방법 논문

실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석

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⸱

DOI:

10.3791/58487

⸱

2019년 1월 7일

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

이 논문에서

요약

우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 관절염, 유전 요인 및 다른 로드 regimens 영향 chondrocytes 제자리에서 의 취약점을 조사 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

초록

관절 연골의 항상성 주민 세포 (chondrocytes)의 생존 능력에 따라 달라 집니다. 불행 하 게도, 기계적 외상은 잠재적으로 공동의 돌이킬 수 없는 고장 및 관절염의 발병에 이르는 광범위 한 chondrocyte 죽음을 유도할 수 있다. 또한, chondrocyte 생존 능력의 유지 관리는 최적의 수술 결과 대 한 osteochondral 이식 절차에서 중요 하다. 우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 활 액 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 이 메서드는 다른 기계적 부하 regimens, 다른 환경 조건이 나 유전자 조작의 효과 뿐만 아니라 다른 단계에 짧은-장기 연골 변성의 조사 비교 연구에 사용할 수 있습니다. 원래의 관절 chondrocytes의 취약점입니다. 원고에 소개 하는 프로토콜의 목표 murine 활 액 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가입니다. 중요 한 것은,이 메서드는 네이티브 경계 조건 없이 완전히 그대로 연골에 테스트 수 있습니다. 또한, 그것은 vitally 스테인드 관절 chondrocytes의 실시간 시각화 및 제어 정적 및 영향 regimens 로드의 응용 프로그램에 의해 유도 된 세포 상해의 단일 이미지 기반 분석에 대 한 수 있습니다. 우리의 대표적인 결과 건강 한 연골 explants 세포 상해의 공간적 범위에 따라 달라 집니다 민감하게 부하 강도 및 충격 강도 보여줍니다. 우리의 방법은 쉽게 다른 기계적 부하 regimens, 다른 환경 조건이 나 관절 chondrocytes 제자리에 의 기계적인 취약점에 다른 유전자 조작의 효과 조사 하기 위해 적용할 수 있습니다.

서론

관절 연골 (AC)는 베어링 커버와 부드러운 공동 조음을 제공 하는 활 액 관절에서 뼈를 보호 하는 조직 로드. 조직의 항상성 chondrocytes, AC에 있는 유일한 셀 타입의 생존 능력에 따라 달라 집니다. 그러나, 극단적인 세력 (예를 들어, 폭포, 차량 사고 또는 스포츠 부상) 외상 또는 외상 후 관절 불안정성 때문에 연골의 노출 chondrocyte 죽음, 관절 (관절염)의 돌이킬 수 없는 고장에 지도 일으킬 수 있다 1. 또한, osteochondral 손상 된 연골에 로컬 결함을 복구 하는 것을 목표로 하는 절차를 접목, 이식 삽입 관련 된 기계적 외상 chondrocyte 생존 능력을 감소에 수술 결과2에 해로운 효과가 있다.

연골 explant 모델 일반적으로 기계적으로 유도 된 세포 죽음을 관절 chondrocytes의 민감성을 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 모델 일반적으로를 사용 하 여 큰 동물에서 explants 로드 조건, 환경 조건 및 셀 취약점3,,45,6, 에 다른 요인의 효과 공부 7,8,9,10,11,12,13,,1415. 그러나, 네이티브 관절의 큰 크기 때문에 이러한 모델 제거 함으로써 네이티브 경계 조건 타협 그대로 관절의 관절 표면에서 플러그의 일반적으로 필요 합니다. 또한, 그들은 일반적으로 세포 상해를 유도 하기 위해 대형 기계 부하의 응용 프로그램을 필요 합니다. 또는, murine 연골 explant 모델 chondrocytes 제자리에 의 기계적인 취약점을 공부에 더 큰 동물 모델을 통해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 특히, 그들의 작은 크기 때문에 이러한 모델 완전히 그대로 관절 연골의 기본 조직의 무결성을 변경 하지 않고 테스트 촉진 한다. 또한, 로드 murine 연골의 발생 작은 접촉 지역에 같은 chondrocyte 사망/부상 작은 부하로 유도 될 수 있다 (< 1 N). 마지막으로, 마우스 게놈은 쉽게 조작, 어떻게 특정 유전자 영향의 기계적 상해 chondrocytes 제자리에 의 민감성을 테스트 가능.

이 원고에 도입 하는 방법의 전반적인 목표는 계량 하 고 시각화에 진짜 시간에서 공간 정도 완전히 그대로 마우스 연골에 뼈에 적용 된 기계 부하 때문 에 원래의 세포 죽음/상해의 explants 에 체 외. 이 방법은 현미경 실장 장치 비슷한 우리가 최근 개발 테스트 플랫폼을 사용 하 여 극히 스테인드 explants의 기계적 테스트 다음 chondrocyte 생존을 손상 없이 마우스 활 액 관절의 조심 해 부 요구 계량 murine 연골 기계적 성질16하. 기계적 테스트 하는 동안 해 부 뼈의 (그대로) 관절 표면의 큰 부분 부하를 적용 한 후 세포 생존 능력의 신속한 분석을 활성화 한 형광 현미경 사진에 표시 됩니다. 비슷한 분석 murine 연골 explants의 표면 세포 생존 능력의 이전, 하지만 로드17의 동시 신청 없이 수행 되었습니다. 우리의 방법의 잠재 애플리케이션으로 감도 감소 시키기 위한 치료 뿐만 아니라 다른 제어 환경 및 기계적 조건, 관절 chondrocytes의 취약점 조사를 비교 연구 기계적 부하를 chondrocytes.

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프로토콜

모든 동물 작업 동물 자원에 로체스터의 대학 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 솔루션

  1. 행 크의 균형 소금 솔루션 준비 (1 X HBSS) 포함 하는 칼슘, 마그네슘, 아무 페 놀 레드. HCl 이나 NaOH의 소량을 추가 하 여 pH 7.4에 조정 합니다.
  2. NaCl 또는 이온된 수를 추가 하 여 303 mOsm osmolarity를 조정 합니다. 버퍼를 사용 하 여 해, 견본 준비 및 기계적 테스트 중.

2. 원심 대 퇴 골과 완벽 하 게 그대로 관절 연골과 근 위 상 완 골의 해

  1. 뒤에 자 궁 경부 전위 공동2 흡입 챔버를 사용 하 여 기관의 지침에 따라 마우스를 안락사 무 균 기술을 통해 따릅니다.
    참고: 8 및 81 주 어떤 긴장의 오래 된과 섹스 사이의 마우스 사용할 수 있습니다.
  2. 해에 대 한 다음과 같은 수술 도구를 사용 하 여: 마이크로-가 위 (절 개를 만들기 위해 사용), 표준 해가 위 (뼈를 절단 사용), # 11와 메스 메스 블레이드 (절단 부드러운 조직에 사용), 보석의 집게 (소프트의 제거에 사용 조직) 및 표준 집게 (부드러운 조직과 피부 필 링에 사용).
  3. 원심 대 퇴 골의 해 에 대 한 아래의 지침을 따르십시오.
    1. 부정사 위치에 마우스를 놓습니다.
    2. 무릎의 앞쪽 부분에 피부에 절 개를 작은 (~ 5 m m)를 확인 합니다.
    3. 무릎 주위 모든 방법으로 절 개를 확장 하 고 다시 무릎 관절과 다리 근육을 노출 피부를 당겨.
    4. 대 퇴 골의 근 위 끝에서 시작 하는 것 사용해 원심 방향을 따라 잘라 메스 블레이드 (#11). 위치 블레이드 quadriceps 근육-힘 줄 단위 사이의 대 퇴 축의 앞쪽 측면입니다. 그리고 과거의 슬 개 골 컷을 확장 하 고 quadriceps 근육-힘 줄 단위 제거, 슬 개 골 힘 줄의 가운데를 잘라서 마무리.
    5. 대 퇴 골의 근 위 끝에서 시작 하는 것 사용해 원심 방향을 따라 잘라 메스 블레이드 (#11). 햄 스트링 근육-힘 줄 단위와 퇴 축의 후부 측면 사이 블레이드를 놓습니다. 일단 컷 접근 무릎 관절, 메스와 대 퇴 골의 원심 condyles에 관절 표면 사이 접촉을 피하고 부드러운 조직을 통해 절단을 시작 합니다. 과거의 무릎 관절 절단 완료.
    6. 다시 당겨 quadriceps와 대 퇴 골을 노출 하는 햄 스트링 근육. 멀리 대 퇴 골의 측면 및 중간 면에 어떤 과잉 근육을 잘라.
    7. 근 위 경골의 후부 측면에서 종 아리 근육을 잘라내어 다리 대 퇴 골의 후부 측면 시각화를 플립.
    8. 무릎 관절 주위 초과 조직을 제거 하 여 대 퇴 골의 근 위 경골의 후부 표면 원심 condyles을 노출 합니다.
    9. 앞쪽 및 후부 십자 인 대 퇴 condyles 떨어져 절단, 메스를 사용 하 여 잘라. 당겨 대 퇴 골에서 경골 및 대 퇴 골에서 더 낮은 다리를 분리 모든 인 대를 잘라.
    10. 측면 쪽에서 뼈 (tibio-대 퇴 관절 위에 8 m m)의 근 위 끝에는 대 퇴 골을 통해 잘라 표준 해가 위를 사용 하 여. 뼈를 절단 후 닦아 떨어져 어떤 보이는 골 수 골 수 세포에서 가능한 오염을 피하기 위하여 뼈의 외부에.
      참고: 옆 측에서 절단 뼈 따라 균열 전파의 위험을 줄여줍니다.
    11. 보석의 집게를 사용 하 여 대 퇴 골에서 부드러운 조직 (즉, 인 대 및 초과 근육)을 둘러싼 제거 하 고 대 퇴 골의 원심 끝에 두 condyles에 연골을 노출. 연골과 집게 사이 접촉을 피하십시오.
  4. 상 완 골의 해 에 대 한 아래의 지침을 따르십시오.
    1. 부정사 위치에 마우스를 놓습니다.
    2. 마이크로-가 위를 사용 하 여 팔꿈치의 후부 측면에서 피부에 절 개 (~ 5 m m)를 확인 하 고 확장 팔꿈치 주위 절 개 폭 팔과 어깨의 근육을 피부를 뒤로 당겨.
    3. 상 완 골의 근 위 끝에서 시작 하는 것 사용해 원심 방향을 따라 잘라 메스 블레이드 (#11). 삼 두 근 근육-힘 줄 단위와 상 완 골의 후부 측면 사이 블레이드를 놓습니다. 상 완 골의 원심 끝으로 컷을 확장 하 고 삼 두 근의 힘 줄을 통해 절단 하 여 마무리.
    4. 그런 다음 다시 당겨 삼 두 근은 상 완 골의 근 위 끝 상 박 골의 머리 노출 될 때까지.
    5. 메스 블레이드 (#11)를 사용 하 여 상 박 골의 머리 주위 결합 조직 관절 표면을 없이 잘라 고 시체에서 사지 (팔과 어깨)를 제거 합니다. 주기적으로 하이드 레이트 HBSS와 상 박 골의 머리의 관절 표면.
    6. 집게를 사용 하 여 및 다음 상 완 골의 원심 끝 주위 결합 조직 절단 팔의 후부 측면에서 척 골의 근 위 끝에서 첫 번째 끊어서 팔에서 상 완 골을 분리 합니다. 상 완 골에 어떤 과잉 조직을 제거 합니다.
    7. 표준 해가 위를 사용 하 여 상 완 골의 후부 측면에서 삼각형 tuberosity 잘라.
  5. HBSS 버퍼를 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 관으로 해 부 specimen(s)를 놓습니다.

3. 라이브 (Calcein 오전) / 죽은 (Propidium 요오드 화물) 프로토콜을 얼룩이 지기

  1. 다음과 같이 calcein 오전을 사용 하 여 얼룩입니다.
    1. Calcein 오전, 4 mg/mL (4.02 m m)의 재고 농도 결과의 50 µ g의 유리병에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 12.5 µ L을 추가 하 여 calcein 오전의 재고 솔루션을 확인 합니다.
    2. HBSS 칼슘 오전 10 µ g/mL (10.05 µ M)의 농도 도달에서 주식 calcein 솔루션 1:400 희석 (예를 들어, 추가 재고 솔루션의 1.25 µ L HBSS의 500 µ L).
    3. 5 희석된 얼룩 솔루션 원심 때때로 튜브의 벽에 붙어 수 있습니다, 염료의 모든 버퍼와 혼합 되도록 2000 x g에서 s. 상쾌한을 제거 하지 마십시오. 적절 한 혼합 되도록 솔루션 소용돌이입니다.
    4. 해 부 표본 희석된 얼룩 솔루션의 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 800 rpm에서 교 반 하면서는 thermomixer에서 30 분 동안 37 ° C에서 견본 품 어. 튜브는 빛에 노출 로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 덮여 있는지 확인 합니다.
    5. Calcein 오전 무료 HBSS 버퍼에는 견본을 전송 합니다. 이 시점에서, 표본은 기계적 테스트를 위한 준비.
  2. Propidium 요오드 화물 (PI) 다음과 같이 솔루션 얼룩을 준비 합니다.
    1. PI PI의 40 µ g/mL (60 µ M)를 도달 하는 HBSS에 구입한 재고 솔루션 (1 mg/mL, 1.5 m m) 1시 25분을 diluting 하 여 솔루션 얼룩을 준비 합니다. 예를 들어 HBSS의 1000 µ L을 재고 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다.
    2. 빛에 노출 로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 커버 솔루션 얼룩 PI를 유지. 기계적 시험 후 즉시 얼룩 솔루션을 사용 하 여 부상된 셀 (섹션 4 참조)을 검출.
      참고: 하나는 PI 얼룩이 더 엄격 하 게는 해의 품질 평가를 로드 하기 전에 수행할 수 있습니다.

4. 기계적 테스트 프로토콜

  1. 대 퇴 후부 condyles 또는 상 박 골의 머리에 관절 표면 유리 (그림 1)에 앉아 그런에 사용자 정의 현미경 실장 기계 테스트 장치의 유리 슬라이드 표본 (대 퇴 골 또는 상 완 골)을 놓습니다.
    참고: 고정 10 m m 긴 나무 주걱 (직경 2 m m =) 평평한 표면에 견본을 안정화 하기 위해 장치에 그것을 배치 하기 전에 cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 상 완 골 의 원심 측에. 기계적 테스트 플랫폼의 자세한 설명에 대 한 보충 파일 1을 참조: 섹션 1.
  2. HBSS와 표본 수 화 및 형광 현미경에 견본 장치 장소.
  3. Calcein 오전 관절 chondrocytes 스테인드 이미지 (여기/방출 파장 = 495/515 nm) 4 X 형광 현미경 부하의 응용 프로그램 (기본) 렌즈를 건조 하기 전에 (나 = 0.13). 이미지 품질을 최적화 하기 위해 인수 설정을 조정 합니다.
  4. 견본은 위에 기계적 로드 관절 연골 커버 유리에 대 한 압축을 적용 합니다.
    1. 정적 로드된 정적 부하 (예를 들어, 0.5 N) 표본 (대 퇴 골 또는 상 완 골) 위에 적용 됩니다. 5 분에 대 한 부하를 누른 다음 그것을 제거 합니다.
    2. 영향, 적용 된 충격 에너지 (예를들면, 1 엠 제이)는 견본에 알려진된 무게 (예, 0.1 N)의 원통형 충돌 (예를 들어, 1 cm) 소정의 높이에서 떨어지고. 충격 후 부하 5 s를 놓습니다.
      참고: 충돌 (mg)와 소정의 높이 (h)의 무게는 다음 수식을 사용 하 여 충격 에너지 (E)로 변환 될 수: E = mgh.
  5. 실 온에서 5 분에 대 한 솔루션 얼룩 PI에서 견본 품 어.
  6. Calcein 오전 관절 chondrocytes 스테인드 이미지와 PI (여기/방출 파장 = 535/617 nm) 형광 현미경 (그림 2).

5. 데이터 분석

  1. 계량 적용된 기계적 부하 처방으로 인해 부상/죽은 세포의 영역.
    1. ImageJ18기계 부하의 적용 전후 인수 관절 표면의 현미경을 엽니다.
    2. 스택으로 이미지를 결합.
    3. 이미지의 해상도에 따라 이미지의 규모를 설정 합니다.
    4. 다각형 도구를 사용 하 여 셀 calcein-네거티브 (녹색 형광의 손실) 및 PI-긍정적인 (빨간 형광의 이득)를 되었다 영역 정의를. 이 세포는 부상 또는 죽은 간주 됩니다.
    5. 측정 도구를 사용 하 여 부상/죽은 셀의 영역을 결정 합니다.

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결과

6 다른 로드 프로토콜 적용 (정적 로드: 0.1 N, 0.5 N과 N 5 분; 및 충격 부하에 대 한 1: 1 엠 제이, 2 엠 4 엠 제이) reproducibly 8 10 주 오래 BALB/c 마우스 (에서 가져온 하는 대 퇴와 상 박 골의 연골에 세포 상해의 정량 지역화 된 영역을 유도 그림 2)입니다. 중요 한 것은, 관절 표면에 chondrocyte 상해의 공간 정도 ImageJ에 신속 하 고 쉽게 측정 했다. 대표 결과 관절 chondrocytes의 기계적인 취약점은 부하 강도 및 충격 강도 의해 영향을 보여줍니다. 특히, 높은 부하 크기 및 높은 충격 강도 크게 화관에 humeri (그림 3) 세포 상해의 공간 정도 악화.

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토론

위에서 설명한 방법 기계적 부하 또는 충격 처방 후 마우스 관절에서 관절 chondrocytes 실용적이 고 부상/죽은 현장에서 시각화를 성공적으로 채택 되었다. 특히, 우리는 두 개의 서로 다른 활 액 관절에서 완전히 그대로 관절 연골 내 chondrocytes의 기계적인 취약점 분석 수 있었다: 무릎 관절 (원심 화관)와 어깨 (humeri). 우리의 대표적인 결과 관절 표면에 세포 상해의 공간 정도 부하 크기와 충격 강도 (그림 3)에 민감하게 의존을 보여준다. 중요 한 것은,이 메서드를 사용 하 여 순수 관련 조건 기계적 부하에 세포질 응답의 조사를 지원합니다. 즉,는 그대로 생리 아래 관절에 관절 연골의 테스트 가능 하 고 supraphysiological 로드 ( 보충 파일 1참조: 2 절).

기준선, 일부 프로토콜 수정에 chondrocy...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 그들의 pH 미터 및 osmometer의 관대 한 사용에 대 한 박사 리처드 Waugh와 루이스 Delgadillo을 감사 하 고 싶습니다. 또한, 저자 안드레아 리 기계 테스트 시스템의 초기 발전에 기여 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 NIH P30 AR069655에 의해 투자 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
칼세인, 오전 Thermo Fisher Scientific C3100MP의 Invitrogen20x50mg , Eugene, OR, USA
Thermo Fisher ScientificP3566mg/mL 용액 in water, 10mL, Eugene, OR, USA
디메틸 설폭사이드(DMSO)Sigma-Aldrich2768551L DMSO, 무수; 99.9%, 세인트루이스, 미주리, 미국
HBSS (칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음) Gibco by Thermo Fisher Scientific14025-0921X, 500mL, Grand Island, NY, USA
깃털 수술용 칼날 (#11)VWR102097-822Hatfield, PA, USA
증기압 오스모미터, VAPROELITechGroup모델 5520Puteaux, France
pH meter Beckman모델 Phi 32 브레아, 캘리포니아, 미국
Eppendorf 써모믹서 에펜도르프 AG 모델 5350독일 함부르크
도립 연구 현미경올림무스모델 IX-81Center Valley, PA, USA
목재 어플리케이터Puritan Medical Products Company, LLC8076"x100, Guilford, ME, USA
1.5 유리 커버슬립Warner Instruments, LLC64-1696#1.5, 0.17mm 두께, 40mm 직경, Hamden, CT, USA
1 전동

참고문헌

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