세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Summary

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

분 비 요인, 곁에 막 수용 체 그리고 그들의 상호 작용 협동자 셀룰러 통신의 주요 레 귤 레이 터 및 항상성 및 질병, 폭포를 신호의 시작 이며 같은 대표 주요 치료 대상. 이러한 상호 작용 네트워크 그들의 관련성에도 불구 하 고 현재 데이터베이스;에서 크게 이루어지지 남아 따라서, 세포 외 단백질 가장 문서화 바인딩 파트너가 있다. 이 불일치는 주로 기능 단백질, 고 약한, 낮은 선호도, 단백질 상호 작용 세포 표면 수용 체 간에 자주 설정의 식을 포함 하 여 세포 외 단백질의 연구와 관련 된 문제 때문입니다. 이 방법의 목적은 세포 외 단백질 단백질 단백질 상호 작용의 심사에 대 한 microarray 형식 라이브러리의 설명 이다. 약한 상호 작용의 탐지를 사용 하려면 쿼리 단백질 연구의 multimerization에 따라 메서드를 설명 합니다. 증가 multivalency이 multimerization microbead 기반 접근을 결합, 단백질 microarray 높은 처리량 과도 단백질-단백질 상호 작용의 강력한 검색을 수 있습니다. 이 메서드는 신속 하 고 낮은 샘플 사용-접근 어떤 세포 외 단백질에 적용 가능한 새로운 상호 작용의 식별을 위해 제공합니다. 단백질 microarray 인쇄 및 심사 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 세포 외 공간 상호 작용 단백질의 발견에 대 한 강력한 방법을 추구 하는 수 사관을 위해 유용할 것 이다.

Introduction

여기에 검토 하는 방법은 세포 외 단백질 microarray 형식,이 라이브러리에 대 한 관심의 대상의 심사에 대 한 방법으로 다음의 컬렉션의 인쇄를 설명 합니다. 우리는 낮은 바인딩 선호도 특징 상호 작용 검출을 위한 중요 한 단계로 단백질 multimerization를 확인 했습니다. 이러한 상호 작용의 탐지를 향상 시키기 위해, 우리 microbeads를 사용 하 여 관심사의 쿼리 단백질의 multimerization에 따라 프로토콜을 설명 합니다.

분 비 되며 세포 표면 표현 단백질 (총칭 하 여 세포 외 단백질에 게 불리는) 그들의 상호 작용 협동자 함께 셀룰러 통신, 신호 및는 microenvironment와의 상호 작용의 주요 레 귤 레이 터. 그들은, 따라서, 많은 생리와 병리학 과정 조절에 필수적인입니다. 인간 게놈 (≈5, 000 단백질)의 4 분의 1 약 extracellular 단백질에 대 한 인코딩, 체계적으로 전달 된 약물에 게 그들의 의미 및 접근성, 대표 약물 개발¹에 대 한 주요 대상. 따라서, 세포 외 단백질 단백질 목표 시장, "druggable proteome"로 알려진에 승인 된 약물에 대 한 알려진 약리 작업의 70% 이상 대표. 그들의 중요성 및 풍부에도 불구....

Protocol

1. 휴먼 Extracellular 단백질의 라이브러리의 생성

1. 세포 표면 수용 체 또는 단백질 microarray 라이브러리를 구축 하는 관심사의 단백질 분 비의 목록을 컴파일하십시오. 특정 단백질 가족 (예를 들어 면역 글로불린 superfamily) 또는 단백질 선택적으로 표현 특히 세포 연구에 대 한 유형을 선택할 수 있습니다.
2. 세포 표면 수용 체에 대 한 신호 펩 티 드 및 소프트웨어 도구를 사용 하 여 막 횡단 영역을 식별 하 여 세포 외 도메인 (ECD) 경계를 결정 합니다. 관련의 일부, 자유롭게 사용할 수 있는 온라인 도구, 재료의 표^15,,1617,18에서 참조.
3. 관련 벡터에 관심과 클론의 유전자에 대 한 ECD를 음성 합성. 분 비 단백질 또는 일반적인 선호도 태그의 수에 융합 ECD의 STM 수용 체 적절 한 벡터와 페 셀의 조건된 미디어에서 또는 잠재-곤충 세포 식 시스템에서 정화 될 수 있습니다.
   참고: 포유류 세포 기반 시스템 (HEK/293 또는 조 ....

Results

세포 외 단백질 microarray 기술에 대 한 워크플로의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 세포 외 단백질 라이브러리를 포함 하는 microarray 슬라이드 사용할 수 있습니다, 일단 관심 및 데이터 분석의 단백질의 심사는 1 일 안에 완료할 수 있습니다. 멤브레인 포함 수용 체 간의 많은 순수 관련 상호 작용 매우 약한 바인딩 강점 (K_D micromolar 범위에서) 특징 이다. 이러한 상호 작용의 개선, 단백질 A-microbeads에 쿼리 (Fc 융합으로 표현) 단백질 multimerization에 따라 방법 개발 되었다. 이 프로토콜은 텍스트에서 설명 하 고 PPI의 향상 된 탐지를 위한이 접근의 성능의 대표적인 예는 그림 2에 표시 됩니다.

Discussion

고아 수용 체의 상당수는 인간 게놈에 남아 고 소설 상호 작용 파트너 이전 특징이 ligands과 세포 외 단백질에 대 한 등장을 계속 합니다. 항상성, 뿐만 아니라 질병, 이어지는 dysregulation 셀룰러 통신을 지정 하는 메커니즘을 이해 하 고 따라서 새로운 또는 향상 된 알려 필수적 이다 모형 유기 체 및 인간 상호 작용 수용 체 ligand 정의 치료 옵션입니다. 그럼에도 불구 하 고, 널리 사용 되는 기술에 의해 세포 외 단백질 상호 작용의 탐지 세포 수용 체와 그들의 상호 작용 협동자의 생화학에 관련 된 기술 과제 때문에 주로 중요 한 방 벽을 대표 했다. 이 보고서에서 우리는 쿼리 PPIs의 향상 된 검색을 위한 microbead 복합물의 활용에 강조를 가진 관심사의 단백질의 심사에 대 한 세포 외 단백질 microarray 사용 하 여를 설명합니다.

수용 체 수용 체 상호 작용을 프로 빙 많은 순수 관련 쌍 micromolar 범위

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
초순수 MB 등급 글리세롤	USB Corporation	56-81-5	단백질 저장
SeptoMark 차단 버퍼	Zeptosens	BB1, 90-40	차단 버퍼 마이크로어레이 슬라이드
소 혈청 알부민	Roche	03-117-957-001	마스크 장착용 슬라이드 제어(옵션),
폴리프로필렌 멀티웰 플레이트	Greiner Bio One	82050-678	단백질 저장
, 폴리프로필렌 멀티웰 플레이트	Arrayit,	MMP384	슬라이드 인쇄
NanoPrint, LM60 또는 이와 유사한 연락처 마이크로어레이어,	Arrayit,	NanoPrint, LM60 또는 이와 유사한 접촉, 마이크로어레이어,	슬라이드 인쇄
, 마이크로 스포팅 핀	어레이잇	마이크로 스포팅 핀	슬라이드 인쇄
, ZeptoFOG 차단 스테이션	Zeptosens	ZeptoFOG 차단 스테이션, 탈	인쇄 후
	Thermo Fisher	LP0031	차단 솔루션
에폭시실란 코팅 유리 슬라이드	Nextrion Slide E	1064016	Microarray 슬라이드
유리 홀더 및 슬라이드 랙 세트	Wheaton	900303	Slide storage
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA23031	Albumin labeling
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001	Human IgG labeling
Pro-spin desalting column	Princeton Separations	CS-800	Remove free dye
접착제 알루미늄 호일 씰	AlumaSeal	F-384-100	씰 스톡 플레이트
폴리프로필렌 극저온 바이알	Corning	430658	Master 바이알 단백질 라이브러리 스토리지
단백질 A 마이크로비즈	Miltenyi	120-000-396	쿼리 단백질 다중화,
Human IgG	Jackson Immunoresearch	& 주의; 009-000-003	표지를 위한 관련 없는 IgG
		P7837	마이크로어레이 슬라이드 차단
혼성화 스테이션, a-Hyb 또는 이와 유사한	Miltenyi	혼성화 스테이션, a-Hyb 또는 이와 유사한	자동 마이크로어레이 처리(옵션)
GenePix 4000B 스캐너 또는 유사한	분자 장치	GenePix 4000B 스캐너 또는 유사한	슬라이드 스캐닝
GenePix Pro 또는 이에 상응하는 데이터 추출 소프트웨어	분자 장치	GenePix Pro 또는 이에 상응하는 데이터 추출 소프트웨어	데이터 처리
신호 P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	온라인 소프트웨어	신호 펩타이드 절단 부위의 존재 및 위치를 결정하기 위한 예측 도구
TMHMM 2.0 서버	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	온라인 소프트웨어	단백질의 막관통 나선 예측
Phobius	Stockholm Bioinformatics Center	온라인 소프트웨어	A combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONS	Stockholm University	온라인 소프트웨어	membrane topology 및 신호 펩타이드 예측