개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Summary

형광 라벨 tangentially 마이그레이션에 대 한 방법을 설명 셀 electroporation, 그리고 마이그레이션 시각화 하기 위해 플랫-마운트 문화에서 레이블이 지정 된 셀 이동의 시간 경과 영상 셀 개발 병아리 광섬유 tectum에 동작 .

Abstract

시간 경과 영상 마이그레이션 셀 동작을 분석 하는 강력한 방법입니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화에 레이블이 지정 된 세포의 움직임을 기록할 수 있습니다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하에 주로 사용 됩니다. 그러나, 슬라이스 문화 방법 접선 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 수직 셀 마이그레이션 분석 하에서 제한 된 정보를 얻을 수 있습니다. 여기, 우리는 시각화 개발 병아리 광섬유 tectum에 접선 셀 마이그레이션 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜을 제시. 셀 라벨 electroporation에서 비켜에서 문화와 후속 플랫-마운트 셀 문화 삽입에 의해의 조합 수평 평면에 마이그레이션 세포 운동의 감지 수 있습니다. 또한, 우리의 방법은 개별 셀 동작 및 장기적으로 세포의 그룹의 집단 행동의 탐지를 촉진 한다. 이 방법은 잠재적으로 형광 표시 된 마이크로-구조, axonal 신장 비 신경 조직의 신경 조직 또는 세포 치환 등의 순차적 변화를 감지에 적용할 수 있습니다.

Introduction

세포 이동의 연구 라이브 이미징의 발전 기법으로 진행 되었습니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화 접시 또는 vivo에서 레이블이 지정 된 셀의 시간적 움직임을 기록할 수 있습니다. 신경 개발 연구에서 세포를 마이그레이션하거나 elongating axons의 형태학 변화 되었습니다 분석 했습니다 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여. 효과적인 이미징에 대 한 형광 셀 라벨 및 조직 준비, 실험 및 분석의 목적에 따라 적당 한 방법을 적용 하는 필수적 이다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션^1,2,3등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하 일반적으로 사용 되었습니다. 조각 문화 시스템은 접선 셀 마이그레이션^4,5, 검색에 사용 하지만 셀 슬라이스 섹션에 수직을 분산 하는 경우에 방향 분석에 적합 하지 않습니다.

광섬유 tectum는 배아 개발 하는 동안 레이디얼 및 접선 셀 마이그레이션에 ....

Protocol

1입니다. 비켜에 Electroporation

1. 높은 농도에 형광 라벨에 대 한 식 플라스 미드 DNA를 준비 합니다. 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 음이온 교환 열을 사용 하 여 알칼리 성 세포의 용 해 방법으로 200ml의 세균성 문화에서 DNA를 분리. 각 4 µ g / µ L의 최종 농도에 pCAGGS-mCherryNuc pCAGGS-EGFP 믹스.
   참고: 내 무료 플라스 미드 DNA 정화 electroporation에 대 한 선호 있을 수 있습니다.
2. 가로 70% 상대 습도에서 38 ° C에 비옥한 계란을 품 어.
3. 2.5 일 후 18 게이지 바늘 20 mL 주사기를 사용 하 여 계란의 지적된 측면에서 배 젖 (달걀 흰 자 위)의 5 mL을 제거 하 고 테이프와 바늘 구멍을 봉인.
4. 곡선가 위 직경에서 2cm 구멍을 열고 stereomicroscope (햄버거와 해밀턴⁹의 단계 17) 아래 태아의 발달 단계를 확인 하는 달걀 껍질의 상단을 잘라. 다시 테이프로 구멍을 봉인.
   참고:이 단계는 E2.5 E3.0 동안 언제 든 지 수행할 수 있습니다. 1.3 및 1.4 단계 상위 셸에 성장 배아와 혈관의 꽉 첨부....

Results

그림 2 녹음의 개시 후 경과 시간 (0, 9, 18, 27 h)에서 플랫-마운트 문화에 시각화 된 표면 접선 마이그레이션을 보여준다. 영화 1 28 h 50 분 동안 10 분 간격의 시간 경과 영화입니다. 프레임은 레이블 없는 공간 (그림 3A) 프레임의 레이블된 왼쪽 모서리에서 마이그레이션 세포에 초점을 맞추고 선택 됩니다. 마이그레이션 세포 (GFP, 영화 1위 왼쪽된 패널)의 질량 움직임 및 그들의 핵 (mCherry 엔 유씨, 오른쪽 상단 패널) 병합 된 영화 (하단 패널, 영화 1) 관찰 될 수 있다. 셀 이동 방향은 모든 방향 (영화

Discussion

위에서 설명한 프로토콜 표면 레이어^6,8셀 마이그레이션 감지 최적화 되어 있습니다. 그것은 이동 electroporation (E4.5에 E5.5)의 타이밍 및 문화의 발병 및 이미징 (E6.0에 E7.0) 그냥 중간 계층 마이그레이션 스트림영화 ( 5)^6,7, 탐지를 위해 적용 가능한.

제시 하는 절차는 셀 라벨 electroporation 비켜에서평면 산 문화 및 시간 경과 confocal 영상 (그림 1)에 의해 구성 됩니다. 우선, 그것은 필수 문화 조건 vivo에서로 일반적으로 성장 하 고 건강 한 조직을 유지 최적화 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	내독소 프리 플라스미드 DNA 정제 키트
20ml 주사기	TERUMO	SS-20ESZ
18 게이지 바늘	TERUMO	NN-1838R
패스트 그린	Wako	061-00031
100x 페니실린 및 스트렙토마이신	Gibco	15140-122
유리 모세관	Narishige	G-1
세포 배양 인서트	Millipore	Millicell CM-ORG
라미닌		SIGMA L2020	배양 인서트
코팅 폴리-L-라이신	펩타이드 연구소	3075	배양 코팅 인서트
유리 바닥 접시	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	배양 배지
F12	Gibco	11765-054	배양 배지
소 태아 혈청	Gibco	12483	배양
배지 병아리 혈청	Gibco	16110082	배양 배지
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical Specialties Collaboration	72-1501
Name	Company<	strong>카탈로그 번호<	strong>Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
마이크로피펫 프로세서	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
겸자형 전극	BEX	LF646P3x3
펄스 발생기	BEX	CUY21EX	electroporator,
형광 입체 현미경	Leica	MZ16F
, 도립 형광 현미경	Olympus	IX81
가스 컨트롤러	Tokken	MIGM/OL-2
온도 컨트롤러	Tokai Hit	MI-IBC
레이저 컨포칼 유닛	올림푸스	FV300