방법 논문

분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석

DOI:

10.3791/58475

⸱

2018년 11월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Patricia and John Rosenwald Laboratory of Neurobiology and Genetics, Rockefeller University, 2Electron Microscopy Resource Center, Rockefeller University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시 된 분석 섬유 소 혈전 구조에 베타-아 밀 로이드의 효과 개별적으로 또는 조합에서 사용할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외에서 섬유 소 혈전, 만드는 뒤에 병 탁도 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 방법 포함 된 프로토콜이입니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서는 체 외 섬유 소 혈전 생성 및 분석 하 여 응고 형성 및 구조에 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 단백질의 효과 분석 하 고 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 대 한 방법을 선물 한다. Aβ, Alzheimer의 질병 (광고)에서 신경 녹말 체 집계를 형성, fibrinogen 상호 작용을 보였다. 이 Aβ fibrinogen 상호 작용 구조적으로 비정상적인 fibrinolysis에 저항 하 고 섬유 소 혈전을 만든다. 섬유 소는 혈액 응고에 이상이 Aβ 유도 또한 microinfarcts, 같은 광고 병 리의 뇌혈관 측면에 기여할 수 있습니다 염증, 뿐만 아니라, 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy (CAA). 광고 병리학 neurovascular 적자의 잠재적으로 중요 한 역할을 감안할 때, 유망한 치료 가치는 억제 또는 Aβ fibrinogen 상호 작용을 줄일 수 있는 화합물을 개발. 생체 외에서 메서드는 섬유 소에 의해 응고 형성 평가 될 수 있다 쉽고 체계적으로 치료 화합물 개발을 위한 잠재적으로 유용한 도구입니다. 여기는 섬유 소 혈전의 생성 생체 외에서 Aβ 및 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제의 효과의 분석에 대 한 최적화 된 프로토콜이입니다. 병 탁도 분석 결과 신속 하 고 매우 재현 이며 Aβ fibrinogen 억제제의 다 수의 심사에 대 한 수 있도록 여러 조건을 동시에, 테스트를 사용할 수 있습니다. 이 심사에서 히트 화합물 더 SEM.를 사용 하 여 섬유 소 혈전 아키텍처의 구조 이상 Aβ 유도 개량 하는 능력에 대 한 평가 이러한 최적화 된 프로토콜의 효과 TDI-2760, 최근 확인 된 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제를 사용 하 여 여기 보여 줍니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alzheimer의 질병 (광고), 신경 질환 노인 환자에서 인지 감소에 이어지는 주로 비정상적인 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 식, 집계 및 장애인된 클리어런스 neurotoxicity1, 의 결과에서 발생 2. Aβ 집계 및 광고3사이 잘 특징이 협회에도 불구 하 고 근본적인 질병 병 리 정확한 메커니즘은 잘 이해4. 증거를 증가 제안 Aβ6순환 시스템 구성 요소와 직접 상호 작용으로 neurovascular 적자 진행 및 광고5, 심각도에 역할을 재생 합니다. Aβ는 fibrinogen7,8, 또한 광고 환자 및 마우스 모델9,,1011Aβ 예금 localizes와 높은 선호도 상호 작용. 또한, Aβ fibrinogen 상호 작용 fibrinolysis9,12저항 뿐만 아니라 비정상적인 섬유 소 혈전 형성 및 구조, 유도합니다. 광고, 치료 한 치료 가능성 Aβ 및 fibrinogen13,14사이 상호 작용을 억제 함으로써 순환 적자 경감 이다. 우리는, 그러므로, 높은 처리량 검열 및의 약 화학 접근13,14를 사용 하 여 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하는 여러 작은 화합물 확인. Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 효능을 테스트 하려면 우리 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 분석을 위한 두 가지 방법을 최적화: 응고 탁도 분석 결과 및 스캐닝 전자 현미경 (SEM)14.

병 탁도 분석 결과 섬유 소 혈전 형성 UV 보이는 분광학을 사용 하 여 모니터링을 위한 스트레이트-앞으로 및 빠른 방법입니다. 섬유 소 혈전으로 형태, 빛은 점점 더 흩어져 하 고 솔루션의 탁도 증가 한다. 반대로, Aβ 있으면, 섬유 소 혈전의 구조 변경 및 혼합물의 탁도 감소 된다 (그림 1). 억제 화합물의 효과 병 탁 Aβ 유도 이상에서 복원 가능성에 대 한 평가 될 수 있습니다. 탁도 분석 결과 여러 조건의 신속한 분석에 대 한 수 있으며, 병 모양 및 구조에 제한 된 정보를 제공 합니다. SEM, 솔리드 객체의 지형 전자 조사에 의해 밝혀 수 응고15,16,,1718 의 3 차원 구조 분석 방법의 평가 대 한 Aβ의 존재와 또는 억제 화합물 그 구조9,14변경 합니다. 두 분석 및 SEM는 다양 한 목적을 위해 사용 된 고전적인 실험실 기술, 예, 분 광 광도 법 녹말 체 집계19,20모니터링을 위해 사용 됩니다. 마찬가지로, SEM 분석 파 킨 슨 병 및 thromboembolic 치기 환자21,,2223Alzheimer, 플라즈마에서 형성 된 섬유 소 병 하도 사용 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 재현 하 고 빠른 방식으로 섬유 소 혈전 형성 평가 적합 합니다.

다음 프로토콜 생체 외에서 섬유 소-응고를 모두와 함께 Aβ 없이 준비에 대 한 지침을 제공합니다. 그것은 또한 섬유 소 혈전 형성과 구조에 Aβ의 효과 분석 하는 방법을 자세히 설명 합니다. Aβ-fibrinogen 상호 작용의 억제를 측정 하기 위한이 두 가지 방법의 효과 TDI-2760, 작은 억제 화합물14를 사용 하 여 보여 줍니다. 이 방법을 개별적으로 함께, 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 신속 하 고 간단 분석 허용.

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프로토콜

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1. 분석을 위한 Aβ42 및 Fibrinogen의 준비

  1. 동결 건조 된 분말에서 단위체 Aβ42 준비
    1. 1500 x g 30에 내려 실내 온도와 회전 Aβ42 분말을 따뜻한 s.
    2. Aβ42 분말의 0.5 밀리 그램 당 100 µ L의 얼음 hexafluoroisopropanol (HFIP)를 추가 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어.
      주의: HFIP을 처리할 때 주의 사용 하 고 화학 후드에 있는 모든 단계를 수행.
    3. 20 µ L aliquots 고 영화 공기 건조에 2-3 헤 영화에 대 한 화학 후드-20 ° c.에 저장 될 수 있다 준비
    4. 실 온에서 10 분 동안 목욕 sonicator에 동요 하 여 신선한 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 10 µ L에서 단위체 Aβ42 영화를 다시 구성.
    5. 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) 버퍼 (pH 7.4)의 190 µ L을 추가 하 고 부드럽게 위아래로 플라스틱.
    6. 20 분 동안 4 ° C에서 20,817 x g에서 원심 분리 하 여 단백질 집계를 제거 합니다.
    7. 4 ° C에서 상쾌한 하룻밤을 위해 품 어 고 다음날 원심 단백질 집계 더 이상 삭제 20 분 4 ° C에서 20,817 x g에서 솔루션.
    8. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과를 Aβ42 농도 측정 한다. 직렬 희석 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 1 mg/mL에서 0.0625 mg/mL 단백질 표준 생산, 3 중에서 다 잘 접시의 우물에 각 표준의 10 µ L을 추가 하 게 정화. Aβ 샘플 1: 4을 묽 게 하십시오 고 3 중에 우물에 10 µ L를 추가 합니다. BCA 솔루션 A와 B를 혼합 하 고 추가 200 µ L 각 잘. 37 ° C에서 30 분 동안 품 어와 읽기 562에서 플레이트 리더에 nm. 얼음에 나머지 Aβ 솔루션을 유지 하 고 탁도 분석 결과 및 SEM.에 대 한이 준비를 사용 하 여
  2. Fibrinogen 솔루션 준비
    1. 15 mL 튜브에 fibrinogen 동결 건조 된 분말의 20 밀리 그램을 측정 하 고 다시 20 m m hydroxyethylpiperazine 탄 술 폰 산 (HEPES) 버퍼 (pH 7.4) 미리 데워 진된 2 mL와 함께 일시 중단.
    2. 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 품 어.
    3. 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 저장 합니다. 솔루션 4 ° C, 필터에서 밖으로 다시 0.1 µ m 주사기 필터를 통해 fibrinogen 집계를 제거 하거나 기존 섬유 소.
    4. BCA 분석 결과를 fibrinogen 농도 측정 한다. 1.1.8 단계에서 지침을 따릅니다. 4 ° C에서 나머지 fibrinogen 솔루션을 유지 하 고 탁도 분석 결과 및 SEM.에 대 한이 준비를 사용 하 여

2. 병 탁도 분석 결과

  1. 그것의 최종 농도 버퍼의 200 µ L에서 3.0 µ M 96 잘 접시의 각 실험 잘 하려면 단계 1.1.8에서에서 30 µ M Aβ42 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다. 50 mM Tris 버퍼 (pH 7.4) 96 잘 접시 웰 스 제어 버퍼에 5 %DMSO 동일한 볼륨을 추가 합니다.
    참고:이 단계에서 Aβ42의 정확한 볼륨 중요 하지 않습니다. 낮은 농도 준비에 대 한 높은 볼륨을 사용할 수 있습니다, 그리고 응고 형성 버퍼의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 마지막 볼륨 200 µ L을 유지 한다.
  2. 억제 화합물을 테스트 하는 경우 희석 DMSO로 작업 농도에 화합물. 추가 화합물 또는 DMSO 우물 Aβ42와 잘 혼합 하는 컨트롤에 대 한 혼자.
    참고: Aβ42 솔루션 우물, 화합물의 하단에 이산 물방울을 형성 한다 또는 DMSO는 물방울의 센터에 직접 pipetted 한다.
  3. 단계 1.2.4 응고 형성 버퍼에서에서 fibrinogen 재고 솔루션을 희석 (20 mM HEPES buffer (pH 7.4), 5mm CaCl2, 그리고 137 mM NaCl) 96 잘 접시의 Aβ42 포함 하 고 제어 우물에 추가. 되도록의 최종 농도 1.5 µ M에 총 200 µ L 반응 fibrinogen 솔루션의 볼륨을 조정 합니다. 플라스틱 솔루션 천천히 하 고 거품 형성 방지. 회전 하는 플랫폼에 흔들어 30 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 품 어.
    참고: fibrinogen 솔루션의 볼륨의 재고 농도 따라 다를 수 있습니다 있지만 각 총 볼륨 잘 부 화 하면서 170 µ L 해야한다.
  4. DdH2O 50 U/mL의 재고 솔루션에서 상업적으로 순화 된 트 롬 빈 분말을 용 해 하 여 트 롬 빈 솔루션을 준비 합니다. 20 mM HEPES 버퍼 (pH 7.4)에 직접 사용 하기 전에 5 U/mL 작업 솔루션을 희석.
  5. 외피의 30 분 후 동시에 트 롬 빈 솔루션 (5 U/mL)의 30 µ L에 추가 96 잘 접시에서 fibrinogen 솔루션 단계 2.3 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여에서. 트 롬 빈의 추가 즉시 응고 형성을 시작 합니다. 따라서, 거품 형성 되지 않도록 주의와 fibrinogen 솔루션의 중심에 직접 트 롬 빈을 추가 합니다.
    참고: 트 롬 빈 활동 사이 실험 조건, 트 롬 빈 많이 달라질 수 있습니다. 튼튼하게 혈전을 생성 하는 데 필요한 정확한 농도 경험적으로 결정 할 수 있습니다.
  6. 트 롬 빈 추가 직후 플레이트 리더에 시험관에 응고의 흡 광도 읽으십시오. 350에서 흡 광도 측정 10 분, 매 30-60 미 수행 실 온에서 전체 분석 결과의 과정을 통해 nm.
    참고: 일부 억제제 화합물 350 솔루션 흡 광도 변경할 수 있는 경우 탁도 405에서 측정 될 수 있다 nm nm.

3. 스캐닝 전자 현미경 검사 법

  1. 응고, 고정, 및 세척의 준비
    1. 깨끗 한 장소 시 집게를 사용 하 여 12 음 또는 24-잘 접시에 유리 원형 커버 슬라이드 (12mm).
    2. Fibrinogen 응고 형성 버퍼를 준비 합니다. 자세한 내용은 프로토콜 단계를 1.2를 참조 하십시오.
    3. 섬유 소 혈전 구조에 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제의 효과 평가 하려면 탁도 분석 결과 (2 단계)에 대 한 설명 된 대로 부 화에 대 한 지침을 따르십시오. 항상 fibrinogen Aβ와 억제제의 부재에서를 포함 하는 컨트롤 웰 스를 포함 합니다.
    4. 표지 슬라이드에 단계 3.1.3에서에서 fibrinogen 혼합물의 80 µ L 플라스틱 부드럽게 커버 슬라이드에 균등 하 게 분배 되도록 솔루션을 확산.
    5. 트 롬 빈 재고 (50 U/mL) 2.5 U/mL의 최종 농도 20 mM HEPES 버퍼링 염 분으로 묽 게 하십시오 고 fibrinogen 솔루션의 중심에 직접 혼합 하지 않고 20 µ L를 추가 합니다.
      참고: 필요한 경우 높은 트 롬 빈 작업 농도 (5 U/mL) 사용할 수 있습니다.
    6. 12-잘 접시 플라스틱 뚜껑으로 커버 하 고 30-60 분 동안 실내 온도에 그것을 두고.
    7. 응고 반응을 실행 하는 동안 탈수 및 고정 솔루션을 준비 합니다. 나트륨 cacodylate 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4)을 준비 합니다. 나트륨 cacodylate 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4) 2%도 솔루션을 작동 하 게 하려면 10%도 재고 솔루션을 희석. 얼음에 이러한 모든 솔루션을 유지. 1 주 이내 갓 희석된도 (2%)를 사용 해야 제대로 4 ° c.에는 냉장고에 저장 하는 경우
    8. 두 배 증류수 (80%, 50%, 20% 에탄올)에 절대 에탄올 (100%)을 희석. 이러한 에탄올 솔루션 및 얼음에 절대 에탄올 (100%)를 유지.
      주의: 나트륨 cacodylate와 글을 처리할 때 주의 사용 화학 후드에이 단계를 수행 하십시오.
    9. 30 분 후 부드럽게 씻어 얼음 나트륨 cacodylate 버퍼 (0.1 m M)와 혈전 두 번. 혈전 완전히 빠져들 것 같은 각 잘을 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다. 뚜껑 잘 플레이트 커버 하 고 실내 온도에 2 분 동안 그것을 둡니다. 2 분 후 1 mL 피 펫 또는 좁은 줄기 전송 피 펫을 사용 하 여 버퍼를 제거 부드럽게 합니다. 한 번 반복 합니다.
    10. 얼음도 (2%)와 혈전을 수정 합니다. 얼음에 잘 접시를 유지, 각 음에 2%도 약 2-3 mL를 추가 합니다. 혈전 완전히 빠져들 다는 것을 확인 하십시오. 커버 하 고 30 분 동안 얼음에 접시를 두고.
    11. 30 분 후 부드럽게 각 우물에서 고도 제거 하 고 혈전 (2 분, 두 번) 위에서 설명한 대로 나트륨 cacodylate 버퍼 (0.1 m M)를 사용 하 여 세척. 얼음에 잘 접시를 유지.
  2. 응고 및 한계점 건조의 직렬 탈수
    1. 5 분 동안 단계 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100%, 및 again100%)에서 준비 얼음 에탄올 세척의 등급된 시리즈에서 혈전을 탈수. 각 에탄올 시리즈는 혈전 잠긴 것을 확인 하는 2-3 mL를 추가 합니다. 커버 하 고 얼음에 품 어.
    2. 각 에탄올 단계 후 1 mL 피 펫 또는 일회용 피펫은 스포이드를 사용 하 여 에탄올 솔루션을 제거 합니다. 에탄올을 완전히 제거 하지 마십시오. 응고 표면 공기에 노출 되지 않습니다 있는지 확인 합니다.
      참고: 탈수 절대 에탄올 (100%)에 두 번 수행 되어야 한다.
    3. 최종 100% 에탄올에 빠져들 샘플을 유지 하면서 중요 한 포인트 드라이어 (일일) 전송. 일일 비용 챔버로 슬라이드를 전송 하기 위한 세탁기와 일일 비용 샘플 홀더 또는 커버 슬립 홀더를 사용 합니다. 각 슬라이드 사이 적어도 한 세탁기 배치.
    4. 일일 약 실에서 커버 슬라이드 밖으로가 고 탄소 테이프를 사용 하 여 sem의 스텁에 마운트.
  3. 스퍼터 코팅과 이미징
    1. 스퍼터 코팅 챔버를 sem의 스텁 함께 모든 샘플을 전송 합니다.
    2. 스퍼터 코트 20 미만 nm 금/팔라듐 또는 탄소, 진공 스퍼터 coater를 사용 하 여 같은 다른 전도성 물자의.
      참고: 우리는 18 사용 금/팔라듐 코팅의 nm. 스퍼터 코팅 45 수행한 s와 코팅 속도 4 Å / s. 스퍼터 코팅 샘플은 몇 주 동안 실내 온도에 건조 한 환경에 제대로 보관 하면 안정. SEM 분석은 언제 든 지 수행할 수 있습니다.
    3. 이미지 스캐닝 전자 현미경 4 SE2 검출기 장착에 kV.
      참고: 이 이미지에는 이미지 픽셀 크기 13 nm-31 nm에서 범위를 설정합니다.

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결과

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시험관에 응고 (탁도) 분석 결과, 효소 트 롬 빈 섬유 소 네트워크24의 형성의 결과로 fibrinogen 앞. 이 섬유 소 혈전 형성 증가 탁도 (그림 1), (그림 2, 그린) 독서 기간의 끝 전에 頭 打 ち 상태에 따른 해결책을 통과 하는 빛의 산란을 발생 합니다. fibrinogen Aβ42의 알을 품는, 솔루션의 탁도 감소, 약 절반의 최대 높이 도달 하는 곡선 (그림 2A, 블루) 혼자 fibrinogen의. 최근 간행물에서 Aβ 집계 차단제의 시리즈는 합성 되었고 복합 TDI-276014식별 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 평가. Aβ-fibrinogen ...

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토론

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여기에 설명 된 방법을 섬유 소 혈전 형성에서 체 외에서평가의 재현성 및 빠른 수단을 제공 합니다. 또한, 시스템의 단순은 섬유 소 혈전 형성 및 구조 상대적으로 곧장 앞으로 미치는 Aβ의 해석. 이 연구소의 이전 게시, 그것은 화합물 Aβ fibrinogen 상호 작용13,14을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 테스트를 이러한 분석을 사용할 수 있는 표시 했다. 이 두 가지 분석 실험을 사용 하 여, 합성된 화합물의 시리즈 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하는 기능에 대 한 분석 했다. 실제로,로 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제할 수 있는 모든 화합물 섬유 소 혈전 형성을 복원할 수도 있습니다 치료 잠재력 하는 히트 화합물의 수영장을 좁히는 병 탁도 분석 결과 사용할 수 있습니다.

문제 해결을 요구 하거나이 기술의 사용을 제한 하는...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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저자 마사 노리 가와사키가 즈 요 시 아소, 그리고 마이클 폴 리 트라이 기관 치료제 발견 연구소 (TDI), Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 합성에 대 한 뉴욕 및 그들의 귀중 한 제안에서 감사합니다. 저자는 또한 유용한 토론에 대 한 스 트 릭 랜드 연구소의 회원을 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 NIH 그랜트 NS104386, 질병의 약물 발견 재단, 그리고 로버트 슨 치료 개발 기금 랭에 대 한 NIH 부여 NS50537, 트라이 기관 치료제 디스커버리 연구소 Alzheimer 약물 발견 재단, Rudin 가족 재단과 S.S.의 존 A. 에르난데스

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
피브리오겐, 플라스미노겐 고갈, 플라즈마EMD Millipore341578수분 노출을 피하기 위해 뚜껑 파라필름을 감싸서 보관
베타-아밀로이드(1-42), 인간AnaspecAS-20276
트롬빈Sigma-AldrichT7009
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, 99%Sigma-Aldrich105228
디메틸설폭사이드(DMSO), 멸균 여과Sigma-AldrichD2438
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Scientific23225
Tris BaseFischer ScientificBP152
HEPESFischer ScientificBP310
NaClFischer ScientificS271
CaCl2Fischer ScientificC70
필터 주사기, 0.2µ M, 25mmPall4612
Millex 멸균 주사기 필터, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.MilliporeSLVV033RS
Solid 96 웰 플레이트, 높은 바인딩 인증 플랫 바텀,Fischer Scientific, 21377203
Spectramax Plus384Molecular Devices89212-396
Centrifuge, 5417R,Eppendorf5417R
, Branson 200 초음파 세척기,Fischer Scientific15-337-22
Lab RotatorThermo Scientific2314-1CEQ
커버 슬립 홀더용 예비 와셔Tousimis8766-01
좁은 줄기 피펫 - Sedi-PetElectron Microscopy Sciences (EMS)70967-13
CPD용 시료 홀더(커버 슬립 홀더)Tousimis8766
마운트 홀더 박스, 핀형전자 현미경 과학(EMS)76610
원형 유리 커버 슬라이드(12mm)Hampton ResearchHR3-277
10% 글루타르알데히드전자 현미경 과학(EMS)16120
에탄올Decon Labs11652
24 웰 플레이트Falcon3047
Na CacodylateElectron Microscopy Sciences (EMS)11652
SEM 스텁, 테이퍼 엔드 핀.전자 현미경 과학 (EMS)75192
PELCO 탭, 탄소 전도성 탭, 12mm ODTed Pella16084-1
Autosamdri-815 임계 점 건조기Tousimis
Denton Desk IV Coater with Gold / Palladium TargetDenton Vacuum
Leo 1550 FE-SEMCarl Zeiss
Smart SEM Software칼 자이스
플라즈마의 인간 이상 , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
  2. Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
  3. Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
  4. Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
  5. Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
  6. Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
  7. Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
  8. Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
  9. Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
  10. Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
  11. Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
  12. Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
  13. Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
  14. Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
  15. Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
  16. Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
  17. Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
  18. Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879(2012).
  19. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
  20. Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
  21. Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
  22. Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121(2018).
  23. Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
  24. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
  25. Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).

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