를 사용 하 여 작은 조각으로 잘라. 집게의 쌍을 가진 각 마음을 누른 수술 잘가 위 또는 외과 블레이드를 사용 하 여 심장 2-4 밀리미터 조각으로 잘라. HBSS 솔루션 혈액 무료 HBSS을 자주 변경 합니다. HBSS 용액에 마음을 말하다.
  11. 원심 5 분 삭제 4 ° C에서 500 x g 에 다진된 조직은 상쾌한 고 펠 릿을 유지.
  12. 5-6 ml 50 mL 원뿔 튜브에 0.2% 콜라 II 솔루션의 펠 릿을 resuspend. 콜라 솔루션의 볼륨 이어야 한다 거의 1.5-에 2 배는 펠 릿의 볼륨.
    참고: 대 한 소화 조직, 0.2% 콜라 나 및 2.5 U/mL dispase 솔루션 0.2% 콜라 II를 바꿀 수 있습니다. Dispase 솔루션은 콜라의 거의 동일한 볼륨을 사용 하 여 난 솔루션.
  13. 철저 하 게 혼합 펠 릿 0.2% 콜라 II 솔루션 튜브를 교 반 또는 37 ° c.에 45-60 분에서 75 x g 통에 튜브 락 흔들어 튜브 적극적으로 손으로 세포를 향상 시키기 위해 모든 20-30 분 후.
  14. 5 mL 혈 청 학적인 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션으로 조직 덩어리를 해리 하 lysed 조직 믹스 triturate
    참고:는 CSCs의 최대 복구를 얻으려면, 적어도 5 분 동안 세포 믹스 triturate. 조직 덩어리 상대적으로 큰 경우에가 위 또는 외과 블레이드 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라 고 분쇄에 대 한 그것을 사용 합니다.
  15. 상용 CSC 유지 보수 매체를 추가 하 여 조직의 효소 세포를 중지 합니다. 2.14 단계에서 lysed 조직의 볼륨으로 거의 2-3 배 많은 유지 보수 매체를 추가 합니다.
  16. 모든 소화 되지 않은 조직 조각을 제거를 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 소화 세포 현 탁 액을 전달 합니다.
  17. 2.16 40 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 단계를 반복 합니다.
  18. 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 통해 셀 구분 합니다. 세포의 분리에 대 한 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션 위에 filtrate의 동일한 볼륨을 오버레이 부드럽게 합니다. 예를 들어 첫째, 50 mL 원뿔 튜브에 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션의 20 mL를 추가 하 고, polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션을 통해 단계 2.17에서에서 여과 액 20 mL를 추가.
    참고: Prewarm는 polysucrose 및 전에 37 ° C에 나트륨 diatrizoate 솔루션 셀으로 사용합니다. 매우 신중 하 고 천천히는 filtrate 단계의 2.17 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 솔루션을 통해 추가 두 솔루션의 어떤 혼합을 피하기 위해. 이 중요 한 단계로 간주 됩니다.
  19. 500 x g 스윙 양동이 원심 분리기를 사용 하 여 실 온에서 20 분에서 두 솔루션을 포함 하는 튜브 원심 낮은 가속 및 감속 속도 두 가지 솔루션을 혼합 하지 마십시오 및는 CSCs의 적절 한 분리는 분리기를 설정 합니다. 이것은 CSC 격리에 중요 한 단계입니다. 튜브는 원심 분리기 내부 방해 없이 아주 천천히 그라데이션 혼합물을 포함 하 고 원심 분리에 대 한 설정 합니다.
  20. 15 mL 소독된 튜브에 1 mL 피 펫 또는 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 상위 계층에서 추가 솔루션 함께 버 피 코트를 꺼내. 이 버 피 레이어는 CSCs 포함 됩니다.
    참고: 주의 사항 추가 pipetting 없애려고 하지 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 솔루션 레이어 CSCs에 독성 때문에 버 피 코트의 동안.
  21. 단계 2.20에서에서 CSC 유지 보수 매체의 동일한 볼륨 세포 현 탁 액을 추가 있는 경우 제대로 잔여 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션, 중화를 섞는다.
  22. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 위의 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한.
  23. 불완전 한 DMEM 매체의 7-10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 모든 잔여 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션의 제거를 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심.
  24. 순화 CSCs 포함 된 펠 릿을 수집 합니다.
  25. CSC 유지 보수 매체의 1 mL에 펠 릿을 resuspend, CSC 수를 계산 하 고 문화에 대 한 펠 릿을 사용 합니다. CSC 수를 계산 하려면 Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer를 사용 합니다. 4 남성 쥐 마음, CSCs의 수익률은 ~1.8 백만.
  26. 씨앗 6-잘 문화 접시에 CSCs 0.5 %fibronectin 포함 된 0.02% 젤라틴 솔루션과 코팅. 완전 한 유지 보수 매체의 2 개 mL를 사용 하 여 시드를 위한. 문화 접시 5% CO2와 37 ° C에서 인큐베이터에 품 어.
  27. 제 3의 날까지 매일 완전 한 CSC 유지 보수 매체와 문화 CSCs의 중간을 교체 합니다. 그 후, 다른 일에 매체를 변경 합니다.
  28. 현미경으로 관찰 하 여는 CSCs의 성장을 결정 합니다.

3. 유지 보수 및 심장 줄기 세포의 문화

  1. 상업적으로 사용 가능한 유지 보수 매체에 격리 CSCs 문화. 다른 일에 신선한 유지 보수 매체와 문화 매체를 교체 합니다. CSC 문화는 confluency에 도달 하면 단계 2.26에서에서 설명 했 듯이 젤라틴과 fibronectin, 코팅 새로운 플레이트는 CSCs 전송. 효소 세포 분리 버퍼 교양된 CSCs 분리 합니다. 문화 판에서 셀 분리의 표준 프로토콜을 따릅니다. 이 단계에서 CSCs는 0 (P0) 무대 통로에 간주 됩니다.
  2. 새로운 젤라틴에 문화 P0 CSCs fibronectin 코팅 접시 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 완전 한 CSC 유지 보수 매체에 confluent, 수 수와 다음 단계 통과 1 (P1) CSCs 저장소 P1 CSCs 액체 질소에 또는 experi에 대 한 그들을 사용 하 여 3.1 사항입니다.
  3. 6 잘 플레이트 또는 그것의 초기 단계에서 CSC 문화를 유지 하기 위해 T-25 1 백만 셀 씨 0.5 백만 셀.
  4. 85%-90% 합칠 때 CSCs 통로. CSCs 4 ~ 6 주까지 유지 보수 매체에 경작 될 수 있다.
    참고: 계속 CSCs 상대적으로 높은 (40%-50%)의 초기 시드 밀도 때문에, 낮은 시드 밀도 CSCs 평평 하 고 길쭉한를 그들의 형태 변경 될 수 있습니다.

4입니다. 심장 줄기 세포의 특성

  1. 교양된 CSCs 특성, 살 균 소-대조 또는 밝은 분야 현미경 관찰 합니다. 형광 현미경의 목표에 포함 하는 CSC 접시를 놓습니다. 배율을 상당히 낮은 (10 배) 셀 초점을 설정 합니다. 단계 대조 조리개를 사용 하 여 셀을 관찰. 20 X 배율 대물 렌즈를 변경 하 여 증가 하 고 이미지 CSCs. 증가 40 X 목표는 CSCs 이미지. 2 일에는 CSCs 나타납니다 거의 둥근 모양만 시간, 그리고 7 일 셀 증가의 크기, CSCs는 거의 원통 모양 (그림 1A - 1 C).
  2. Immunostaining는 CSCs의 pluripotency/stemness (OCT4, SOX2, 또는 Nanog), 확산 (기-67) (그림 2A - 2D), 그리고 심장 근원/시 조 세포 (Sca 1, NKX2-5, 또는 GATA4)의 마커를 수행 (그림 3A - 3c).
    1. CSCs의 immunostaining에 대 한 24-잘 문화 접시에 10000 CSCs 씨.
    2. 다음 다음날 (18-24 h), 10 분 동안 4 %paraformaldehyde 300 µ L에는 CSCs 수정.
    3. 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L와 CSCs 씻어 5 분 간격으로 3 배.
    4. 0.2% 트라이 톤 X-100 10 분에 대 한 PBS에 희석의 300 µ L와 CSCs permeabilize
    5. 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L와 CSCs 씻어 5 분 간격으로 3 배.
    6. 1% BSA PBST에 희석의 300 µ L로는 CSCs의 차단 수행 (PBS + 0.1% Tween 20) 또는 10% 일반 닭 혈 청 1 h PBST에 희석의 300 µ L.
    7. 1 차적인 항 체 4 ° c.에 하룻밤 솔루션을 차단에 희석의 200 µ L에서 CSCs 품 어 희석 주 항 체 또는 항 체의 표준화에 따라 데이터 시트에서 권장 하는 대로.
    8. 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L와 CSCs 씻어 5 분 간격으로 3 배.
    9. 이차 항 체 솔루션을 차단에 희석의 200 µ L에서 CSCs 품 어 (단계 4.2.6 참조) 실 온에서 1 h. 희석 이차 항 체 또는 항 체의 표준화에 따라 데이터 시트에서 권장 하는 대로.
    10. 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L와 CSCs 씻어 5 분 간격으로 3 배.
    11. DAPI의 200 µ L와 CSCs counterstain (1 µ g/mL) 5 분에 대 한 PBS에 희석.
    12. 1 CSCs 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L x. 그런 다음, 각 우물에 얼음 처럼 차가운 PBS의 300 µ L를 추가 합니다.
    13. 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 수행 합니다. 형광 이미징, 접시에 직접 빛을 피하는 등의 지침을 따릅니다. 현미경 문화 접시를 유지. 다른 배율에서 셀의 초점을 맞춥니다. 단계 대조 및/또는 다른 여기 필터에서 세포를 관찰 하 고 이미지를 저장.
    14. 4 ° c.에 어둠 속에서 접시를 저장

5. Cardiomyocyte에 심장 줄기 세포의 분화

  1. CSCs의 차별화, prewarm (37 ° C) 상용 CSC 유지 보수 매체의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트에 500000 CSCs 씨.
  2. 포함 하는 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 CSCs 접시를 품 어 연결 하 고 하위 confluent 성장까지 증식 CSCs 허용. 매체 노란색, 문화 매체를 신선한 유지 보수 매체 바꿉니다.
  3. 85%-90 %confluency prewarm (37 ° C) cardiomyocytes의 2 mL와 함께 유지 보수 매체 교체 차별화 매체. 최대 2-3 주 동안 37 ° C에서 CO2 인큐베이터에 접시를 품 어.
  4. 모든 2-3 디 좋은 문화 조건 되도록 변경 매체 동안 때마다 현미경 CSCs' 형태 관찰 차별화 매체를 변경 합니다.
  5. CSC 문화 차별화 매체에서의 12 d, 후 이미지 CSCs 분화 마커 표준 immunostaining 다음에 대 한 프로토콜 (단계 4.2.1-4.2.14 참조) 합니다. Cardiomyocytes 표식 (그림 4A - 4B)의 표현에 대 한 형광 이미지를 저장 합니다.

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결과

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현재 연구에서 우리는 10 월에 12 주 된 C57BL/6J 남성 쥐 마음에서 CSCs 고립. 여기, 우리는 CSC 격리 및 pluripotency의 마커를 사용 하 여 특성을 위한 간단한 방법을 제시 했습니다. 우리는 또한 CSC 차별화 우아한 메서드와 CSCs cardiomyocytes 혈통으로 분화의 특성을 제시. 2-하 3-일-교양 CSCs (그림 1A 및 1B) 단계 대조 현미경의 스핀 들 모양 형태를 관찰합니다. 우리는 유지 보수 매체, 줄기 세포가이 시간 동안에 문화의 7 일 CSCs의 형태에 변화를 (그림 1C) 길쭉한 발견. 우리는 CSCs pluripotency의 표식에 대 한 특징 고 그들이 OCT4, SOX2, 및 (그림 2A - 2 C

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토론

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이 CSC 격리 프로토콜의 중요 한 단계는 다음과 같습니다. 1) 멸 균된 조건이 생쥐에서 심 혼의 추출에 대 한 유지 되어야 합니다. 심장 추출 하는 동안 어떤 오염 든 지 CSCs. 2의 품질을 손상 수 있습니다) 혈액 조각 HBSS 솔루션 전체 마음과 심장의 여러 가지 세척에 의해 이루어집니다 마음을 닦지 하기 전에 완전히 제거 해야 합니다. 3) 심장 조각은 콜라 솔루션으로 단일 셀 서 스 펜 션으로 완전히 lysed 될 해야 합니다. 4) polysucrose와 나트륨 diatrizoate 그라데이션 솔루션 셀의 분리를 위한 prewarmed 해야 합니다. 5) CSC 문화 매체를 prewarmed 해야 합니다. 6) 문화 접시에 시드 동안 CSCs의 합류 때문에, 낮은 confluency, CSCs는 그들의 형태를 변경 될 수 있습니다 높은 해야 합니다. CSC 번호 7) 마음에서 그리고 문화 접시에 도금 하기 전에 격리 후 득점 한다. CSCs 수 마음에서 격리의 효율성을 나타냅니다. CSCs의 계산 하는 것은 문화...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품에서에서 지원 됩니다, 부품, HL-113281 및 HL116205 성명서 쿠마 Mishra에 건강의 국가 학회 교부 금에 의해.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MiceThe Jackson laboratory, USA재고번호 000664
항체:
OCT4-Abcamab18976 (rabbit polyclonal)OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, secondary antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2Abcamab97959 (rabbit polyclonal)SOX2-1차 항체- 1:100 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액 내
NanogAbcamab80892 (토끼 다클론)나노그-1차 항체- 1:100 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액
Ki67Abcamab16667 (토끼 다클론성)Ki67-1차 항체- 1:100 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액
Sca IMilliporeAB4336 (rabbit polyclonal)Sca I 1차 항체- 1:100 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액
NKX2-5Santa Cruzsc-8697 (goat polyclonal)NKX2-5-1 차 항체- 1:50 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액
GATA4Abcamab84593 (rabbit polyclonal)GATA4-1차 항체- 1:100 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액
MEF2CSanta Cruzsc-13268 (염소 다클론)MEF2C-1차 항체- 1:50 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액 중
Troponin IMilliporeMAB1691(마우스 단클론)트로포닌 I-1차 항체- 1:100 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액 내
ActininMilliporeMAB1682 (마우스 단클론)Actinin-1차 항체- 1:100 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액 ANP
MilliporeAB5490 (마우스 다클론)ANP-1차 항체- 1:100 희석, 2차 항체- 1:200 희석, 차단 용액
Alex Fluor-488 checken anti-rabbitLife technology참조 번호 A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbitLife technology참조 번호 A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goatLife technology참조 번호 A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouseLife technology참조 번호 A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goatLife technology참조 번호 A21468
NameCompany카탈로그 번호코멘트
배양 배지:
CSC 유지 관리 배지MilliporeSCM101참고: CSC 배양의 경우, PBS 또는 불완전한 DMEM 배지를 사용하여 세포
심근세포 분화 배지MilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
NameCompany카탈로그 번호Comments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)Sigma10771
HBSSGibco2018-03
Collagenase ISigmaC0130
Dispase 용액STEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
StemPro Accutase 세포 해리 시약 Thermoscientific
기타 시약:
BSA시그마A7030
일반 검사 혈청벡터 실험실S3000
DAPI 솔루션ApplichemA100,0010Dapi, 작업 농도 -1 µ g/mL
트리판 블루Biorad145-0013
TrypsinSigmaT4049
StemPro Accutase 세포 해리 시약Thermo Fisher ScientificA1110501
포름알데히드시그마158127
Triton X-100ACROSCas No. 900-293-1
Tween 20Fisher Sceintific로트 번호 160170
에탄올Thermo Scientific
NameCompany카탈로그 번호Comments
조직 배양 재료:
100 mm 페트리 접시Thermo Scientific
6웰 플레이트Thermo Scientific
24웰 플레이트, Thermo Scientific
T-25 플라스크Thermo Scientific
T-75 플라스크Thermo Scientific
15ml 원뿔형 튜브, Thermo Scientific
50mL 코니컬 튜브Thermo Scientific
40 & 마이크로; m 세포 염색기Fisher Scientific22363547
100 µ m 세포 염색기Fisher Scientific22363549
0.22 &마이크로; m 필터Fisher Scientific09-719C
10 mL 주사기BD참조 번호 309604
10 µ L, 200 &마이크로; L, 1000 &마이크로; L 피펫 팁Fisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL 일회용 플라스틱 피펫Thermo Scientific
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Instruments
원심분리기 기계Thermo ScientificLEGEND X1R 원심분리기
EVOS 현미경생명 기술
자동 세포 계수기Biorad
세포 계수 슬라이드Biorad145-0011
Pippte aidThermo ScientificS1 피펫 필러
Name< strong>Company카탈로그 번호코멘트
Surgical Instruments:
Surgical ScissorsFine Scientific Tool
Fine Scientific Tool
Curve shank junpsFine Scientific Tool
수술 용 블레이드파인 사이언티픽 도구
를 세척했습니다. A1110501, , , , Fine surgical Scissors

참고문헌

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