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방법 논문

가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석

8.7K 조회수

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DOI:

10.3791/58478

⸱

2018년 10월 21일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

이 논문에서

요약

여기, 유체 전단 응력에서 내 피 세포의 문화 및 유전자 표정 분석에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 포함 된 동시에 주택 및 제어 환경에 양이 많은 PCR에 대 한 참조 외 인 RNA 사용 하 여 여러 흐름 챔버 모니터링에 대 한 물리적 배열이입니다.

초록

우리는 여러 모니터링된 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용 하 여 지속적인 층 흐름에 따라 내 피 세포에서 유전자 발현의 분석에 대 한 워크플로 설명 합니다. 내 피 세포는 혈관의 내벽 세포를 형성 하 고 만성 혈 라는 전단 응력 마찰력에 노출 되는. 생리 적 조건, 내 피 세포 기능 다양 한 전단 응력 조건 존재. 따라서, 생체 외에서 모델에 전단 응력 조건의 응용 프로그램 내 피 응답 비보에 큰 통찰력을 제공할 수 있습니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버 레인 외. 이전 출판 9 는 존재 및 지속적인 (비 타악기) 층 흐름의 부재에 내 피 유전자 규칙을 공부에 적응. 여기에 제시로 층 류 흐름에 대 한 설정에 있는 주요 적응 포함 집 동시 흐름 회로, 유량에서의 모니터링에 큰, 전용 환경 실시간, 고는 외 인 RNA에 대 한 참조는 정규화의 포함 양이 많은 실시간 PCR 데이터입니다. 전단 응력의 응용 프로그램과 함께 여러 치료/조건을 평가 하기 위해 여러 흐름 회로 및 펌프 사용 됩니다 동시에 같은 온수 및 humidified 인큐베이터 내에서. 각 흐름 회로의 유량에 지속적으로 측정 하는 실험을 통해 전단 응력 조건 표준화 실시간. 이러한 실험 여러 조건 때문에, 우리는 또한 RNA 추출 및 첫번째 물가 cDNA 합성 효율성의 정규화에 대 한 RNA 추출 시 아군에 있는 외 인 참조 RNA를 사용 합니다. 이 단계 샘플 사이 가변성을 최소화합니다. 이 전략은 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용 하 여 전단 응력 실험 유전자 표정 분석에 대 한 우리의 파이프라인 고용 하지만 외 인 등이 전략의 부분 참조 RNA 스파이크, 쉽게 및 비용 효율적으로 사용할 수 다른 응용 프로그램입니다.

서론

혈관 내 피 세포는 높은 종의 닫히는 심장 혈관 시스템에 혈관의 내벽 세포를 형성합니다. 그들은 혈액과 조직 사이의 인터페이스를 형성 하 고 luminal 특징으로하 고 abluminal 표면. Endothelium 혈액 흐름, 영양소 밀매, 내성 및 새로운 혈액 혈관1의 성장을 조절 하는 다양 한 활동과 적응 시스템입니다. 본문에 내 피 세포는 순환, 전단 응력2의 마찰력에 노출 되는 환경에서 일반적으로 존재 한다. 전단 응력은 내 피 세포 유전자 식3의 중요 한 레 귤 레이 터 그리고 내 피 세포가 주어진된 범위2,4내의 전단 응력을 유지 하려고. 내 피 세포 신생 조직 관류를 향상 시킬 수 있는 전단 응력5 의 부재에 패턴을 보여 줍니다. 방해 흐름 및 변경 된 전단 응력의 지역 패턴 자극적인 유전자6 의 표현과 롬7,8의 개발에 관련이 있습니다. 따라서, 전단 응력을 포함 하는 모델 내 피 유전자 규칙 이해의 주요 구성 요소입니다.

전단 응력에서 혈관 내 피 세포에서 유전자 규칙을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 이 시스템 비 타악기 흐름을 사용 하 고 그 모델 조건 동맥 내 피 세포에 대 한 유체 전단 응력 수준 및 산소 농도 모방. 이 프로토콜 RNA 간섭 (RNAi), 전단 응력에 의해 분석 전에 exogenous 참조 RNA의 스파이크에 대 한 병렬 플레이트 흐름 장치 및 방법을 사용 하 여 응용 프로그램에 대 한 설정을 사용 하 여 유전자 최저에 대 한 방법의 세부 사항을 포함 역전사 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량). 이 파이프라인 존재 및 층 류 전단 응력의 부재에 내 피 세포에서 유전자 규칙을 공부 하 고 사용 하 고 레인 외 에 의해 설명 된 병렬 플레이트 흐름 장치의 적응을 포함 9.이 특정 설정 전단 응력 조건의 직접 비교 뿐만 아니라 RNA 분석의 정상화를 허용 하는 여러 실험 조건의 동시 평가 촉진 하도록 설계 되었습니다. 제어 습도 대형 온수 장치는 여러 별도 흐름 챔버와 펌프 유량 실시간으로 각 흐름 챔버 어셈블리에 대 한 감시와 함께 동시에 실행 되는 것을 허용 하도록 이용 된다. 이 설정의 응용 프로그램은 유전자 최저 층 류/전단 응력의 설정에서 RNAi를 사용 하 여 사용 하지만이 프로토콜의 RNA 식의 어떤 평가에 적용할 수 있습니다.

내 피 세포에 대 한 전단 응력의 응용 프로그램에 일반적인 접근 등 미세 시스템10, 콘 판 점도 계11, 병렬 플레이트 흐름 챔버12. 다양 한 제조 업체에서 미세 시스템 mechanobiology 및 mechanotransduction 여러 셀 조직 형식 및 생물 자극의 다양 한 공부에 도움이 되었습니다. 내 피 세포에 대 한 그들은 고립으로 내 피 세포의 상호 작용 및 면역 또는 종양 세포10의 인신 매매에 내 피 세포를 공부 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 시스템은 셀9의 많은 수의 복구를 위해 보다 적게 적당 하다. 콘 판 점도 계 및 병렬 플레이트 흐름 챔버 confluent monolayers12셀의 많은 수의 복구를 허용 한다. 이러한 시스템은 전단 세력 및 패턴12의 범위를 생성할 수 있습니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버 어셈블리9 장점이 그 실시간 이미징 시간 언제 든 지 세포 형태를 평가 하 유리 창을 통해 수행할 수 있습니다. 또한, perfusate는 무 균 조건 하에서 수집할 수 있습니다. 여기에 제시 된 시스템에 대 한 흐름 또한 모니터링할 수 있습니다 실시간으로 챔버 사이 전단 조건의 유지 보수를 용이 하 게 멀티 챔버 설정.

대표적인 실험에 대 한 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), macrovascular 내 피 세포 종류를 나타내는 데 사용 됩니다, 그리고 우리가 사용 하는 전단 응력 조건 (1 Pa) 동맥 조건 반영 (0.1-0.7 Pa). 그러나, 다른 내 피 세포 유형,이 프로토콜을 사용할 수 있습니다 그리고 전단 응력 조건 실험 질문에 따라 조정 될 수 있다. 예를 들어 정 맥 순환 모델 조건에서 인간의 내 피 세포의 전단 응력 (1-6 Pa)의 낮은 수준이 필요로 및 microvascular 순환 모델 연구의 0.4-전단 스트레스 수준을 활용 1.2 Pa13 , 14. 또한, 전단 응력도 같은 혈관6내 내 피 세포 사이 다를 수 있습니다. 현재 설정에서 단일 모니터링 시스템은 사용 되는 동시에 4 개의 별도 흐름 루프를 모니터링할 수 있습니다. 더 많은 흐름 루프를 필요로 하는 연구소에 대 한 추가 모니터링 시스템에 대 한 전용된 환경에서 공간이입니다.

실시간 정량 Pcr는 전단 응력의 설정에서 유전자 발현의 절대 정량에 사용 됩니다. 대상 유전자의 상대적 표현은 자주 조건에서 RNA 식을 비교 하는 데 사용 됩니다. 일부 RNA 종 매우 낮은 수량에 존재 하거나 결 석, 따라서 상대 측정을 복잡 하 게 될 수 있습니다. 예를 들어 내 피 세포에서 긴 noncoding RNAs 셀5당 상대적으로 낮은 복사 번호에 강력한 효과 발휘 수 있습니다. 또한, 뇌관 효율에 차이가 발생할 수 있습니다 부정확 한 해석에서 델타-델타 주기 임계값 (Ct) 메서드를 이용 하 여 데이터를 분석 하. 이 문제를 해결 하기 위해 우리는 알려진된 양의 플라스 미드 DNA 사용 하 여 표준 곡선을 생성 하 여 절대 정량을 수행 합니다. 또한, 상호 보완적인 DNA (cDNA) 합성 비효율적인 프로세스 이며 cDNA 효율에서 차이 RNA 식 및 샘플15조건 사이의 차이 대 한 계정 수 있습니다. 전단 응력 transfection 시 약의 응용 세포 증식, apoptosis, 및 생존 능력에 영향을 하거나 RNA 격리 또는 cDNA 합성을 방해할 수 있는 구성 요소를 추가할 수 있습니다. RNA 격리 및 cDNA 합성에서 바이어스의 가능성에 대 한 계정, 우리는 스파이크에서 RNA 제어 실험실에서 합성, RNA 추출 시 추가 및 각 cDNA 합성을 통해 실시간 정량 측정 사용 합니다. 이로써 조정 뿐만 아니라 기술 차이 RNA 추출 및 cDNA 합성에서 하지만 또한 셀 수가 알려진 경우 셀 당 절대 수량 계산을 수 있습니다.

이 시스템은 유사성을 유지 하거나 조건 간의 기술적인 차이 대 한 계정에 추가 단계를 사용 합니다. 우리는 특히 여러 물리적 설정 및 실험적인 다양성으로 이어질 수 있는 실험 조건을 포함 하는 이러한 실험의 복잡 한 특성으로 인해 이러한 단계를 강조.

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프로토콜

1입니다. 외 인 참조 RNA의 준비

참고: 종 또는 관심의 모델 exogenous 참조 존재 하지 않는 RNA를 선택 합니다. 포유류의 시스템에 대 한 반딧불 luciferase RNA를 사용할 수 있습니다.

  1. 외 인 참조 RNA 플라스 미드의 선형화
    1. 이전 예상된 RNA 추출 exogenous 참조 RNA 적어도 48 h를 준비 합니다. 선택한 exogenous 참조의 RNA, 반딧불 luciferase cDNA 클론 같은 플라스 미드 벡터 생체 외에서 전사에 대 한 적절 한 cDNA 클론을 제조 하거나 ( 재료의 표참조).
    2. 전체 길이 플라스 미드의 1 µ g의 제한 효소 (RE) 소화를 수행 (반딧불 luciferase 플라스 미드는 pSP-뤽 + 4100 bp는) 단일-커터를 사용 하 여 (XhoI) 다시 1.5 mL microfuge 관에. 단일 커터는 다시 선택 (플라스 미드 컷만 1 x) 외 인 참조 RNA 순서는 5' 오버행 또는 무뚝뚝한 끝의 3' 끝에. 일반적인 준비에 대 한 충분 한 RNA 농도 실험 또는 1 개의 프로젝트의 한 세트를 완료 하려면 수량을 생성 하는 동시에 7 개의 플라스 미드 선형화 반응 (단계 1.1.4-1.1.7)을 수행 합니다.
      1. 분 광 광도 법 또는 spectrofluorometry를 사용 하 여 플라스 미드 농도 측정 합니다.
      2. 각 관에서 다시 혼합물 준비: XhoI 의 4 µ L을 추가 (20, 000 단위/mL), 다시 버퍼, 플라스 미드 (1 µ g), 그리고 충분 한 H2O 80 µ L의 총 솔루션에 도달의 x µL의 8 µ L.
      3. 2 h 37 ° c.에 대 한 재 혼합물을 품 어 제조 업체의 프로토콜에 따라 다시를 사용 하 여 수정 증가 스타 활동 또는 표적 DNA의 일반적인 분열에 발생할 수 있습니다. 열 비활성화 65 ° c.에 20 분에 대 한 반응 혼합물
      4. 각 관 강 수 에탄올으로 다시 다이제스트를 종료 합니다. 다시 믹스에 직접 0.5 M EDTA pH 8.0, 8 µ L 3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2의 그리고 100% 에탄올의 184 µ L의 4 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 30 분 동안-20 ° C에 혼합물을 동결.
      5. 16,100 x g의 상대 원심력 (RCF)에서 20 분 동안 4 ° C에 혼합물을 아래로 회전 합니다.
      6. 펠 릿을 건드리지 않고 상쾌한 좋은 팁을 제거 합니다. 5 분 동안 펠 릿 건조 하 고 5 배-10 배 아래로 pipetting으로 H2O (37 ° C로 예 열) 6 µ L에서 resuspend.
      7. 1 kb + 사다리, supercoiled 사다리 및 잘라내기 및 포경된 플라스 미드 luciferase 플라스 미드의 선형화 ethidium 평범한 사람 (EtBr)를 포함 하는 2 %agarose 젤에 소화 제품을 실행 하 여 확인 합니다. 젤을 검사 하 고 컷된 플라스 미드에 대 한 레인은 단일 밴드 (포경된 플라스 미드 3 밴드; 해야한다 ~ 4 kb 경우 체 외에 녹음을 진행 그림 1)입니다.
        주의: EtBr은 발암 성. 화학 증기 두건에서 작동 합니다.
  2. 에서 외 인 참조 RNA 플라스 미드의 생체 외 녹음
    1. 소화 플라스 미드 제품의 각 관에 생체 외 녹음 방송 생체 외에서 전송 메서드를 사용 하 여 수행 ( 재료의 표참조). 제조업체의 지침에 따라 하 고 적절 한 살 균 소 RNA 중 합 효소를 사용 합니다. CDNA 합성의 방법 많은 꼬리, 또는 다른 응용 프로그램에서는 많은 꼬리, 선택 많은 꼬리 또한 포함 한다 생체 외에서 전사의 방법 ( 재료의 표참조).
    2. 모든 결합 하 여 체 외에서 정화 이전 단일 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 제품을 복사할.
  3. Purif 생체 외에서 녹음 방송 반응에서 RNA의 ication
    1. 생체 외에서 복사할 정화는 생체 외에서 전사 청소 제품 키트 ( 재료의 표참조). 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오.
    2. 260에서 흡 광도 측정 하 여 RNA 농도 평가 nm 분 광 광도 법을 사용 하 여.
      참고: RNA 농도 맥주 Lambert 법률을 사용 하 여 계산 됩니다. 이 따르면 핵 산의 흡 광도 (는 260에서 강하게 빛을 흡수 nm) 농도에 비례 이다. 1.0의 흡 광도 단일 가닥 RNA의 40 µ g/mL와 같습니다.
  4. Aliquoting PCR로 주식 RNA 실험 사용 튜브
    1. RNA 농도 1 µ g / µ L를 확인 하십시오.
      1. RNA 농도 > 1 µ g / µ L 인 경우에, 1 µ g의 재고 희석 / µ L. Aliquot 1 µ L PCR로 튜브-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
      2. RNA 농도 < 1 µ g / µ L 인 경우에, 제조 업체의 프로토콜에 따라 추가 강수량 5 M 염화 아세테이트 (키트에 제공)을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 경우 RNA 농도 여전히 < 1 µ g / µ L, PCR 튜브에 aliquoting 1 µ L 진행.

2. 슬라이드 코팅

참고: 단계 2.1-2.10 예상된 셀 뿌리기 전에 24-48 h를 수행된 해야 합니다.

  1. 250 ° c.에 오븐을 예 열
  2. 각 유리 슬라이드 2 포장 멸 균 글러브를 사용 하 여 알루미늄 호 일로 x. 슬라이드의 화면을 직접 만지지 마십시오.
  3. 슬라이드 250 ° C에서 1 시간 동안 오븐에 구워 고 실내 온도에 냉각 슬라이드 수 있습니다.
    참고:이 단계는 어떤 오염도 파괴 하는 것이 중요 합니다.
  4. 슬라이드는 냉각 하는 동안 1 mg/ml 증류수와 fibronectin 재고 솔루션을 확인 하 고 분해를 37 ° C에서 30 분 동안 품 어. 100 µ L aliquots를 확인 합니다. 즉각적인 사용을 위해 aliquots를 따로 설정 하 고 차후 사용을 위해 나머지 aliquots를 동결.
  5. 에 올려 놓기 전에 유리 슬라이드는 biosafety 캐비닛 알루미늄 호 일의 외부 덮 음을 풀 다 2.6-2.7 스텝과 2.9 biosafety 내각에서 수행 합니다.
  6. 살 균 사각형 4 잘 셀 문화 접시에 유리 슬라이드를 놓습니다.
  7. 증류수와 fibronectin 재고 솔루션 1: 100 희석. 코트 1 mL 희석된 fibronectin, 드롭 들러, 한 피 펫을 사용 하 여 각 슬라이드. 전체 슬라이드 덮여 있는지 확인 합니다.
  8. 24-48 h에 대 한 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 슬라이드를 품 어.
  9. 부 화 후 4-잘 셀 문화 접시를 기울이기로 fibronectin 발음. 흡 인기와 직접 슬라이드를 만지지 마십시오.

3. 유리에 시드 셀 슬라이드

  1. 초기 통로 (통로 2-5)에 인간 내 피 세포를 계산 하 고 미디어 (1.0 x 106 셀/mL 미디어)의 1 mL와 함께 각 fibronectin 코팅 유리 슬라이드에 106 셀 x ~1.0 씨. 다른 치료 수행 되어야 하는 경우 세포 층 흐름의 예상된 응용 프로그램 전에 24 h 씨.
    참고:이 숫자 흐름의 24 h와 실험에 대 한 가이드로 사용 됩니다.
    1. 셀의 confluent 단층 세포 수확 및 RNA 추출 시 달성 하 시드 밀도 조정 합니다.
  2. 37 ° c.에 15 분 동안 슬라이드에 고착 하는 셀을 하자
  3. 슬라이드를 충당 하기 위해 셀 문화 접시의 각 우물에서 미디어의 3 mL를 추가 하 고 5% CO224 h에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어.

4. 작은 Interfering RNA (siRNA) Transfection

  1. SiRNA transfection 및 흐름 실험 유리 슬라이드에 세포의 준비
    1. 유리 슬라이드 준비와 흐름 실험에 대 한 코팅에 대 한 단계 2 (슬라이드 코팅) 및 3 (유리 슬라이드에 시드 셀)에서 프로토콜을 따릅니다.
    2. 씨앗은 siRNA 치료 (48 h 층 흐름의 신청 이전) 전에 24 h 세포.
    3. 다음 날 합류 85%-95%를 달성 하기 위해 슬라이드 당 750000 ~ 1 x 106 세포에 항생제-무료 미디어에서 씨앗 인간의 내 피 세포.
      참고: HUVEC는이 프로토콜에 사용 됩니다.
  2. (슬라이드) 당 siRNA 지질 기초를 둔 transfection 시 약 단지의 준비
    1. 디자인 사용자 정의 siRNAs 또는 들어찬 siRNAs의 원하는 유전자에 대 한 주문.
      참고: 다음 단계를 수행 하는 biosafety 내각.
    2. 감소 된 혈 청 매체의 414 µ L에 siRNA (20 µ M 주식)의 6 µ L를 추가 ( 재료의 표참조) pipetting으로 부드럽게 섞는다.
    3. 부드럽게 혼합된 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 49.5 µ L를 희석 ( 재료의 표참조)의 감소 된 혈 청 매체 130.5 µ L에서.
    4. 부드럽게 혼합 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
    5. 희석된 siRNAs와 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 결합 하 고, 부드럽게 섞어 실 온에서 15 분 동안 품 어. 지질에 기초를 둔 transfection 시 약 단지의 혼란을 피하기 위해에 부드럽게 섞는다.
      참고: 솔루션 흐린 단지 형태로 나타날 수 있습니다.
    6. 단지를 형성 하는 동안 성장 매체를 제거 하 고 세척 셀 1 감소 된 혈 청 매체와 x.
    7. 각 슬라이드에 감소 된 혈 청 매체의 2.4 mL를 추가 합니다.
    8. 각 접시에 부드럽게 혼합된 siRNA 지질 기초를 둔 transfection 시 약 단지의 600 µ L을 추가 하 고 혼합 하 고 앞뒤 판 바위. SiRNA의 최종 농도 한지 40 nM. 슬라이드 완전히 덮여 있는지 확인 합니다.
    9. 37 ° C 4 h에서 세포를 품 어.
    10. Transfection 혼합물을 제거 하지 않고 소 태아 혈 청 (FBS)의 정상적인 농도 x 3를 포함 하는 항생제 무료 내 피 세포 성장 매체의 1 mL를 추가 합니다.
    11. 사용할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 세포를 품 어.

5.9 원하는 전단 응력 따라 유량의 계산

  1. 다음 방정식에 따라 원하는 전단 응력에 따라 유량을 계산:
    figure-protocol-1
    여기,
    Q ; mL/min 흐름 속도
    Τ 는 다 인/c m2 에 원하는 전단 응력 (1 Pa = 10 다 인/cm2);
    w 는 cm; 병렬-플레이트 흐름 챔버의 폭
    h 는 cm; 병렬-플레이트 흐름 챔버의 높이
    µ cP (g/cm·s)에서 미디어의 점도입니다.
    참고: 일반적인 층 류 전단 응력 실험 (비-타악기)이 워크플로의 τ 에서 실시 하는 = 1 Pa (10 다 인/cm2). µ 콘 판 점도 계 등 점도 계를 사용 하 여 측정 될 수 있다 그리고 혈 청 및 추가 dextran9를 포함 하 여 매체의 내용에 따라 다를 수 있습니다.
  2. 특정 τ (전단 응력)을 달성, 유량 및 점도 조정 합니다. 높은 흐름 속도, 부착 셀 슬라이드에서 분리 수 있습니다. 전형적인 흐름 챔버와 함께 샘플 흐름 율은 표 1에 표시 됩니다.

6. 시스템 및 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버 (그림 2) 모니터링을 위한 전용된 환경 설정

  1. 대형 온수 단위/인큐베이터를 사용 하 여 여러 선반, 내부 전기 액세스 및 유리 문-해변 (조정 가능한 CO2 내장 환경)과 열으로-동시에 여러 개의 흐름 챔버를 집에 있는 실험 전단 응력 및 두 개 이상의 치료 또는 출력 (즉, DNA, RNA 및 단백질) 사이의 직접 비교를 요구 한다.
    참고: 해변 환경의 자주 없이 유량을 포함 한 교류 회로의 자주 모니터링에 대 한 허용 됩니다.
  2. 적절 한 CO2 실험에 사용할 수 있고 CO2 모니터 기능을 확인 합니다. 습도 공기 있을 것입니다 그런 물 쟁반 가득 적절 하 게 확인 하십시오.

7. 병렬 플레이트 흐름 장치 설정

참고: 병렬 플레이트의 제조에 대 한 참조 하십시오 레인 외. 9.

  1. 오토 클레이 브는 흐름 챔버 접시, 저수지, dampener, 튜빙, 그리고 손잡이 표 2에 표시 된 대로 각 병렬 플레이트 흐름 챔버 설정에 대 한.
  2. 흐름 루프 어셈블리 (그림 3)의 설정 했다.
    1. 캐비닛 생물 안전에 메 마른 수건을 놓습니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버, 생물 안전 캐비닛에 없이 먼저 흐름 루프 시스템을 조립.
    2. 저수지에 대 한 튜브 어셈블리를 연결:
      1. 한 구멍 및 흐름 저수지의 모자에 있는 다른 두 구멍에 두 개의 #14 부드러운 튜브에 #14 하드 튜브를 삽입 합니다. 부드러운 튜브 중 하나 유출 튜브로 저수지의 바닥을만 지 확인 합니다.
      2. 장소는 1/16"#14 하드의 끝에 남성 루어 튜브 및 공기 통풍구로 살 균 필터를 연결.
      3. 장소는 1/16"#14 부드러운 유입 의 끝에 여성 루어 튜브, 저수지에서 오는 고 4 방향 자 지 첨부.
        참고: 유전자 표정 분석 또는 다른 연구 어디 perfusates 하지 않아도 수집, 2-웨이 stopcocks이 프로토콜에서 4 방향 stopcocks 대신 사용할 수 있습니다.
      4. 장소는 1/16"#14 부드러운 유출 튜브의 끝에 저수지에서 오는 남성 루어.
    3. 저수지 유출 배관 펌프 배관 연결: 장소 1/16"#13 하드 튜브 (펌프 배관)의 각 끝에 여성 루어. 연결 1/16"#13 하드 튜브에 저수지에서 #14 부드러운 유출 튜브를 연결 함께 남성과 여성의 손잡이.
    4. 'Dampener 다리' 배관 펌프 배관 연결: 장소 1/8"남성 루어와 1/8" #16 부드러운 튜브의 각 끝에 여성 루어. 연결 1/16"와 1/8" (유출의 끝 펌프 튜브) #13 하드 튜브의 여성 Luer #16 부드러운 튜브의 남성 루어.
    5. 흐름 dampener에 대 한 튜브를 조립: 장소는 3/16"#25 부드러운 튜브의 한쪽 끝에 남성 Luer 흐름 dampener의 다른 측면에 대 한 반복이 고. #25 부드러운 튜브의 무료 끝 흐름 dampener의 각 측면에 연결 합니다.
    6. 흐름 dampener 대 한 dampener 다리 튜브 배관 연결: 'dampener 다리' 사용 하 여 1/8"의 #16 부드러운 튜브와 흐름 dampener에서 #25 부드러운 튜브를 연결 #16 'dampener 다리' 측면에서 고 이미 배치 3/16" 여성 Luer 남성 루어 #25 부드러운 dampener 튜브 측.
    7. '다리 실' 튜브 조립:
      1. 장소는 1/8"여성 루어와 1/8" #16 부드러운 튜브 ('다리 실' 튜브)의 각 끝에 남성 루어.
      2. 연결 1/8"3/16" 와 '챔버 다리'의 여성 Luer 흐름 dampener의 자유로운 끝에서 #25 부드러운 튜브에 남성 루어.
      3. 1/8"에서 '챔버 다리' 튜브의 남성 루어 (무료 끝) 4 방향 자 지를 놓습니다.
    8. (에서 단계 7.2.2.3) 저수지 유입 부드러운 튜브에서 4 방향 자 지에 '다리 실' 무료 끝에서 4 방향 자 지를 연결 합니다. stopcocks을 닫습니다.
    9. 저수지와 dampener에 미디어를 추가 합니다. 스트레스를 전단에 48 h 노출에 대 한 미디어의 35 mL 저수지는 dampener 25 mL를 추가 합니다. 기간 흐름 실험 및 시드 셀의 수에 따라 미디어의 볼륨을 조정 합니다.
    10. 해변에서 펌프 조립된 흐름 루프 시스템을가지고. #13 하드 튜브 (펌프 튜브) 펌프 헤드에 배치 하 고 그것을 확보. stopcocks을 엽니다.
    11. 펌프를 켜고 천천히 펌프 속도 증가. 루프 시스템을 통해 순환 하는 미디어를 하자. 어떤 누설 또는 막힘 (예, 압력 형성)에 대 한 확인 하십시오. 미디어 다시 저수지에 흐르는 지 확인 합니다.
  3. 흐름 챔버 어셈블리의 설정
    1. 장소는 1/8"#16 소프트의 한쪽 끝에 여성 루어 튜브와 4 방향 자 지를 첨부. 튜브의 자유 끝 (유입 측)의 맨 위에 접시의 오른쪽 측면에 연결 하십시오.
    2. 장소는 1/8"#16 소프트의 한쪽 끝에 남성 루어 튜브와 4 방향 자 지를 첨부. 상단 플레이트 (유출 측)의 왼쪽에 튜브의 무료 끝을 연결 합니다.
    3. 장소는 1/8"남성 루어와 1/8" #16 부드러운 튜브의 각 끝에 여성 루어 (거품 트랩 튜브). 거품 트랩을 통해 1/8"에 튜브를 부착 남성 루어. 4 방향 자 지는 튜브를 통해 1/8"의 다른 쪽 끝을 연결 여성 루어.
    4. 멸 균 핀셋을 사용 하 여 전송 셀 시드 유리 슬라이드 4 잘 세포 배양 접시에서 오목 하단 접시에. 유리 슬라이드의 셀 시드 측 직면 하 고 있는지 확인 합니다.
    5. 10 mL 주사기를 사용 하 여 라인 내에 붉은 가스 켓 접시 주위 바닥판에 따뜻한 미디어의 10 mL를 추가 합니다. 미디어를 슬라이드를 통해 흐름 및 셀을 커버 수 있습니다. 슬라이드에 직접 미디어를 추가 하지 마십시오.
    6. 부드럽게 다른 한쪽에서 정렬 바닥판에의 맨 위에 접시를 놓습니다. 공기 방울의 소개를 하지 마십시오. 함께 밀접 하 게 번호판 나사.
    7. 접시의 오른쪽 (유입)에 자 지를 열고 부드럽게 20 mL 30 mL 주사기를 사용 하 여 따뜻한 미디어의 홍 여 거품 트랩에서 기포를 제거 합니다. 접시의 왼쪽 (유출)에 자 지를 폐쇄 하 고 미디어 거품 트랩 자 지 (오픈)에 흐르는 다는 것을 확인 하십시오. 얼굴이 빨 개 미디어를 삭제 합니다.
    8. 거품 트랩에 자 지를 닫고 챔버의 왼쪽 (유출)에 자 지를 엽니다. 챔버의 왼쪽 (유출) 45 ° 각도를 상승 시킵니다 고 부드럽게 약 실에서 공기 방울을 제거 하는 챔버의 오른쪽 (유입)에서 30 mL 주사기를 사용 하 여 따뜻한 미디어의 20 mL를 플러시. 거품은 창을 통해 구상 될 수 있다. 얼굴이 빨 개 미디어를 삭제 합니다.
    9. 챔버 및 캡의 양쪽에 stopcocks를 닫습니다. 현미경으로 세포를 검사 합니다.
    10. 이전 조립된 루프 시스템과 해변 상공을 전송 합니다.
    11. 천천히 펌프 속도 감소 하 고 펌프를 일시 중지. 누설을 방지 하기 위해 흐름 루프 시스템에 stopcocks을 닫습니다.
    12. 챔버를 연결 하 고 시스템 함께 통해 stopcocks 루프. 모든 stopcocks을 엽니다.
    13. 천천히 펌프 속도 증가 하 고 누설 또는 방해에 대 한 설정 검사. 미디어 한 방향으로 순환 하 고 저수지에 반환 합니다 확인 하십시오.
    14. 챔버의 유입 쪽에 위치한 '챔버 다리' 배관에 유량 센서를 놓습니다. 센서의 흐름의 방향에 제대로 중심은 다는 것을 확인 하십시오.
    15. 원하는 전단 응력에 따라 이전에 계산 된 흐름 속도 얻기 위해 펌프 속도 조정 합니다.
      참고: 흐름 속도 높이 각 실의 폭 뿐만 아니라 미디어의 점도 따라 달라질 수 있습니다.
    16. CO2 탱크 해변 안에 물 쟁반을 달성 5% CO2 를 켭니다.

8. 셀 및 흐름 상공에서 RNA의 추출의 수확

  1. 흐름의 원하는 기간 완료 되 면, 천천히 연동 펌프 속도 0 거절 하 고 전원을 끄십시오. 신속 하 게 모든 오픈 stopcocks를 닫고 챔버와 각 끝에 자 지와 연결 된 튜브를 제거 합니다.
  2. 깨끗 한 벤치탑에 챔버를 부드럽게 상단 플레이트를 제거 하는 모든 나사를 나사. 바늘 코의 족집게를 사용 하 여 바닥판에서 유리 슬라이드를 제거 하 고 100 m m 직경 조직 문화 접시에 놓습니다.
  3. 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)-/-의 10 mL와 함께 슬라이드를 세척 하 고 현미경으로 세포 부착 및 흐름의 방향에서 정렬 셀을 확인.
  4. 접시에서 PBS를 발음 하 고 깨끗 한 100 m m 직경 접시에 슬라이드를 전송. RNA 추출에서 350 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가 키트 ( 재료의 표참조), 1/100의 베타-mercaptoethanol, 슬라이드에 포함 된.
    주의: 화학 증기 두건에서 베타-mercaptoethanol을 추가 합니다.
  5. 폴 리 에틸렌 bladed 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 슬라이드 셀을 다쳤어요. 아래쪽에, 수영장에 액체를 사용 하면 조직 문화 접시를 기울기 고 집게와 유리 슬라이드를 제거 합니다. 세포 lysate 1.5 mL 튜브에 플라스틱 하 고 얼음에 그것을 유지.
  6. 희석 주식 exogenous 참조 RNA (luciferase RNA) 샘플에 추가 하기 전에 직렬 희석을 통해 µ 0.0025 ng/L입니다. 예를 들어 재고 농도 1 µ g / µ L 인 경우에, 1/400, 000의 희석 하는 데 필요한 달성 0.0025 ng / µ L. 추가 10 µ L의 luciferase RNA 세포 lysate 다운스트림 RNA 분리 및 분석의 각 샘플을 희석.
  7. 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 프로토콜 진행 합니다 또는-80 ° c까지 추출 진행 수 lysate 동결.

9. RNA 추출 및 cDNA 합성의 효율의 계산

참고: 이론적 수율과 실험 수익률을 비교 하 여 실시간 정량 Pcr 후 luciferase 효율을 계산 합니다.

  1. Luciferase RNA에 대 한 이론적인 항복을 결정 합니다.
    1. 샘플 당 추가 luciferase 복사본의 총 금액을 결정 합니다. (0.025 ng/샘플 추가 이전 RNA 추출 샘플 당 luciferase RNA의 107 복사본 x 2.73 =.)
    2. 330 g/mol의 뉴클레오티드 당 평균 분자 질량을 사용 하 여 반딧불 luciferase RNA, 1652 뉴클레오티드의 길이 곱하여 luciferase RNA의 분자 질량을 계산 합니다.
    3. Luciferase 추가 RNA의 금액을 분할 (0.025 ng) 어 금 니 수량을 분자 질량에 의해 RNA 추출 전에 각 샘플에 대 한. 다음, 샘플 당 추가 복사본을 아보가드로 수에 의해 그을 곱하면 됩니다.
    4. 방정식을 사용 하 여 각 실시간 정량 Pcr 반응에 대 한 luciferase 복사본에 대 한 이론적 수율을 계산:
      figure-protocol-2
  2. 실시간 정량에 대 한 표준 곡선을 생성 하기 위해 luciferase 플라스 미드를 사용 하 여 각 실시간 정량 Pcr 반응에 대 한 luciferase 복사본에 대 한 실험 수익률을 계산 합니다.
  3. 계산 하는 수식을 사용 하 여 luciferase 효율 (%):
    figure-protocol-3

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결과

제한 효소를 사용 하 여 luciferase 플라스 미드의 성공적인 선형화 실행 소화 제품 agarose 젤 (그림 1)에 의해 확인 되었다. DNA 사다리를 사용 하 여 선형화 제품의 크기 확인 및 포경된 플라스 미드 비교해보면.

우리 차선 외 에서 병렬 플레이트 흐름 챔버 설정 적응 9 전단 응력과 여러 조건/치료 또는 여러 전단 응력 조건이 필요로 하는 실험에 대 한. 우리는 전용된 환경, 그 수 있습니다 여러 집, 해변를 사용 하 여 모든 유량 (그림 2)를 모니터링 해야 하는 흐름을 완벽 하 게 조립 회로. 유량 모니터링 그냥 업스트림 병렬 플레이트 어셈블리 (그림 <...

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토론

전단 응력은 정상 유전자 식2,5에 영향을 미치는 하 여 내 피 기능 일부를 변조 하는 생리 조건. 다양 한 전단 응력 조건에서 유전자 규칙의 모델은 내 피 기능에 대 한 더 큰 이해에 기여할 것입니다. 이 실용적인 워크플로 병렬 플레이트 흐름 챔버 레인 외. 에서 적응을 사용 하 여 흐름 회로 포함 층 류, 비 타악기 흐름 9 고 나타냅니다. 전반적인 설정 여러 흐름 챔버를 요구 하 고이 설정에서 실험적인 변화를 최소화 하는 실험을 촉진 하도록 설계 되었습니다.

교류 회로 어셈블리가 워크플로의 주요 구성 요소 이며 레인 외. 에서 적응 9. 실험 시스템에 차이 반영 하기 위해이 어셈블리 및 프로토콜의 몇 가지 각 색 되었다. 대형 온수 단위, 해변, 동시 작...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 CIHR 청소 142307 P.A.M. 의해 지원 되었다 H.S.J.M. 캐나다 연구소의 건강 연구 훈련 프로그램 재생 의학 화목에서의 받는 사람입니다. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K., 및 M.K.D.는 과학 기술에 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금을 받는 사람.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.05% Trypsin-EDTAgibco25300-062
10 mL 주사기BD302995
10 mm2 배양 접시Sarstedt83.3902
30 mL 주사기BD302832
4방향 스톱콕DiscofixD500
알루미늄 호일
BEACHDarwin Chambers CompanyMN: HO85, SN: 4947549
셀 스크레이퍼
CO2 MeterBioSphenix, Ltd.MN: P120, SN: 0342
CO2 센서BioSphenix, Ltd.MN: C700, SN: 52852
증류수gibco15230-170
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) -/-gibco14190-144
내피 세포 성장 배지 2프로모션 셀C-22011
내피 세포 성장 배지 2 보충제 믹스프로모션 셀C-39216
피브로넥틴(순수)Sigma-Aldrich11051407001
필터 (0.20 um)Sarstedt83.1826.001
유량 댐퍼 및 캡U of T 유리 송취 상점
유량계 : 400 시리즈 콘솔Transonic Scisense Inc.T402
유량계 : 400 시리즈 튜빙Transonic Scisense Inc.TS410
유량 저장소 및 캡U of T 유리 송풍 공장
유량 센서Transonic Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F 오븐Fisher ScientificFI-737F
J 천J 천
현미경 슬라이드(25 x 75 x 1mm)Fisherfinest12-544-4
종이 살균 파우치Cardinal Health92713
펌프(Masterflex L/S 이코노미 드라이브)Cole-Parmer7554-90
펌프 헤드 (Masterflex L/S Easy Load)Cole-Parmer7518-00
직사각형 4웰 디쉬Thermo Scientific267061
핀셋
NameCompany카탈로그 번호Comments
Tubing
Masterflex C-Flex L/S 25 소프트 튜빙Cole-Parmer06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 소프트 튜빙Cole-Parmer06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 소프트 튜빙Cole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 하드 튜빙Cole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 하드 튜빙Cole-Parmer06508-14
NameCompany카탈로그 번호Comments
Luer
3/16" 남성 LuerCole-Parmer45518-08#25 튜빙용
1/8" 남성 LuerCole-Parmer30800-24#16 튜빙
1/8" 여성 LuerCole-Parmer30800-08#16 튜빙
1/16" 남성 LuerCole-Parmer45518-00#14 튜빙
1/16" 여성 LuerCole-Parmer45508-00#14 튜빙
NameCompany카탈로그 번호코멘트
Knockdown 시약
Oligofectamine 시약Invitrogen12252-011
Opti-MEM I Reduced Serum Mediumgibco31985-070
Name< strong>Company카탈로그 번호Comments
In vitro transcription
Generuler 1kb+ DNA ladderThermo ScientificSM1331
MEGAclear KitAmbionAM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 전사 키트AmbionAM1340
pSP-luc +PromegaE4471
Supercoiled DNA LadderNew England BioLabs Inc.N0472S
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500
UltraPure 에티듐 브로마이드Invitrogen15585011
XhoI 제한 효소New England BioLabs Inc.R0146S
NameCompany카탈로그 번호Comments
RNA 추출
Beta-mercaptoethanolSigmaM3148-100mL
RNeasy 미니 키트Qiagen74104

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