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방법 논문

Glycyrrhizae 기 수의 신경 보호 효과 평가 외 Rhizoma 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 마우스 모델을 사용 하 여 추출

7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58454

⸱

2018년 12월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Korean Medicine, Pusan National University, 2College of Medicine, Dongguk University, 3Kyunghee Naseul Korean Medicine Clinic

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구에서 우리는 결과 얻기 위해 더 많은 재현, 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 마우스 모델을 구축 하 여 기존 실험 방법 수정. Glycyrrhizae 기 수의 구강 관리 외 뿌리 줄기 (GR) 메탄올 추출 물 (GRex), 선 유도 따라 크게 감소 치료 제어 그룹을 기준으로 총 경색 볼륨.

초록

허 혈 뇌졸중 후 뇌 혈 류의 reperfusion 뒤 신경 세포의 죽음 및 뇌 조직의 손실을 이끌어 낸다. 선 공부에 대 한 가장 일반적으로 사용 되 동물 모델은 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델. 이전 연구는 동일한 실험 동물 종 비슷한 MCAO 조건 하에서 사용 하는 경우에 다른 경색 크기를 보고 있다. 따라서, 우리는이 불일치를 해결 하는 향상 된 실험 방법 개발. 마우스 MCAO 폐색 소재로 인간의 선 조건을 모방 하는 필 라 멘 트를 사용 하 여 대상이 됐다 고 필 라 멘 트 두께 더 재현 경색 볼륨 설정 최적화 되었다. Glycyrrhizae 기 수의 마우스는 메탄올으로 치료 추출 외 뿌리 줄기 (GRex) 선 유도 따라 크게 감소 총 경색 볼륨 및 치료 제어 그룹을 기준으로 세포가 살아 나 기의 증가 수. 이 성공적으로 실험 프로토콜을 수정 하 고 reproducibly 뇌경색에 GRex의 유익한 효과 설명 했다.

서론

허 혈과 reperfusion 대뇌 혈 류로 인 한 뇌 손상 신경 세포의 죽음 및 뇌 조직의 손실을 이끌어 낸다. 뇌 손상의이 유형은 비만, 고혈압, 당뇨병 mellitus1,2등 대사 질환의 확산으로 인해 뇌혈관 질환의 증가 보급 증가 하 고 있습니다. 절대 뇌졸중 노인 환자는 극적으로 증가 세계적으로, 그리고 수시로 남겨진다 장기 장애, 이러한 환자에 대 한 의료 서비스의 비용 주요 사회적 부담. 따라서, 2 차 장애 경제 부담1,2를 줄이기 위해 가능한 만큼 많이 완화 한다.

뇌의 가장 일반적으로 사용 되는 설치류 모델은 있는 MCA는 가려진는 실리콘 코팅 수술 suturing 필 라 멘 트 혈액 흐름을 차단 하와 허 혈 성 뇌졸중3, 를 일으키는 중간 대뇌 동맥 (MCA) 폐색 (MCAO) 모델 4. 폐색 소재 내부 luminal 필 라 멘 트 삽입 기간을 조작 하 여 폐색 시간과 영원의 컨트롤 수를 필 라 멘 트를 사용 하 여.

이전 연구는 같은 설치류 MCAO 모델을 사용 하는 경우에 뇌의 총 볼륨 차이가 실험, 연구의 낮은 재현성을 일으키는 나타났습니다. 재현성을 높이기 위해 우리는 실험에 사용 된 필 라 멘 트 민트의 두께 최적화. 대뇌 허 혈 성 기간 및 허 혈 성 기간 60 분 보다 긴의 체적 영역 허용 했다 유도 경색의 예비 연구의 결과 관찰 하 여 측정할 뇌 조직 손상.

Glycyrrhizae 기 수 외 Rhizoma (GR), 일컬어 감 초, 말린된 뿌리와 뿌리 줄기 Glycyrrhiza uralensis 의 구성 및 G. 나무. 그것은 중국 하 고 한국 전통 의학에서 식품 첨가제와 약5,6,7등 다양 한 용도로 사용 되었습니다.

이전 연구8, GR 메탄올 추출 물 (GRex) MCAO 마우스에서 안티-apoptotic 효과 보여주었다 사전 치료 (Bcl-2) B-세포 림프 종 2의 단백질 표정에 있는 감소의 중요 한 예방 및 Bcl 초대형 (Bcl-xL)를 포함 하 여. 이 연구는 GRex 후 경색 치료 효과적으로 MCAO-대뇌 손상에서 경색 볼륨을 감소 하는 경우 결정의 효율성을 평가 하 여 기존의 MCAO 마우스 모델의 재현성을 향상 시키기 위해 실시 되었다.

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프로토콜

동물 관련 된 모든 절차는 부산 대학교 (승인 번호, 부산대-2016-1087)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 이 연구에 대 한 그래픽 개요는 그림 1에 표시 됩니다.

1. 준비 및 GRex의 관리

참고:이 연구에 사용 된 GR 상업적인 제약 회사에서 구입 했다.

  1. 메탄올의 2000 mL에 GR의 200g를 배치 하 고 5 일 동안 실 온 (25 ° C)에서 품 어.
  2. 0.26 m m 두께와 5 µ m 기 공 크기, 필터 종이 사용 하 여 혼합물을 필터링 하 고는 상쾌한 제거. GR 잔류물에 메탄올 1000 mL를 추가 하 고 다시 필터링.
  3. 두 개의 supernatants 결합, 필터 종이 통해 필터링, 진공, 아래 집중 하 고 생산 GRex 잔류물을 freeze-dry.
  4. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 0.9% 생리 식 염 수로 희석에 GRex 녹이 고는 0.45 μ m 주사기 필터를 통해 필터링. 그런 다음 < 5 %DMSO 최종 농도 조정 합니다.
  5. 구강을 통해 MCAO reperfusion 후 GRex (300 밀리 그램/kg 체중) 1 시간을 관리 합니다. 생리 식 염 수 (10 mL/kg 체중) 정상적인 그룹 및 제어 그룹에만에 각각 희석 DMSO를 관리 합니다.
    참고:이 실험에 사용 된 GRex 농도 있었던 우리의 이전 연구8농도 따라 결정 되었다.

2. 마우스 모델 MCAO의

  1. 사용 남성 C57BL/6 쥐 세 6 주 하 고 22-25 g. 무게 제공 표준 차 우와 물, 그리고 집에 무료로 액세스할 모든 동물 제어 온도 (22 ± 1 ° C)는 환경에서 그들 12 h 명암 주기.
    1. 보통 가짜 운영, 제어, 및 GRex 치료 그룹의 구성 한다 6 마우스 각각의 그룹으로 마우스를 나눕니다.
    2. MCAO 수술 (고이즈미 외 의 방법의 수정 9) 제어 및 스테레오-현미경을 사용 하 여 GRex 치료 그룹에.
  2. 70% N2O 2% isoflurane 30% O2를 사용 하 여 마우스에 흡입 마 취를 유도. 마 취 때 마우스 꼬리에 적용 하는 기계적인 자극에 반응이 충분 한으로 간주 됩니다. 36.5 ± 0.5 ° C 온도 지주 담요 온도계에 연결 하는 몸을 사용 하 여에서 쥐의 체온을 유지 한다.
  3. 가슴에 머리를 제거 하 고 면도 하 여 쥐의 목 제 모 크림의 사용 하 여 다음 2 번 술과 함께 번갈아 betadine 스크럽으로 피부 수술 부위의 소독 이며 약 2cm의 절 개 수술로 긴 목의 센터에 블레이드입니다. 조심 스럽게 왼쪽된 일반적인 경 동맥 (LCCA), 외부 경 동맥, 및 주위 결합 조직에서 내부 경 동맥의 분기를 격리 합니다.
  4. 외부 경 동맥과 (4-0 비단 봉합, 반 히 치 매듭) 일시적으로 혈액 흐름을 차단 하는 수술 봉합으로 일반적인 경 동맥 내부 경 동맥으로 작업 중 선.
  5. 실리콘 코팅 나일론 봉합 (8-0 monofilament, 11 m m 긴) 왼쪽된 MCA의 기원에 내부 경 동맥을 통해 삽입 합니다. 0.10-0.12 범위에 필 라 멘 트의 실리콘 코팅 부분의 두께 조정 m m.
  6. 레이저 도플러 유량 계를 사용 하 여 MCA에 상대적인 대뇌 혈 류 (rCBF)에 있는 감소를 측정 합니다. MCAO는 rCBF은 전체 허 혈 성 기간 동안 휴식 조건 값의 < 20%에서 유지 될 때 확인 될 것입니다.
  7. 대뇌 동맥을 차단 하는 동안 2 시간에 대 한 혈관에 삽입 된 필 라 멘 트를 수정 하 고 신중 하 게 철회 reperfusion의 22 h에 대 한 혈액 흐름을 복원 하는 필 라 멘 트. 5 장소 (3-0 비단 봉합, 두 절반 보내고 매듭)에서 봉 제 하 여 피부를 봉합 하 고 마 취에서 각 성 각 마우스 허용.
  8. 일반 그룹에서 다음과 같은 예외 (2.4)까지 위의 동일한 절차에 따라 가짜 작업을 수행. 일반적인 경 동맥 선 고 베인된 근육과 피부를 봉합.

3. 손상 된 뇌 조직의 볼륨의 측정

  1. CO2 흡입 뇌 손상 측정에 대 한 생쥐의 안락사, 후 소비 마우스 MCAO 아이리스 수술가 위를 사용 하 여 직각된 포 셉의 발병 후 24 시간 두뇌.
    1. 가 위를 사용 하 여 머리를 제거한 후 두개골에서 피부를 뒤집어 머리의 중간 피부에 절 개를 확인 합니다.
    2. 정수 리 뼈 각도 겸 휴식, 경질 벗는 동시에 중요 하 고 신중 하 게 두개골에서에서 뇌를 분리.
  2. 컷 섹션 (두께 1 m m)으로 삭제 조직 마우스 뇌 매트릭스를 사용 하 고 2 %2,3,5 triphenyltetrazolium 염화 (TTC)의 솔루션에 17 분에 대 한 섹션을 얼룩.
  3. 적어도 2 시간에 대 한 10% 포 르 말린에 섹션을 수정 하 고 디지털 카메라를 사용 하 여 사진을. TTC 괴 지역 흰색 될 것입니다 하는 동안 가능한 조직 붉은 얼룩 관찰 됩니다.
  4. 분석 하 고 계량 ImageJ를 사용 하 여 각 섹션의 대뇌 경색 영역.

4. hematoxylin과 오신 (H & E) Cresyl 조직학 섹션의 보라색 얼룩

  1. CO2 흡입에 의해 조직학 연구에 대 한 마우스를 안락사 그리고 그들 transcardially 인산 버퍼 (PBS), 염 분의 10 mL와 10 mL 4 %paraformaldehyde (PFA)의 뒤에 perfuse. (3.1) 위의 동일한 절차를 사용 하 여 뇌를 분리 하 고 30% 자당의 10 mL에 뇌를 하룻밤 담가.
  2. 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물에 뇌 조직을 포함 하 고 coronally는 cryostat를 사용 하 여 15 µ m 두께 섹션으로 그것을 슬라이스. 되며 고 오신 (H & E) 또는 cresyl 보라색 얼룩이 다음 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.
  3. 1 분 뒤에 5 분 동안 되며 솔루션에서 얼룩에 대 한 80% 에탄올에 유리 슬라이드에 젖어.
    1. 1% 산 알코올에 슬라이드를 두 번 찍어, 30에 대 한 포화 리튬 탄산염 해결책에서 담가 30 s, 그리고 counterstain 30 오신 솔루션에 대 한 수돗물으로 세척 s s.
    2. 린스 수돗물에 슬라이드, 연속적으로 95%와 절대 에탄올에 담근 다.
    3. 슬라이드를 건조, 적어도 10 분 동안 크 실 렌에서 그들을 취소 하 고 설치 매체를 사용 하 여 coverslips를 탑재.
  4. 적어도 1 시간, 클로 프롬 하룻밤 희석 50% 에탄올에 침수에 의해 다음에 대 한 따뜻한 슬라이드 유리 슬라이드를 놓습니다.
    1. 40 ° C의 건조 오븐에서 10 분 0.1 %cresyl 바이올렛과 슬라이드 얼룩.
    2. 30 분 동안 95% 에탄올에 immerse 다음 2 시간 동안 절대 에탄올에서 탈수.
    3. 5 분, 크 실 렌에 2 번 후 공기 건조 후 장착 매체 마운트하기.
  5. 현미경을 사용 하 여, MCAO 유도 뇌 손상 후 발생 한 조직학 변화 관찰.

5. 통계 분석

  1. 실험 결과 수단 ± 표준 편차로 표현 하 고는 단방향 분산 분석 (ANOVA) Tukey의 임시 게시물 분석 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 다음을 사용 하 여 그룹 간의 통계적 의미를 결정 합니다.
  2. P에 통계적 의미를 설정-< 0.05 값.

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결과

가짜 운영 하는 일반 그룹에 아무 대뇌 경색 반면 상대적으로 광범위 한 손상된 영역 관찰 제어 그룹에서 관찰 된다. 쥐에 관리 300 mg/kg GRex MCAO 모델 그룹, 손상 된 영역에서 통계적으로 유의 한 감소에에서는 (그림 2) 관찰 됩니다.

조직학 변화는 조사에 의해 허 혈 성 뇌 섹션 H & E 또는 cresyl 보라색 얼룩. H & E 염색 제공 합니다 구조 정보를 특정 기능에 대 한 정보와 셀10, 반면 hippocampal 신경11의 총 수를 추정 하는 데 사용 됩니다 cresyl 보라색 얼룩. 따라서, H & E 또는 cresyl 바이올렛 강도, ImageJ 소프트웨어 (

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토론

뇌졸중 주요 위험 요소는 만성 고혈압, 당뇨병, 고 지 혈 증, 등 대사 질환의 증가 보급, 뇌졸중 예방 및 치료는 되었다 의료 연구12, 의 중요 한 지역 13. 언어 및 뇌졸중 후 운동에 적자는 강하게 뇌 조직14 환자 및 그들의 가족15가난한 삶의 질에서 발생 하는 손상의 정도 연관. 그것은 약물 치료의 효능 연구를 인간의 질병에서 발생 하는 그 같은 병 적인 변화를 포함 하는 뇌졸중의 적절 한 동물 모델을 사용 하는 것이 중요. MCAO 모델 대뇌 동맥 혈관을 방해 하 여 thrombotic 스트로크를 모방 합니다. 그것은 상대적으로 재현할 수 및 최소 침 습16,17,,

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

적용 되지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Glycyrrhizae Radix et RhizomaGwangmyoung Pharmaceuticals Co., KoreaGlycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paperAdvantecFilter paper No. 2Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418-250MLDimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µ m)시그마CLS431220주사기 필터(0.45 &마이크로; m)
스테레오 현미경라이카M50스테레오 현미경
스테레오 현미경니콘SMZ745스테레오 현미경
레이저 도플러무어 악기moorVMS-LDF레이저 도플러
마취 탁상용 브래킷 N2O & O2 유량계 시스템Harvard Appratus34-1352마취 탁상용 브래킷(N2O 포함) 및 O2 유량계 시스템
동종 모니터링 시스템Harvard Appratus55-7020동종 모니터링 시스템
디지털 카메라CanonEos-M2디지털 카메라
저온 유지 장치LeicaCM3050S저온 유지 장치
현미경Carl ZeissZeiss Zeiss Axio현미경
데이터 분석Systat Software Inc.SigmaPlot 버전 12데이터 분석
데이터 분석 NIH이미지ImageJ데이터 분석
마우스 다이어트두열 생명공학표준 설치류 차우마우스 다이어트
이소플루란중화A02104781이소플루
란 이소플루란TROIKAAISOTROY 100이소플루란
실크 봉합사 (4-0 블랙 실크) AILEESK47510실크 봉합사 (4-0 블랙 실크) 
실크 봉합사(3-0 화이트 실크) 백재57실크 봉합사 (3-0 백실크) 
나일론 봉합사(8-0 모노필라멘트) AILEENB825나일론 봉합사(8-0 모노필라멘트) 
2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)시그마T8877-25G2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)
포르말린(포름알데히드 용액)JUNSEI69360-1263 20KG포르말린(포름알데히드 용액)
헤마톡실린(해리스 헤마톡실린)YD 진단EasyStain헤마톡실린(Harris Hematoxylin)
에오신(1% 에오신 Y 용액)MUTO PURE CHEMICALS3200-2Eosin (1% Eosin Y 용액)
크레실 바이올렛(아세테이트)SigmaC5042-10G크레실 바이올렛(아세테이트)
파라포름알데히드 시그마-알드리치P6148-1KG파라포름알데히드 
설탕JUNSEI31365-0350 1KG설탕
최적 절단 온도 (OCT) 화합물Scigen4583최적 절단 온도 (OCT) 화합물
해부 나이프Fine Science Tools10055-12해부 나이프
# 4 ForcepFine Science Tools11241-30# 4 Forcep
# 5 ForcepFine Science Tools11254-20#5 Forcep
#6 ForcepFine Science Tools11260-20#6 Forcep
#7 Fine ForcepFine Science Tools11274-20#7 Fine
Forcep Surgical ScissorsFine Science Tools14001-12수술용 가위
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring 가위파인 사이언스 도구15371-92Moria Pascheff-Wolff 스프링 가위
용기 팽창 힘자파인 사이언스 도구18153-11용기 팽창 힘자

참고문헌

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