여기, 우리 세포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 초파리 비주얼 시스템 내에서 낮은 풍부에 효율적으로 하기 위한 셀 분리 프로토콜을 제시.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
다음 세대 시퀀싱의 감도에 최근 개선 세포의 작은 숫자 transcriptomic 및 게놈 분석의 적용을 촉진 했습니다. 다양 한 셀 형식 관련 유전자 도구를 자랑 하는 초파리 시각 시스템 개발 연구를이 기술을 활용 하 여 정확한 세포 해상도와 개발의 분자 기초를 해결 하기 위한 강력한 접근 방식을 제공 합니다. 이러한 접근 가능 하, 그것은 안정적이 고 효율적으로 정화 세포는 두뇌 내의 낮은 풍부에서 존재 하는 능력을 중요 하다. 여기, 우리는 유전 모자이크 실험에서 단일 세포 클론의 효율적인 정화를 허용 하는 방법 제시. 이 프로토콜 우리가 지속적으로 달성 셀룰러 고수익 정화 형광을 사용 하 여 정렬 (FACS) (모든 레이블이 지정 된 셀의 25%), 세포를 활성화 하 고 성공적으로 단일 세포 클론 통해 생성에 transcriptomics 분석을 수행 후 repressible 셀 표시 (MARCM)와 함께 모자이크 분석. 이 프로토콜은 transcriptomic 및 게놈 분석에 적용 특정 세포 유형 시각 시스템에서 다른 유전자 조작의 맥락에서 개발의 다른 단계에 걸쳐 이상적 이다.
서론
Drosophila 시각 시스템 개발 및 행동의 유전 기초 공부에 대 한 뛰어난 모델입니다. 그것은 특정 세포 유형2,3를 조작 하기 위한 고급 유전자 툴킷 진부한 세포질 건축1 구성 되어 있습니다. 이 시스템의 주요 힘이 자율적으로 유전자 기능 유전 모자이크 방법4,5를 사용 하 여 단일 셀 해상도 셀 형식에는 기능입니다. 우리 셀 형식별 transcriptomic 수행을 다음 세대 시퀀싱에 최근의 진보와 함께 이러한 유전적 도구를 결합 하 고 유전 모자이크 실험에서 복제 하는 단일 셀에 게놈 분석.
이 위해 선택적으로 두뇌에 있는 낮은 풍부한 세포 인구를 분리 하는 강력 하 고 효율적인 방법을 개발 필수적 이다. 이전에 우리는 FACS, 번데기 개발 동안 시각적 시스템에서 특정 세포 유형을 분리 하 고 RNA-seq6을 사용 하 여 그들의 transcriptomes 결정에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 이 실험에서 특정 유형 (예:....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 실험 전에 계획
-
시작 하기 전에 실험, 유전학 특별히 원하는 셀을 예상 대로 작동 하는 경우 확인 하는 소규모 파일럿 실험을 수행 합니다.
- 첫 번째 패스, 사용 immunohistochemistry와 가벼운 현미경을 원치 않는 셀으로 표시 됩니다. 이상적으로, 유전자 표시는 망막과 시 엽 (그림 3) 내에서 특정 있을 것입니다. 만 광 엽 세포 분리에 사용 되 고 중앙 두뇌에 라벨 그래서 문제가 되지 않습니다. 동시에 관심의 셀 수는 뇌 당 표시 결정 합니다.
- 유전 상표는 수행 하는 경우 셀의 순수한 인구를 확인 하는 파일럿 FACS 실험 (그림 4) 원하는 특이성 reproducibly 고립 될 수 있다 그리고 또한 관심의 셀 수를 평가 하기 위해 격리 될 수 있습니다 각 두뇌에서. 필요한 경우, 풍부를 결정 하기 위해 정량 PCR 통해 격리 된 세포의 순도 또는 덜 농축 특정 유전자의 평가.
-
십자가 실험에 대 한 자료의 원하는 금액을 얻는 데 필요한 수를 결정 합니다.
참고: 실험 경험에 따라, 붙일 레이블 셀 ~....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
일반적인 계획
프로토콜의 일반적인 체계는 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜 세 가지 주요 부분으로 나누어져: 작업, 샘플 준비, 시퀀싱 및 데이터 분석. "실험 전에 계획" 세션 프로토콜의 편의상 일반적인 계획에 포함 되지 않습니다.
타임 라인
(비행 작업 및 샘플 준비) 프로토콜의 주요 부품의 캘린더는 그림 2에 표시 됩니다.
Confocal 현미경 검사 법에 의해 셀 전용 라벨 확인
대표적인 실험 L3 lamina monopolar 뉴런 (L.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 간단 하 고 실행 하기 기술적으로 곤란 하지 하지만 여러 주요 단계는 것을 간과 하는 경우는 세포의 수율에 상당한 감소를 일으킬. (2.3.2 단계입니다.) 그것은 중요 한 십자가 건강 한, 그리고 음식을 밖으로 건조 하지 않습니다. 십자가의 정규 급수는 바로 유전자 형의 올바른 개발 단계에서 해 부에 사용할 수 있는 파리의 수를 최대화 하려면 필수적입니다. 얼마나 자주 급수 할 필요가 십자가 사용 음식과 파리의 주택 조건에 따라 달라 집니다. 십자가 밖으로 건조 하지 않습니다 있도록 검토 튜브 하루에 두 번 하 고 그에 따라 물을 추가. (단계 3.3입니다.) 그것은 또한 단일 microtube 자신의 microtube를 사용 하 여 각 것 있고 그 이후에 샘플 풀링 반대 분리 하는 데 사용으로 해 부 머리를 합동 하는 것이 중요. 이 전송 될 수 있는 microtubes 사이 잃어버린 어떤 두뇌를 제거 합니다. (단계 3.4.9입니다.) 때 수동으로 조직 방해를 위아래로 pipetting, 조직의 아무 나머지 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
이 연구는 NINDS의 보너스 번호 K01NS094545, 신경 퇴행 성 질환의 연구에 대 한 Lefler 센터에서 andgrants에서 건강의 국가 학회에 의해 투자 되었다. 우리 인정 Liming 탄 제이슨 McEwan 귀중 한 대화 합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | 단백질 분해 효소 혼합물 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 포도 | 시그마-알드리치 | G0350500 | |
| L-글루타티온 | 시그마-알드리치 | G6013 | |
| 열 비활성화 소 혈청 | 시그마-알드리치 | F4135 | |
| 인슐린 용액 | 시그마-알드리치 | I0516 | |
| L-글루타민 | 시그마-알드리치 | G7513 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 솔루션 | : Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA 정제 키트 |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 솔루션 | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 베타인 솔루션 | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR 정제 키트 | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA 라이브러리 준비 키트 | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 시험관 | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top 진공 필터 시스템 | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria 유세포 분석기 | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 염기서열분석 시스템 | Illumina | SY– 401– 2501 |
참고문헌
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stat....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
