여기, 우리 남부 럽 그리고/또한 PCR를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 발생 하는 동종 재결합 이벤트를 식별 하는 데 자세한 프로토콜 제시. 이 메서드는 nonmuscle myosin II 유전자 대체 마우스 모델 기술을 사용 하 여 전통적인 배아 줄기 세포 기반 동종 재결합 중재 대상의 세대에 의해 exemplified입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
오프 대상 효과의 문제 및 디자이너 nucleases 게놈 편집, 배아 줄기에 대 한 응용 프로그램에서 긴 DNA 파편을 삽입의 어려움에 상대 (ES) 세포 기반 유전자를 대상으로 이러한 결점 없는 기술과 널리 큰 삭제/삽입에서 단일 염기 치환에 이르기까지 동물/마우스 게놈을 수정 하는 데 사용. 특히, 상대적으로 적은 동종 재결합 (HR) 이벤트를 얻기 위해 필요한 식별 원하는 ES 클론은 정확 하 고 안정적인 방법 요구 중요 한 단계. 남부 럽 또는 기존의 PCR 수시로이 목적을 위해 활용 됩니다. 여기, 우리는 그 두 가지 방법을 사용 하 여 마우스 ES 세포는 생 Myh9 유전자는 중단 하 고 다른 nonmuscle myosin 무 겁 사슬 IIs (NMHC IIs) 인코딩 cDNAs에 의해 대체 하기 위한 것에서 발생 하는 시간 이벤트를 식별 하는 자세한 절차를 설명 합니다. 남부 럽의 모든 절차는 vector(s), electroporation, 약물 선택, 확장 및 ES 세포/클론, 준비, 소화, 저장을 지정 하 고 게놈 DNA (gDNA)는 교 잡의 럽의 건설을 포함 하 고 probe(s), 및 x-선 필름에 autoradiography에의 마지막 단계 세척. PCR는 준비 하 고 희석 gDNA를 직접 수행할 수 있습니다. 이상적인 결과 얻기 위해 프로브 및 (재) 남부 럽에 대 한 절단 사이트 및 PCR 위한 뇌관 제한 효소 수 신중 하 게 계획 합니다. 비록 남부 럽의 실행 시간과 노동 집약적 이며 PCR 결과 판정, 남부 럽 및 PCR에 의해 신속한 검사 하 여 올바른 식별 설명 하는 이러한 방법을 단독 또는 결합 된 응용 프로그램 허용 널리 사용 하 고 대부분의 실험실 genotypes ES 세포 및 유전자의 식별에 의해 상담이 종이에서 동물 수정.
서론
기술 murine ES 세포에서 시간에 의해 대상으로 하는 유전자의 특정 유전자 변이1,2의 셀룰러 결과 해 부를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 중요성 및이 기술의 중요성 2007 노벨상 생리학 또는 약3,4;에 의해 그것의 인식에 반영 됩니다. 한편, 그것은 유전자 공학5의 현대 시대의 출현을 나타냅니다. 진 HR을 통해 대상 포인트 돌연변이에서 ES 세포6,7마우스의 게놈에 있는 큰 염색체 재배열에 이르기까지 거의 모든 변화를 활용할 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 소위 게놈 편집 도구의 출현 하기 전에, 유전자 녹아웃 마우스의 세대 ES 세포8,9,10에 유전자를 대상으로 한 기술의 응용 프로그램 필요. 지난 2 년 동안 5000 개 이상의 유전자 타겟팅 마우스 모....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 설계 대상으로의 Construct(s), 남쪽 오 점, 조사 및 PCR 위한 뇌관
- 녹아웃/노크-에서 보고 여기의 응용 프로그램에서 중단 또는 삽입에 대 한 Myh9 유전자의 첫 번째 코딩 exon (exon 2)를 선택 합니다.
- 5 kb 업스트림 및 5 kb 다운스트림 DNA 시퀀스 Myh9 exon 2 genome.ucsc.edu 웹사이트에서 주변을 검색 합니다.
- 남부 럽에 대 한 게놈 DNA를 소화 하기 위해 적당 한 RE(s)를 pDRAW 소프트웨어를 사용 하 여 제한 효소 (입술)이 10 kb 지역에서 1-2 컷으로의 소화 패턴 분석.
이 요구 사항을 충족 하 고 목적을 위해 선택에 Dra를 참고: - 즉각적인 4 조각을 선택 왼쪽된 상 동 팔 (LHA) 2와 1.7 kb 조각 즉각적인 다운스트림 시퀀스 오른쪽 상 동 팔 (RHA); Myh9 exon의 업스트림 1kb 단편 5' 상류 남부 럽 및 1.2 kb 조각 3' 하류 오른쪽 프로브 (RP)으로 나의 왼쪽된 프로브 (LP)으로 LHA의 위의 분석에 기반을 선택 합니다.
- Primer3 프로그램을 사용 하 여 PCR에 의해 그 4 개의 DNA 파편을 증폭에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관 디자인. 앞으로 뇌관....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 논문에서는 남부 럽 PCR의 상세한 프로토콜 설명, 셀 기반 HR 중재 대상 기술 ES를 사용 하 여 NM II 유전자 대체 마우스 모델의 생성에 대 한 마우스 ES 세포에서 발생 하는 이벤트를 시간을 식별 하기 위해 이용 되는 합니다. 비록 남부 럽 고 PCR, 뿐만 아니라 전통적인 유전자를 대상으로 기술, 널리 사용 되었습니다 수 십년 동안, 그들의 성공적인 적용 신중 하 게 계획 해야 합니다. 적어도 이러한 측면은 고려 되어야 하는 데 필요한: 길고 짧은 팔, 위치 및 프로브, 게놈 DNAs 뇌관 도움이 그림 1에 요약 된 대로, PCR를 위한 절단 적당 한 해상도의 길이의 길이 이후 분석입니다. 남부 럽의 중요 한 단계, 준비 하 고 소화 게놈 DNAs는 구분 하는 데 필요한 조사에 의해 감지에 대 한 DNA 젤에. DNAs 게놈 많은 서로 다른 길이와 조각으로 잘라는, 때문에 그들은 DNA 젤,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
현재, 게놈 편집 디자이너 nucleases 여전히 ES 세포 기반 유전자를 대상으로 기술 대상에서 효과 및 긴 DNA 조각30,31삽입에 어려움의 그것의 문제로 바꿀 수 없습니다. 메서드로 골든 마우스 ES 세포에서 발생 하는 시간 이벤트를 식별 하는 데,이 보고서는 필드에 대 한 남부 럽 고 PCR의 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 일련의 구문 대상으로 마우스 ES 세포에서 개별 클론을 분석 하 여 이러한 방법의 신뢰성을 검증. 이러한 방법으로 식별 원하는 ES 클론 생성 해당 마우스 모델27를 성공적으로 사용 되었습니다 했다.
타겟된 ES 클론의 심사에 대 한 다른 기술이 설명된19,32, 남쪽 더 럽 히기의 방법 그.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품의 국가 자연과학 기초의 중국 (보조금 번호 31571432), 인간의 지방 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 2015JC3097), 그리고는 연구 재단의 교육 국의 호남 일반 프로그램에서 지원 받은 (보조금 번호 15 K 054) 지방, 중국.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus 맥시 키트 | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra 고충실도 DNA 중합효소 | 애질런 | 600382 | |
| T-easy 벡터 | Promega | A1360 | |
| 핵 용해 용액 | Promega | A7941 | |
| 단백질 침전 용액 | Promega | A7951 | |
| DNA 변성 용액 | VWR | 351-013-131 | |
| DNA 중화 용액 | VWR | 351-014-131 | |
| ready-To-go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20x | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, V/V) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| 연어 정자 DNA 솔루션 | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA 중합효소 고충실 | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| 왓맨 TurboBlotter 전송 시스템, 대형 키트 | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α 32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 마이크로 컬럼 | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I 혼성화 솔루션 | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z& Z 메디컬 | 844 5702 |
참고문헌
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
