방법 논문

X 선 Microcomputed 단층 촬영에 따라 옥수수 혈관 번들의 미크론 단위 형질 기법

DOI:

10.3791/58501

⸱

2018년 10월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 옥수수 조직 일반 microcomputed 단층 촬영 스캐닝 적합의 x 선 흡수 명암을 개선 하기 위해 새로운 방법을 제공 합니다. CT 이미지를 바탕으로, 우리 옥수수의 혈관 번들의 미세한 고기를 효과적으로 추출 하는 다른 옥수수 자료에 대 한 이미지 처리 워크플로 집합을 소개 합니다.

초록

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그것은 높은 처리량 이미지 분석 기법에 따라 옥수수 자료의 해 부 구조를 정확 하 게 계량 해야 합니다. 여기, 우리는 자료에 대 한 옥수수 (즉, 줄기, 잎, 그리고 루트) 일반 microcomputed 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 스캔에 적합 '샘플 준비 프로토콜'을 제공 합니다. 옥수수 줄기, 잎, 그리고 뿌리의 고해상도 CT 이미지를 바탕으로, 우리는 혈관 다발의 phenotypic 분석에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: (1) 옥수수 줄기와 잎의 CT 이미지를 바탕으로, 우리를 자동으로 추출 31 특정 이미지 분석 파이프라인 개발 그리고 혈관 번들; 33 phenotypic 특성 (2) 옥수수 루트의 CT 이미지 시리즈를 바탕으로, 우리 metaxylem 선박의 3 차원 (3 차원) 세분화에 대 한 이미지 처리 체계를 설정 2 차원 (2 차원)을 추출 하 고 볼륨, 같은 3 차원 phenotypic 특성 metaxylem 혈관의 표면적 등 옥수수 소재의 혈관 번들의 전통적인 수동 측정에 비해, 제안 된 프로토콜은 크게 효율성과 미크론 규모 phenotypic 정량화의 정확도 향상 시킵니다.

서론

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옥수수 혈관 시스템 루트와 물, 무기물 양분 그리고 유기 물질1을 제공 하기 위한 핵심 교통 경로 형성 하는 잎을 줄기에서 전체 공장을 통해 실행 됩니다. 혈관 시스템의 또 다른 중요 한 기능 옥수수 식물에 대 한 기계적인 지원을 제공 하는 것입니다. 예를 들어 형태, 숫자, 및 뿌리와 줄기에 혈관 번들의 밀접 하 게 관련 있다 옥수수 식물2,3의 숙박 저항. 현재, 혈관 번들의 해 부 구조에 대 한 연구는 줄기, 잎, 또는 특정 부분에의 해 부 구조를 표시 하려면 현미경 및 ultramicroscopic 기술을 주로 활용 다음 측정 고의 이러한 구조 계산 수동 조사 하 여 관심입니다. 의심의 여지가, 대규모 microimages에서 다양 한 미세 구조의 수동 측정 매우 지루한 하 고 비효율적인 일 이며 심각 때문에 주관과 불일치4, microphenotypic 특성의 정밀도 제한 5.

옥수수는 아무 보조 성장 하 고 셀 내용을 근본적으로 이루어져 있다 1 차 분열 조직에 물. 어떤 전처리 없이도 신선한 옥수수 조직 샘플 검사 될 수 있습니다 직접 마이크로 CT 장치;를 사용 하 여 그러나, 검색 결과 아마 가난 하 고 거친. 주된 이유는 다음과 같이 요약 된다: 식물 조직, 원자 번호 및 높은 잡음 이미지;에 낮은 대조의 결과의 (1) 낮은 감쇠 밀도 (2) 신선한 식물 재료 뒤6에서 보고 탈수 일반 검색 환경 중 축소 하는 경향이 있다. 상기 문제 개발 및 옥수수, 밀, 쌀, 그리고 다른 monocotyledons microphenotyping 기술 응용 프로그램에 대 한 주요 제약 되 고 있습니다. 여기, 우리 '샘플 준비 프로토콜' 소개를 옥수수 줄기, 잎, 그리고 뿌리의 샘플을 pretreat. 이 프로토콜을 탈수와 CT 스캔; 동안 식물 재료의 변형 방지 따라서, nondeformation와 공장 샘플의 보존으로 유리 하다. 또한, 고체 요오드에 따라 염색 단계 또한 식물 재료;의 대비를 향상 따라서, 그것은 마이크로-중부의 이미지 품질에 상당한 개선 또한, 우리는 이미지 처리 소프트웨어를, VesselParser, 옥수수 줄기 및 잎의 CT 이미지 처리 라는 개발 했다. 이 소프트웨어는 다른 식물 조직의 2 차원 CT 이미지에 대 한 높은-처리량 및 자동 형질 분석을 수행 하는 이미지 처리 파이프라인의 집합을 통합 합니다. 옥수수 줄기와 잎의 전체 횡단면에 혈관 번들 검색, 추출, 그리고 자동 이미지 처리 방법을 사용 하 여 확인. 결과적으로, 우리 옥수수 잎의 33 미세한 고기 옥수수 줄기의 31 미세한 고기를 얻을. 옥수수 루트의 CT 이미지 시리즈, 우리는 metaxylem 혈관의 3 차원 phenotypic 특색을 취득 하는 이미지 처리 체계를 개발 했다. 이 제도 이미지 수집 및 전통적인 방법에 비해 개조의 효율성에서 우량 하다.

이러한 결과 혈관 번들;의 미세한 형질에 대 한 효과적인 방법을 제공 하는 일반 x 선 마이크로-CT의 영상 특성을 고려 하는 파이프라인을 처리 하는 이미지를 나타냅니다. 이 매우 식물 과학에 있는 CT 기술의 응용 프로그램을 확대 하 고 셀룰러 해상도6,7식물 재료의 자동 형질을 향상 시킵니다.

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프로토콜

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1. 샘플 준비 프로토콜

  1. 샘플링, 줄기, 잎, 수집 하 고 신선한 옥수수 식물에서 루트 샘플 그룹 (각 그룹 4 복제)의 세 가지 유형으로 나눕니다. 다음, 작은 세그먼트 외과 블레이드를 사용 하 여 다음과 같은 방식으로 그들을 잘라: (1) 컷의 중간 세그먼트 줄기 위치인 1-1.5 c m 길이; (2) 잘라 잎 0.5-주요 정 맥;와 수직 방향 따라 길이 3 cm의 최대 폭의 세그먼트 (3) 길이에서 크라운 루트 0.5 cm의 세그먼트를 잘라.
  2. 연방 항공국 고정을 위한 샘플 세그먼트 적어도 3 d는 FAA 솔루션 (90:5:5 v/v/v, 70% 에탄올: 100% 포름알데히드: 100% 아세트산) 담근 다.
  3. 6 연속 에탄올 그라디언트 (즉, 30%, 50%, 70%, 85%, 95%, 100%)에서 탈수 절차를 수행 하 고 각 에탄올 그라데이션 처리 시간 30 분으로 설정.
  4. 식물 재료; 3 차원 프린터를 사용 하 여 제조 하는 해당 샘플 바구니에 배치 다음, 신속 하 게 공동2 중요 한 포인트 건조 시스템의 샘플 셀에 샘플 바구니 전송. 건조 매개 변수를 다음과 같이 설정:
    (1) CO2 : 빠른 속도. 홀더 필러: 100%.
    (주기 2) 충전: CO2 충전 지연 120 s. 교환 속도: 5. 번호 주기: 12.
    (3) 밖으로 가스: 열, 빨리. 속도: 느린, 50 %입니다.
    1. 에 따르면 옥수수 뿌리, 줄기, 잎, 디자인과 3 차원 프린터 (예를 들어, 그림 1)를 사용 하 여 인쇄 샘플 바구니의 형태학 적 차이.
  5. 휘발성 요오드 증기와 식물 재료를 염색 하 고, 다음, 4-5 h에 대 한 광선이 방에 튜브 장소를 고체 요오드의 2 세대 원심 분리기 50 mL 튜브에 (옥수수 뿌리, 줄기, 또는 잎) 말린된 식물 재료를 넣습니다.

2. 마이크로-CT 스캐닝 프로토콜

  1. 원시 CT 데이터를 검색 하려면 다음과 같이 매개 변수를 검사 하는 CT 설정: 40 kV/250 µ A (대 한 줄기와 잎) 또는 34 kV/210 µ A (루트)에 대 한. 다양 한 크기와 사용, 식물 재료의 볼륨에 대 한 범위를 검사 하는 해당 설정 및 이미징 픽셀 크기를 다음과 같이 조정: 2.0 µ m (옥수수 루트에) 대 한, (대 한 옥수수 줄기), 6.77 µ m와 10.0 µ m (옥수수 잎)에 대 한.
  2. 슬라이스 이미지 재구성, 이미지 복구 소프트웨어를 사용 하 여 2k 해상도 (2000 x 2000 픽셀) CT 조각 심상으로 원시 CT 데이터를 변환. 자세한 내용은 NRecon 사용자 설명서 (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf)에서 제공 됩니다.

3. 이미지 분석 프로토콜 옥수수 줄기 또는 잎의 단일 CT 이미지에 대 한

참고: 혈관 번들에 대 한 자동 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 옥수수 줄기와 잎 (그림 2)의 CT 슬라이스 이미지 내에서 혈관 번들의 형질 분석. 소프트웨어 사용 단계는 다음과 같이 설명 되어 있습니다.

  1. 다른 알고리즘 파이프라인을 초기화 하 기관 유형 임명. 메서드 매개 변수 단추를 클릭 하 고 첫 번째 드롭 다운 상자에서 옥수수 줄기 또는 옥수수 잎을 선택 합니다.
  2. 이미지를 가져오려면 데이터 관리 버튼을 클릭 하 고 작업 디렉터리를 설정 하 고이 디렉터리에서 자동으로 모든 조각 이미지 가져오기. 이미지 파이프라인에 단일 또는 다중 슬라이스 이미지를 선택 합니다.
  3. 이미지의 실제 픽셀 크기를 결정 합니다. 메서드 매개 변수 단추를 클릭 하 고 픽셀 크기의 편집 항목에서 이미지의 실제 픽셀 크기를 입력 합니다.
  4. 형질 계산에 대 한 모든 선택한 슬라이스 이미지에 대 한 혈관 뭉치의 phenotypic 특성을 자동으로 추출 하 형질 계산 단추를 클릭 합니다.
  5. TXT 나 CSV 파일 형식으로 결과 출력 하기 위해 통계 분석 단추를 클릭 합니다.

4. 이미지 분석 프로토콜 옥수수 루트의 CT 이미지 시리즈

참고: 옥수수 뿌리의 CT 이미지 시리즈를 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 metaxylem 혈관의 3 차원 구조를 추출 활용 됩니다. 주요 단계는 다음과 같습니다.

  1. (BMP 파일 형식)에서 옥수수 뿌리의 복원된 이미지를 가져올 고 정확한 간격 매개 변수 ([즉, x, y, z] 복의 크기)를 결정 합니다. 재귀 가우스 도구를 사용 하 여 이미지 품질을 개선 하기 위해 이러한 이미지를 매끄럽게.
  2. Metaxylem 혈관의 3 차원 세분화; 임계값 매개 변수를 조정 하 여 실시 이 각 연결 된 metaxylem 선박에 대 한 균일 한 색상 레이블을 생성합니다.
  3. 개선 하 고 대화형으로 사용 하 여 형태학, 비트, metaxylem 선박 및 홍수 채우기 작업을 식별 합니다.
  4. 볼륨 시각화와 표면 혈관 재건을 실시 합니다. 마스크 통계 도구를 사용 하 여 계산 하 고 측정 하는 2 차원 및 3 차원 수준에서 선박의 phenotypic 특성.

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결과

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샘플 준비 프로토콜 일반 마이크로 CT 스캔에 적합 뿐만 아니라 식물 조직의 변형을 방지 하지만 또한 x 선 흡수 대비를 향상 시킵니다. 청소용된 식물 재료는 마이크로-CT 시스템을 사용 하 여 높은-품질 조각 이미지로 스캔 하 고 높은 해상도 2 µ m/픽셀에 도달할 수 있습니다. 그림 4 는 줄기, 잎, 그리고 뿌리의 스캔된 마이크로-CT 이미지 그리고 이미지 대비는 신선한 공장 설비 재료에서 검색 결과 비해 크게 향상. 이러한 CT 슬라이스 이미지에 회색 수준 값에 중요 한 차이점은 혈관 번들, 실질 세포, xylem 혈관, 표 피, 그리고 다른 조직 사이에서 관찰.

혈관 번들에 대 한이 이미징 소프트웨어를 기반으로 전체 줄기 또는 잎의 횡단면 내 혈관 번들의 구조와 배포 기능 수 있습니다 자동으로 분석 ...

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토론

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CT 기술 의학 및 재료 과학의 분야에서의 성공적인 응용 프로그램,이 기술은 점차적으로 도입 되었습니다 식물학 및 유망 기술 도구로 식물 생명과학 연구를 추진 하는 농업 분야에 . 1990 년대 후반에, CT 기술 형태학 상 구조 및 식물 뿌리 시스템의 개발 연구에 처음 사용 되었다. 지난 10 년간, 싱크 로트 론 HRCT 식물 생물학을 위한 강력 하 고, 비파괴 도구가 되고있다 그리고 성공적으로 포도 혈관 시스템8의 조직 구조, 애기 잎9 의 조직 구조를 식별 하는 데 사용 되었습니다. , 10, 그리고 강간11의 씨 구조. 싱크 로트 론 HRCT 통해 훌륭한 진행이 했다 구조 연구와 우 디 식물12,,13<...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (No.31671577), 과학 및 기술 혁신 특별 한 건설 투자 프로그램의 베이징 아카데미의 농업 및 임업 Sciences(KJCX20180423), 연구에 의해 지원 되었다 중국 (2016YFD0300605-01)의 개발 프로그램, 베이징 자연 과학 재단 (5174033), 베이징 박사 후 연구 재단 (2016 ZZ-66), 베이징 아카데미의 농업 및 임업 과학 그랜트 (KJCX20170404) ( JNKYT201604)입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Skyscan 1172 X선 컴퓨터 단층 촬영 시스템Bruker Corporation, BelgiumNACT 스캐닝
CO2 임계점 건조 시스템(Leica CPD300)Leica Corporation, GermanyNA샘플 건조용
에탄올모든NAFAA 고정용
포름알데히드모든NAFAA 고정용
아세트산 acidAnyNAFAA 고정용
수술용 블레이드AnyNA샘플 sgements 절단용
3D 프린터Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USANA옥수수 뿌리, 줄기 및 잎의 샘플 바구니 인쇄용
원심분리기 튜브Corning, USANA뿌리, 줄기 또는 잎 재료
배치 고체 요오드AnyNA샘플 염색용
SkyScan Nrecon 소프트웨어SkyScan NRecon, 버전: 1.6.9.4, Bruker Corporation, BelgiumNA이미지 재구성
VesselParser 소프트웨어 VesselParser, 버전: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture(NERCITA), Beijing, ChinaNA옥수수 줄기 또는 잎의 단일 CT 이미지를 위한 이미지 분석 프로토콜
ScanIPScanIP, 버전 : 7.0; Simpleware, Exeter, UKNA3D 이미지 처리 소프트웨어
라텍스 장갑모든NA
핀셋모든NA
용 용

참고문헌

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